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植物源化合物百里香酚对西瓜枯萎病菌的抑菌机制初探 预览 被引量:5
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作者 张猛 陈健 +1 位作者 薛延丰 石志琦 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期1019-1024,共6页
为了明确植物源化合物百里香酚对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxyporum f.sp.niveum)的抑菌活性及机制,采用室内生化测定方法研究了其对西瓜枯萎病菌菌丝生长量、分生孢子产生及萌发、细胞膜通透性、蛋白质及DNA合成的影响,并通过显微镜观... 为了明确植物源化合物百里香酚对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxyporum f.sp.niveum)的抑菌活性及机制,采用室内生化测定方法研究了其对西瓜枯萎病菌菌丝生长量、分生孢子产生及萌发、细胞膜通透性、蛋白质及DNA合成的影响,并通过显微镜观察菌丝形态的变化.结果表明,百里香酚对菌丝生长量、分生孢子产生和萌发具有较强的抑制作用,其EC50值分别为42.91 mg/L、35.18 mg/L和56.46 mg/L.经百里香酚处理后的菌丝生长缓慢,细弱,分支减少,分生孢子的产生受到抑制;百里香酚浓度为25 mg/L时,能够显著影响菌丝体细胞膜的电导率,电导率随着处理时间的延长上升明显.浓度为12.5 mg/L时,百里香酚对西瓜枯萎病菌菌丝体的蛋白质合成有一定的抑制作用;浓度为100.0 mg/L时,其对菌丝体DNA的合成有明显的抑制作用.说明百里香酚通过改变西瓜枯萎病菌菌丝体细胞膜通透性、抑制菌体内部分蛋白质及DNA的生物合成达到抑菌效果. 展开更多
关键词 西瓜枯萎病菌 百里香酚 抑菌机制
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抗Bt(Cry1B)毒素单链抗体在sf9昆虫细胞中的表达及活性测定 预览 被引量:1
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作者 徐重新 张霄 +4 位作者 张存政 刘媛 谢雅晶 黄鹰 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期985-991,共7页
通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒... 通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒穿梭载体(Bacmid-scFv)侵染sf9昆虫细胞,细胞发生明显病变特征.通过SDS-PAGE、Western blotting和间接竞争性ELISA等方法检测,发现单链抗体在sf9昆虫细胞中表达成功,测得纯化后蛋白浓度为103.000 0 μg/ml,Cry1B毒素对单链抗体的抑制中浓度(IC50)为1.010 0 μg/ml,最低检测线IC10为0.011 3μg/ml,线性检测范围为0.500 0~10.000 0 μg/ml.可溶性scFv对抗原类似物无交叉反应. 展开更多
关键词 Cry1B毒素 单链抗体 真核表达系统 酶联免疫分析
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玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建 预览
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作者 朱子薇 潘丽婷 +4 位作者 周义东 王燕霞 史建荣 洪青 徐剑宏 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期共7页
构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制.将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤... 构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制.将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50 ℃ 高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证.本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA 中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因. 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮 BacillusamyloliquefaciensMQ01 转座子突变 突变体文库
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蜂蜜中聚醚类抗生素的一次性快速检测方法研究 预览 被引量:3
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作者 陈明 龚兰 +1 位作者 陈旺 邹春 《蜜蜂杂志》 2017年第4期8-10,共3页
研究建立了高效液相色谱串联荧光检测器和二极管阵列紫外可见检测器,并配置柱后衍生系统,一次性快速测定蜂蜜样品中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛菌素药物残留。在各聚醚类抗生素浓度5~100(拉沙洛菌素:80)μg/mL范围内,检测... 研究建立了高效液相色谱串联荧光检测器和二极管阵列紫外可见检测器,并配置柱后衍生系统,一次性快速测定蜂蜜样品中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛菌素药物残留。在各聚醚类抗生素浓度5~100(拉沙洛菌素:80)μg/mL范围内,检测峰面积和浓度呈良好线性关系。回收率试验:在空白蜂蜜中添加莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛菌素浓度分别为5、20、60μg/mL时,总体平均回收率为73%~99%,变异系数为0.2%~1.52%。最低检测限为2.5μg/mL。方法简单、快速、准确。 展开更多
关键词 莫能菌素 盐霉素 甲基盐霉素 拉沙洛菌素 柱后衍生 蜂蜜
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单链抗体对Cry1A类毒素的检测方法建立及识别差异初步研究
5
作者 曲婷婷 张霄 +5 位作者 董飒 刘贝贝 李盼 王耘 张存政 刘贤金 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期516-525,共10页
为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(... 为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素。结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination, LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用。本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据。 展开更多
