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ICC-qPCR病毒灭活验证方法的建立及其应用
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作者 魏慧慧 段晓杰 +3 位作者 张羽 王玉梅 刘万卉 徐丽明 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期398-405,共8页
目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷... 目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷病毒灭活工艺的有效性。方法:通过制备指示病毒(伪狂犬病毒,PRV)质粒DNA作为定量标准品,用PRV特异性引物建立定量PCR方法;再用PRV病毒侵染宿主细胞,同时用热灭活PRV作为对照,确定PRV活病毒全部进入宿主细胞但不扩增的最佳样本收获时间,通过检测细胞中活病毒,建立ICC-qPCR活病毒检测方法;确立CPE法测定滴度与ICC-qPCR法检测DNA拷贝数之间的线性关系。最后,模拟临床使用的最坏情况对一次性电生理导管进行含指示病毒(PRV)生物污染物负载,模拟环氧乙烷病毒灭活工艺,通过ICC-qPCR和CPE法验证病毒灭活工艺的有效性。结果:本研究中建立的ICC-qPCR方法的标准曲线线性关系r2>0.99;定量下限为104 copies·μL-1,约相当于2 logs·mL-1,检测下限为103copies·μL-1,约相当于-1 logs·mL-1;特异性结果表明只能检测到PRV的扩增曲线,无非特异性扩增;重复性试验的RSD<5%。确定ICC-qPCR方法中PRV最佳收获时间为宿主细胞染毒后1~2 h。ICC-qPCR检测拷贝数与病毒滴度间具有良好的线性关系(r2>0.99)。ICC-qPCR法病毒灭活工艺验证结果表明:经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低>9.0 logs;阴性对照组(负载不含PRV生物污染物)和空白导管样品均未检出病毒DNA。CPE法的病毒滴定结果表明,经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低≥8.5 logs·mL-1;阴性对照组和空白导管样品均未检出PRV。结论:本研究建立的ICC-qPCR方法应用于PRV病毒灭活验证,可以有效检测活病毒,比传统CPE法(-0.5 logs·mL-1)灵敏度高。将此方法应用于复用电生理导管的环氧乙烷病毒灭活工艺验证,同时与CPE法进行比较,验证了IC 展开更多
关键词 伪狂犬病毒(PRV) 病毒灭活验证 细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(ICC-qPCR) 细胞病变效应(CPE) 病毒滴度 DNA拷贝数 复用电生理导管
利用杆状病毒表达系统表达PRV/gE蛋白及间接免疫荧光抗体(IDF)检测方法的建立
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作者 朱和超 梁婉 +5 位作者 范桂芳 彭忠 华琳 汤细彪 陈焕春 吴斌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1428-1434,共7页
为了建立高效灵敏的伪狂犬病病毒(PRV) gE蛋白的间接免疫荧光抗体诊断方法,本研究将PRV/HN/SMX/2012毒株gE蛋白的自身信号肽及胞外域片段克隆到pFastBacHT B载体上,构建重组质粒pFastBacHTB-gE,并转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经... 为了建立高效灵敏的伪狂犬病病毒(PRV) gE蛋白的间接免疫荧光抗体诊断方法,本研究将PRV/HN/SMX/2012毒株gE蛋白的自身信号肽及胞外域片段克隆到pFastBacHT B载体上,构建重组质粒pFastBacHTB-gE,并转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过3次蓝白斑筛选获得含有gE基因的重组杆粒rBacmid-gE。随后,将该杆粒转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rAcMNPV-gE。经Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)进行鉴定分析,发现重组gE蛋白在sf9细胞中表达。利用该sf9细胞建立检测血清中gE抗体的间接免疫荧光抗体(IDF)方法,通过反应条件的优化发现,将血清和羊抗猪FITC-IgG分别进行1∶40和1∶2 000稀释时所建立的方法能针对血清中gE抗体产生较强的特异性荧光;通过与商业化的ELISA检测gI/gE试剂盒(IDEXX)比较,所建立的检测方法与商业化试剂盒的总符合率为93.18%(164/176),阳性结果符合率93.75%(120/128),阴性结果符合率91.67%(44/48),2种方法存在很强的一致性(Kappa=0.832,CI=95%);-20℃条件下保存2个月的稳定性和重复性良好。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) GE基因 杆状病毒Bac to Bac表达系统 间接免疫荧光抗体法(IDF)
神经肽S及其受体对伪狂犬病病毒感染的体外作用研究 预览
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作者 蔡紫峰 唐梦瑶 +3 位作者 黄辉鹏 陈吉龙 祁保民 杨桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第8期2446-2454,共9页
为了解神经肽S(NPS)及其受体(NPSR)在伪狂犬病病毒(PRV)感染过程中的作用,本试验采用细胞培养、RT-PCR、实时荧光定量PCR及shRNA技术研究NPS和NPSR在PRV体外感染过程中的表达变化,以及NPS和NPSR对病毒基因和相关细胞因子的变化。RT-PCR... 为了解神经肽S(NPS)及其受体(NPSR)在伪狂犬病病毒(PRV)感染过程中的作用,本试验采用细胞培养、RT-PCR、实时荧光定量PCR及shRNA技术研究NPS和NPSR在PRV体外感染过程中的表达变化,以及NPS和NPSR对病毒基因和相关细胞因子的变化。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示,PRV感染培养的小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3细胞)后12和18 h,NPS和NPSR mRNA的表达水平极显著上升(P<0.01);通过shRNA技术稳定干扰3T3细胞中NPSR表达后,PRV gE基因的表达极显著下调(P<0.01);添加外源性NPS可显著增强PRV感染的3T3细胞PRV gE基因及细胞因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平(P<0.05);添加NPSR抑制剂后,则极显著抑制细胞中PRV gE基因和细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平(P<0.01),该作用效果与NPS的作用效果相反。上述结果表明,降低NPSR的表达能有效抑制PRV在3T3细胞上的复制,说明NPSR是PRV有效感染3T3细胞所必需的重要因子;外源性NPS可通过调节炎症细胞因子的表达而加剧PRV感染诱导的炎症反应。本研究结果为深入探索NPS和NPSR在PRV感染动物体内的调节作用奠定了基础。 展开更多
关键词 神经肽S(NPS) NPSR 伪狂犬病病毒(PRV) 3T3细胞
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两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析 预览
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作者 李翔 郭振华 +3 位作者 阮海宇 乔松林 张以芳 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期881-890,共10页
为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。... 为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID50法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36h病毒滴度分别可达10^8.35和10^6.63 TCID50/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD50分别为10^2.13及10^3.25 TCID50。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 分离鉴定 噬斑纯化 感染试验 序列分析
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干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响 预览
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作者 张爽 樊爽爽 +7 位作者 常雯茹 丁光绪 郭瑞珍 段利芳 杜永坤 褚贝贝 杨国宇 王江 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期1253-1262,共10页
试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,... 试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。 展开更多
关键词 干扰素调节因子3 (IRF3) 伪狂犬病病毒(PRV) CRISPR/Cas9
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山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离鉴定及其gE基因遗传变异分析 被引量:1
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作者 古金元 马梓承 +4 位作者 彭涛 刘照虎 孟凡亮 王玉超 刘思当 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期21-24,30共5页
自2011年下半年以来全国多个省份使用Bartha-K61疫苗(gE/gI双缺失)免疫的猪场陆续出现了母猪繁殖障碍、仔猪神经症状及死亡、伪狂犬gE抗体阴性猪群突然转阳的问题。同时有的猪场内出现犬、猫、鼠等死亡的现象,经检测都是由变异伪狂犬病... 自2011年下半年以来全国多个省份使用Bartha-K61疫苗(gE/gI双缺失)免疫的猪场陆续出现了母猪繁殖障碍、仔猪神经症状及死亡、伪狂犬gE抗体阴性猪群突然转阳的问题。同时有的猪场内出现犬、猫、鼠等死亡的现象,经检测都是由变异伪狂犬病病毒(vPRV)引起。为了解山东省猪伪狂犬病病毒(PRV)近期流行特征,本试验对2017年上半年来自山东省不同地区的12份伪狂犬疑似病料进行了PRV的分离鉴定,并对分离株的gE基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果表明,共分离到9株PRV,其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.5%~99.4%和97.2%~99.1%,与参考毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.5%~99.8%和96.8%~99.2%,并且9株分离株与国内报道的PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。gE基因的遗传进化树分析表明,本试验中9株分离株相互之间遗传距离较近,与国内PRV变异株处在同一分支,而与欧美毒株遗传距离较远。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 变异毒株 GE基因 遗传变异分析
山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离鉴定及TK基因遗传变异分析 预览
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作者 古金元 刘照虎 +5 位作者 马梓承 李焱 孟凡亮 王宏宇 肖一红 刘思当 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期69-74,共6页
为了解当前山东省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行特点,本研究对2018年来自山东省不同地区的10份伪狂犬疑似病料进行PRV的分离鉴定,并对分离株的TK基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果表明,共分离到7株PRV,其TK基因核... 为了解当前山东省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行特点,本研究对2018年来自山东省不同地区的10份伪狂犬疑似病料进行PRV的分离鉴定,并对分离株的TK基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果表明,共分离到7株PRV,其TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.1%~99.8%和98.7%~99.4%,与参考毒株TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.8%~99.9%和97.2%~99.7%,而且7株分离株与国内报道的PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。对TK基因的核苷酸序列分析发现,与欧美参考株相比,分离株和国内变异株在其碱基第644-645位由AC突变为GT,导致其氨基酸第215位由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)。TK基因的遗传进化树分析结果表明,本研究中7株分离株分别与国内之前报道的JS-2012、HeN1、TJ以及ZMD2012等变异株位于两个相对独立的分支上,亲缘关系较近,而都与NIA3、Becker等欧美毒株以及疫苗株Kaplan(Bartha-K61株)的遗传距离较远。结果表明,本研究所得7株分离株均应属于PRV变异毒株。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 变异毒株 TK基因 遗传变异分析