关键词 CRY1AB CRY1AC SCFV DAS-ELISA 分子对接
海藻酸钠微囊化JS25噬菌体的制备、表征及其在食品模拟体系中的释放 预览
6
作者 龙门 周卉 +2 位作者 谢文 廖琪 王冉 《食品科学》 CSCD 北大核心 2018年第12期262-267,共6页
通过海藻酸钠微囊化JS25噬菌体,并对制备的JS25噬菌体微囊粉进行结构表征和稳定性分析,通过构建不同的食品模拟体系分析JS25噬菌体微囊粉的释放规律。结果表明,海藻酸钠和Ca Cl2组成的体系能有效地构建JS25噬菌体微囊粉,通过响应面优化... 通过海藻酸钠微囊化JS25噬菌体,并对制备的JS25噬菌体微囊粉进行结构表征和稳定性分析,通过构建不同的食品模拟体系分析JS25噬菌体微囊粉的释放规律。结果表明,海藻酸钠和Ca Cl2组成的体系能有效地构建JS25噬菌体微囊粉,通过响应面优化试验得到海藻酸钠和Ca Cl2添加量分别为3.72、2.55 g/100 m L时,JS25噬菌体包埋率可达88.38%;该条件下的JS25微囊粉粒径分布在20~90μm之间,且呈正态分布;并且与浮游态噬菌体相比,微囊化的JS25噬菌体稳定性显著增加至35 d(4℃和20℃)。另外,JS25微囊粉在不同食品模拟体系中均可迅速释放,呈现先增加后稳定的趋势,在8 min后释放率均达75%以上。说明该工艺可以有效固定JS25噬菌体,并且对噬菌体效价影响较小。因此,海藻酸钠微囊化JS25噬菌体可以用于JS25噬菌体微囊粉的生产加工。 展开更多
关键词 JS25噬菌体 微囊化 结构表征 释放规律
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磁珠筛选抗Cry2Aa人源化单链抗体及检测方法的建立 预览 被引量:2
7
作者 武爱华 王耘 +2 位作者 刘媛 胡晓丹 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期945-950,共6页
为了建立转基因成分的快速检测方法,利用亲和磁珠偶联Cry2Aa毒素蛋白从人源化噬菌体抗体库Tomlinson I中液相淘选特异性单链抗体(sc Fv)。通过4轮'扩增-吸附-洗脱',从洗脱产物计数板上随机挑取单克隆进行初步鉴定。选取相对结... 为了建立转基因成分的快速检测方法,利用亲和磁珠偶联Cry2Aa毒素蛋白从人源化噬菌体抗体库Tomlinson I中液相淘选特异性单链抗体(sc Fv)。通过4轮'扩增-吸附-洗脱',从洗脱产物计数板上随机挑取单克隆进行初步鉴定。选取相对结合活性最好的阳性克隆建立间接竞争ELISA,确定其检测范围。筛选后第4轮相对产出率较第1轮提高了4.07×106倍;单克隆ELISA鉴定出8个含有完整外源基因片段的阳性克隆,测序后获得3个不同序列的阳性克隆。D5克隆的噬菌体上清对Cry2Aa的检测灵敏度(IC10)为6.632 ng/ml,线性范围为0.016~2.881μg/ml。该克隆对Cry2Aa具有良好的特异性和板内板间重现性。 展开更多
关键词 Cry2Aa毒素 单链抗体 磁珠 间接竞争ELISA
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Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定 预览
8
作者 刘贝贝 张霄 +6 位作者 谢雅晶 焦凌霞 刘媛 张存政 赵岩岩 武爱华 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第16期3130-3139,共10页
【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5... 【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L^-1的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋� 展开更多
关键词 BT Cry1类毒素 共性结构域 原核表达 纯化
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小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟 预览
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作者 张霄 胡晓丹 +6 位作者 仲建锋 武爱华 徐重新 刘媛 张存政 谢雅晶 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第23期4555-4565,共11页
【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测... 【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结 展开更多
关键词 碱性磷酸酯酶 原核表达 配体印迹 同源建模 分子对接 热点残基预测
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含水量、储存条件对储存期小麦中DON、NIV毒素含量变化的影响 预览 被引量:3
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作者 姚振宇 殷宪超 +4 位作者 俞明正 董飞 祭芳 徐剑宏 史建荣 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第12期300-303,共4页
研究含水量分别为11.5%、12.8%、15.7%的小麦在4℃冷库、25℃恒温室、常温库、地下仓库4种环境下储藏0~90d镰刀菌毒素DON、NIV含量的变化情况,并对不同储存环境下小麦含水量变化情况进行分析.结果表明:90d内,3种含水量的小麦在4℃冷库... 研究含水量分别为11.5%、12.8%、15.7%的小麦在4℃冷库、25℃恒温室、常温库、地下仓库4种环境下储藏0~90d镰刀菌毒素DON、NIV含量的变化情况,并对不同储存环境下小麦含水量变化情况进行分析.结果表明:90d内,3种含水量的小麦在4℃冷库和25℃恒温室条件下,DON、NIV毒素均未发生显著变化.储存在常温库和地下仓库2种不可控环境下的3种含水量小麦在60d后DON毒素含量降低,NIV毒素含量未发生显著变化. 展开更多
关键词 小麦 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 雪腐镰刀菌烯醇 储藏 镰刀菌毒素
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基于同源建模与分子对接技术构建抗Bt Cry1类毒素单链抗体定点饱和突变库 被引量:2
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作者 焦凌霞 徐茜茜 +4 位作者 刘媛 张霄 刘贝贝 梁颖 刘贤金 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2016年第3期12-17,共6页
转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本... 转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研究利用基因工程抗体易于定向修饰及Cry毒素具有相似结构的特点,以实验室前期获得的人源化抗苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry1Ac毒素单链抗体为材料,通过同源建模模拟单链抗体及五种Cry1类毒素的三维结构并利用分子对接技术分析单链抗体与Cry1类毒素结合的关键氨基酸位点;在此基础上利用重叠延伸PCR技术对关键氨基酸位点及其邻近位点进行定向改造,以构建定点饱和突变库,为筛选检测多种Cry1类毒素的广谱特异性抗体提供实验材料。 展开更多