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猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别 预览
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作者 姜子义 李碧 +6 位作者 蔡瑶 颜久淇 龚双燕 樊毅 黄剑波 朱玲 徐志文 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1307-1311,共5页
为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对gE、gB和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬... 为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对gE、gB和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。 展开更多
关键词 PRV 检测 多重PCR 疫苗株 变异株
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伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究 预览
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作者 程晓霞 车勇良 +6 位作者 王劭 肖世峰 朱小丽 陈仕龙 林锋强 陈少莺 周伦江 《福建农业学报》 北大核心 2018年第4期337-340,共4页
为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护... 为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) FA株 FB株 Bartha-K61株 FJ2012株 抗原相关性 免疫保护
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伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析 预览
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作者 庞旋飞 练斯南 +4 位作者 伍建敏 万曾培 王征帆 李中圣 白挨泉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第12期3524-3534,共11页
为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对... 为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) FS-2015株 GB基因 GE基因 序列分析
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伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立 预览 被引量:1
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作者 兰德松 顾贵波 侯振中 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第7期1804-1812,共9页
为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方... 为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 野毒株 gE基因缺失疫苗株 TaqMan实时荧光定量PCR 鉴别
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猪伪狂犬病毒引起PK-15细胞自噬的研究 预览
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作者 许长萌 王志建 +2 位作者 王咪 刘倩玉 王先炜 《南京农业大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期701-707,共7页
[目的]研究猪伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾传代细胞系(PK-15)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬在PRV感染复制过程中的作用。[方法]采用Western blot、透射电子显微镜(TEM)、激光共聚焦、siRNA转染等方法研究了PK-15细胞感染PRV后的细胞自噬... [目的]研究猪伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾传代细胞系(PK-15)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬在PRV感染复制过程中的作用。[方法]采用Western blot、透射电子显微镜(TEM)、激光共聚焦、siRNA转染等方法研究了PK-15细胞感染PRV后的细胞自噬。利用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分析自噬对病毒复制的影响,再通过沉默自噬相关基因Beclin-1,进一步观察自噬对PRV复制的影响。[结果]PRV感染PK-15细胞后,LC3-Ⅰ显著转化为LC3-Ⅱ,PK-15细胞内自噬小体的数量明显增加。PRV感染增加了LC3阳性斑点的细胞数。同时,变异毒株PRV ZJ01与传统毒株PRV LA诱导的自噬存在差异。自噬的药理学变化试验和siRNA转染结果还显示自噬能够促进PRV的复制。[结论]PRV感染PK-15细胞可以诱导自噬并有利于病毒的复制。 展开更多
关键词 自噬 猪伪狂犬病毒(PRV) LC3 自噬流 复制 BECLIN-1
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伪狂犬病毒UL54蛋白与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性
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作者 杨珊珊 白娟 +2 位作者 吕林 王先炜 姜平 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期379-385,共7页
研究伪狂犬病毒UL54蛋白对I型干扰素表达的作用及机制,为阐明伪狂犬病毒致病机制提供基础。构建表达UL54的真核质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测UL54对IFN-β及其信号通路分子IRF3和NF-κB启动子活性的影响,并测定UL54对RIGI、... 研究伪狂犬病毒UL54蛋白对I型干扰素表达的作用及机制,为阐明伪狂犬病毒致病机制提供基础。构建表达UL54的真核质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测UL54对IFN-β及其信号通路分子IRF3和NF-κB启动子活性的影响,并测定UL54对RIGI、TBK1、IRF3和IKKε诱导IFN-β表达的影响;免疫共沉淀方法检测UL54与IRF3的相互作用。构建UL54截短基因表达载体,用双荧光素酶报告基因检测系统和ELISA方法检测UL54截短基因对IFN-β启动子活性的影响。构建了pCDH-UL54和8个UL54截短基因真核表达载体。UL54显著抑制IFN-β和IRF3启动子活性,对RIGI、TBK1、IRF3、IKKε介导的IFN-β有抑制作用,免疫共沉淀方法检测证明其与IRF3存在互作。UL54的1-146aa、74-361aa和84-361aa截短体仍抑制IFN-β启动子活性,但第94aa后的其他截短体基因均丧失该抑制作用。PRV UL54通过与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性,UL54第84-94位氨基酸是其抑制IFN-β表达的关键功能区域。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒(PRV) UL54蛋白 干扰素 IFN-Β 信号通路
猪伪狂犬病病毒天津变异株R13139对猪的致病性研究 预览
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作者 任卫科 张莉 +6 位作者 李秀丽 池晶晶 田向学 李富强 董志民 鄢明华 仇华吉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第9期2620-2627,共8页
为了解猪伪狂犬病病毒(PRV)变异株R13139株对猪的致病性情况,本试验将PRV R13139株和PRV经典强毒株SC株均以10 6 TCID 50剂量经滴鼻途径接种6和9周龄健康仔猪各3头,空白对照组鼻腔接种生理盐水,通过攻毒后两个年龄段猪的临床症状表现、... 为了解猪伪狂犬病病毒(PRV)变异株R13139株对猪的致病性情况,本试验将PRV R13139株和PRV经典强毒株SC株均以10 6 TCID 50剂量经滴鼻途径接种6和9周龄健康仔猪各3头,空白对照组鼻腔接种生理盐水,通过攻毒后两个年龄段猪的临床症状表现、眼观病例变化、显微病理变化、抗体产生情况及病毒在体内部分情况评定两毒株对猪的致病力差异。结果显示,SC株对6和9周龄猪的致死率分别为66.7%(2/3)和100.0%(3/3),而R13139株对6和9周龄猪的致死率分别为33.3%(1/3)和66.7%(2/3),表明R13139株对猪的致死性弱于SC株,但R13139株引起两个年龄段猪发病时间比SC株早,同时间段的体温升高幅度更高,神经发症状更严重;眼观病理变化发现,R13139株引起的发病猪肝脏坏死现象比SC株更明显,而心脏、肺脏、脾脏、膀胱和脑的病理变化差异不明显;显微病理结果显示,R13139株对病猪的扁桃体、肺脏、肝脏和三叉神经节等组织造成的病理损伤明显强于SC株;PCR结果显示,R13139株在濒死猪扁桃体、脾脏、肺脏、三叉神经节和淋巴节(腹股沟、肠系膜和颌下)等组织脏器中分布比SC株更广泛;应用ELISA检测攻毒猪抗体发现,R13139株诱导PRV-gB抗体产生的时间比SC株早1 d。本研究结果可为揭示中国伪狂犬病重新流行的原因及进一步开展防控技术研究提供科学依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 变异株 致病性
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伪狂犬病毒(PRV)GZ-JS2017株的分离鉴定及主要毒力基因分子特征分析 被引量:2
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作者 徐国 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 黄涛 叶百川 张爱琼 何小莉 咸文 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期209-216,共8页
为查明贵州省遵义地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测... 为查明贵州省遵义地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测序及生物信息学分析。结果显示:PCR检测可扩增出PRV特异性核酸阳性条带,接种Vero细胞后可见明显CPE现象,在透射电子显微镜下可见囊泡中呈圆形、160nm左右的成熟病毒粒子,胞核中可见病毒包涵体和实心、空心2种无囊膜病毒粒子;接种健康猪可引起神经症状,最后麻痹死亡;通过生物信息学分析显示该毒株的gE、gC、gD及TK基因序列均与参考毒株中湖北HNX株和河南HN1201株相对应的核苷酸同源性最高,且在gE基因的48位和496位都有1个天冬氨酸(Asp)的插入;根据gE、gC、gD及TK基因序列的遗传进化树结果显示本次分离毒株与2011年以后所分离鉴定的变异毒株属同一分支。说明本试验成功分离鉴定一株猪伪狂犬病病毒变异毒株,以期为贵州省猪伪狂犬病病毒的流行及变异提供一些参考。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 分离鉴定 gE、gC、gD及TK基因 分子特征
Isolation and Identification of Sheep Pseudorabies Virus 预览
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作者 Wei feng Zhang Wentong +4 位作者 Zhang Peipei Wang Jinliang Li Feng Liu Jishan Shen Zhiqiang 《动物与饲料科学:英文版》 2018年第2期120-122,132共4页
关键词 绵羊 鉴定 病毒 病原体 山东省 神经病 PCR PRV
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板层人工角膜辐照法病毒灭活验证方法的建立及灭活效果验证 预览 被引量:1
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作者 王剑锋 英志芳 +1 位作者 徐康维 李长贵 《微生物学免疫学进展》 2018年第4期40-43,共4页