关键词 Cry1毒素 单链抗体 同源建模 分子对接 重叠延伸PCR 定点饱和突变
赤霉病菌拮抗菌Bacillus subtilis AF0907抗菌物质研究 预览 被引量:6
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作者 胡晓丹 王建伟 +3 位作者 李孝敬 祭芳 史建荣 徐剑宏 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2015年第3期378-385,共8页
菌株AF0907是从土壤中分离到的1株对小麦赤霉病菌具有显著拮抗作用的枯草芽孢杆菌,该菌株不仅对小麦赤霉病菌具有很好的拮抗活性,对其他多种植物病原菌都具有很好的拮抗效果。为了明确菌株AF0907对赤霉病菌的抑菌机理,本研究首先使用平... 菌株AF0907是从土壤中分离到的1株对小麦赤霉病菌具有显著拮抗作用的枯草芽孢杆菌,该菌株不仅对小麦赤霉病菌具有很好的拮抗活性,对其他多种植物病原菌都具有很好的拮抗效果。为了明确菌株AF0907对赤霉病菌的抑菌机理,本研究首先使用平板对持法对拮抗物质进行定位,结果表明该菌分泌的拮抗物质主要位于细胞上清液中。采用不同饱和度的硫酸铵沉淀细胞上清液,确定了60%的硫酸铵饱和度是沉淀该拮抗物质的最佳条件;分别研究了温度、p H值、蛋白酶K、氯仿对该拮抗物质活性的影响,结果表明该拮抗物质在低温下比较稳定,在60℃以上的高温下,活性迅速降低;在酸性或碱性条件下不稳定;该拮抗物质分别加入蛋白酶K和氯仿作用后拮抗活性分别下降了60.68%、80.07%,因此,初步判断该拮抗物质为蛋白质。利用DEAE-52离子交换柱层析法分离纯化了该拮抗蛋白并进行了SDS-PAGE电泳,结果显示该拮抗蛋白的分子量为48 k Da;利用PPSQ-31A蛋白自动测序仪测定拮抗蛋白N-末端15个氨基酸序列为:His-Glu-Phe-Pro-Thr-Tyr-Lys-His-Met-Tyr-Gln-Val-Met-His-Leu。 展开更多
关键词 小麦赤霉病菌 枯草芽孢杆菌 拮抗菌 拮抗蛋白
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抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用 预览 被引量:1
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作者 徐重新 张存政 +6 位作者 何鑫 张留娟 张霄 仲建锋 刘媛 谢雅晶 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期1166-1172,共7页
对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,... 对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,建立针对Cry1 F毒素的IC-ELISA检测方法。以Cry1 B、Cry1 C、Cry1 Ab、Cry1 Ac作为竞争抑制物,分析sc Fv的特异性,以Cry1 F毒素在玉米中的添加回收试验评价检测方法的实用性。结果显示,从第3轮富集库中筛选到了11株具有Cry1F毒素结合活性的噬菌体sc Fv菌株,经PCR鉴定都含有目的条带,对其中2株(H1、G9)进行测序,证实为人源化的sc Fv。选取G9号阳性噬菌体sc Fv进行可溶性表达,纯化后收集到的sc Fv浓度为256μg/ml。建立的IC-ELISA检测方法检测灵敏度(IC10)为5.99 ng/ml,抑制中浓度(IC50)为0.410μg/ml,线性检测范围(IC20~IC80)为0.107~0.713μg/ml。sc Fv(G9)对Cry1B、Cry1C具有一定结合活性,交叉反应率分别达到了20.92%和15.59%,但不识别Cry1Ab和Cry1Ac,交叉反应率均低于0.1%。添加回收试验结果表明,基于sc Fv(G9)建立的IC-ELISA检测方法稳定性和重复性都比较好。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 Cry1F毒素 单链抗体 酶联免疫分析
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基于磁珠和双抗夹心免疫分析的 Bt Cry1Ac 毒素单链抗体筛选与鉴定 预览
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作者 张留圈 张霄 +5 位作者 刘媛 徐重新 张存政 谢雅晶 寇莉萍 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1802-1810,共9页
【目的】通过设计并优化生物素一亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对CrylAc毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选... 【目的】通过设计并优化生物素一亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对CrylAc毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗CrylAc毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Crylhc的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-CrylAc兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对CrylAc的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的CrylAc蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELIsA鉴定抗CrylAc噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCrylAc-C5、hsCrylAc-D8、hsCrylAc-Cl2、hsCrylAc-A12、hsCrylAc-F9和hsCrylAc-F4。其中,hsCrylAc-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCrylAc-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1mm01·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经HiSTrapHP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCrylAc-A12蛋白分子量约为30kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了CrylAc双抗� 展开更多
关键词 磁珠 Cry1Ac毒素 单链抗体 双抗夹心ELISA
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间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素 预览 被引量:3
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作者 徐重新 杨晶祎 +6 位作者 陆梦晓 仲建峰 张存政 张霄 何鑫 刘媛 刘贤金 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期44-48,共5页
利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制... 利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL^-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL^-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL^-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL^-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。 展开更多
关键词 Cry1C毒素 多克隆抗体 稻米 时间分辨荧光免疫分析
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抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备 预览 被引量:3
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作者 祭芳 曹欢 +1 位作者 徐剑宏 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期417-422,共6页
为建立快速、简单、灵敏、有效的玉米赤霉烯酮的检测方法,将玉米赤霉烯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应,合成半抗原ZEN-oxime,通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备玉米赤霉烯酮人工抗原,以人工抗原ZEN-BSA免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与... 为建立快速、简单、灵敏、有效的玉米赤霉烯酮的检测方法,将玉米赤霉烯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应,合成半抗原ZEN-oxime,通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备玉米赤霉烯酮人工抗原,以人工抗原ZEN-BSA免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP 2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌抗玉米赤霉烯酮抗体的单克隆细胞株3D10.3D10的抗体类型及亚类均为IgM,其轻链为Kappa链.制备的单克隆抗体腹水通过间接酶联免疫吸附测定,效价在1×10 -6以上.该单克隆抗体对玉米赤霉烯酮的IC50为225 ng/ml,除与玉米赤霉烯酮结构类似物有一定的交叉反应外,与其他参试真菌毒素均无交叉反应.所制备的单克隆抗体可用于玉米赤霉烯酮毒素初筛和定性检测. 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮 单克隆抗体 酶联免疫吸附法
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降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性 预览 被引量:8
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作者 徐剑宏 潘艳梅 +3 位作者 胡晓丹 祭芳 殷宪超 史建荣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期2240-2248,共9页
【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)降解菌Devosia sp.DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性,掌握DDS-1降解3-AC-DON到3-酮基-DON特性,为该酶的开发应用奠定理论基础。【方法】LG培养基培养DON毒素降解菌Devosia sp.... 【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)降解菌Devosia sp.DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性,掌握DDS-1降解3-AC-DON到3-酮基-DON特性,为该酶的开发应用奠定理论基础。【方法】LG培养基培养DON毒素降解菌Devosia sp.DDS-1后,用PBS离心洗涤菌体后采用超声波破碎,用硫酸铵沉淀菌体破碎液获得粗酶液;然后在不同的酶反应体系中检测3-AC-DON氧化酶的酶活性。【结果】降解菌DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为:pH 7.0、25℃、培养36 h;该酶酶反应的最适温度为35℃,最适反应pH为7.0;该酶在20—40℃,pH 5.0—9.0的范围内能保持80%以上的酶活性;大多数金属离子在浓度为0.2—2 mmol.L-1对3-AC-DON氧化酶有促进作用;乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶活性有抑制作用;酶的定域试验结果显示该酶为胞内酶;DDS-1产生的粗酶液能很好地降解小麦中的DON、3-AC-DON毒素。【结论】Devosia sp.DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究表明,DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶具有较好的温度和酸碱稳定性,该酶反应需要金属离子作为辅因子。 展开更多
关键词 3-AC-DON 降解 德沃斯氏菌 酶活性
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人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定 预览 被引量:5
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作者 徐重新 张存政 +3 位作者 张霄 刘媛 黄鹰 刘贤金 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期47-52,共6页
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性... 利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5~5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。 展开更多
关键词 Cry1B毒素蛋白 单链抗体 可溶性表达 抗原结合活性
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