目的建立板层人工角膜钴-60照射病毒灭活验证方法,用该方法对脂包膜病毒灭活效果进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)为指示病毒,将干燥的板层人工角膜浸泡在高滴度病毒液中,在2~8℃浸泡5 h,经剪碎、研磨等步骤后4℃... 目的建立板层人工角膜钴-60照射病毒灭活验证方法,用该方法对脂包膜病毒灭活效果进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)为指示病毒,将干燥的板层人工角膜浸泡在高滴度病毒液中,在2~8℃浸泡5 h,经剪碎、研磨等步骤后4℃放置12 h,确立角膜吸附和释放病毒的条件。之后,将吸附病毒并呈干燥状态的角膜以0、5、10、15、20、25 k Gy辐照剂量进行钴-60辐照,以确立的条件释放病毒并进行滴定,考察灭活效果。结果板层角膜在2~8℃浸泡5 h可吸附足量病毒;病毒滴度可达到4 lg值以上,满足病毒灭活验证的要求。样品经25 k Gy剂量钴-60照射后灭活PRV为2.75~3.25 lg TCID50/100μL,灭活后的样品在敏感细胞上盲传3代均未出现细胞病变。结论成功建立了板层人工角膜病毒灭活验证的方法,并验证采用钴-60辐照法对PRV有较好的灭活效果。 展开更多
关键词 板层人工角膜 伪狂犬病毒 辐照法 病毒灭活 验证试验
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表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其生物学特性分析 预览 被引量:1
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作者 韩爽 陈晓春 +4 位作者 邓永 吴华伟 曹明慧 李俊平 夏业才 《中国兽药杂志》 2018年第5期29-37,共9页
以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,通过同源重组构建了表达猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建... 以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,通过同源重组构建了表达猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建正确,并能成功表达E2蛋白。同时,对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行了研究,结果显示第5、10、15、20代重组病毒经PCR均能扩增出与原代重组病毒相同大小的约为3469 bp含猪瘟病毒E2基因的重组片段;第20代重组病毒感染细胞孔中出现明显的针对E2蛋白的荧光,表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传。一步生长曲线测定结果表明,与野毒PRV(SX株)、亲本毒rPRV-BE相比,重组病毒rPRV-CSFV PE2SC前期增殖速度较快,病毒滴度到达峰值的时间早,峰值病毒滴度低于野毒,与亲本毒相当,最高病毒滴度依次为106.7TCID50/mL、108.0TCID50/mL、107.0TCID50/mL。结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,为进一步对其免疫效果的评价以及PRV基因缺失重组疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 猪瘟病毒 基因缺失 同源重组 生物学特性
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一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定 预览 被引量:4
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作者 庞旋飞 练斯南 +2 位作者 李中圣 万曾培 白挨泉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第1期196-205,共10页
为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非... 为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero),进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID50测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID50为10-7.5/0.1mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 分离鉴定 序列分析 GC基因 TK基因 遗传变异
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Subculturing cells have no effect on CRISPR/Cas9-mediated cleavage of UL30 gene in pseudorabies virus 预览
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作者 Lin-zhu Ren Zhi-yuan Peng +7 位作者 Ting Ouyang Xiao-hui Liu Xin-rong Chen Li Ye Jun-wen Fan Hong-sheng Ouyang Da-xin Pang Jie-ying Bai 《动物模型与实验医学(英文)》 2018年第1期74-77,共4页
CRISPR/Cas9-mediated genome editing can inhibit virus infection by targeting the conserved regions of the viral genomic DNA.Unexpectedly,we found previously that pseudorabies virus(PRV)could escape from CRISPR/Cas9-me... CRISPR/Cas9-mediated genome editing can inhibit virus infection by targeting the conserved regions of the viral genomic DNA.Unexpectedly,we found previously that pseudorabies virus(PRV)could escape from CRISPR/Cas9-mediated inhibition.In order to elucidate whether the escape of PRV from Cas9-mediated inhibition was due to cell deficiencies,such as genetic instability of sgRNA or Cas9 protein,the positive cells were passaged ten times,and PRV infection in the sgRNA-expressing cells was evaluated in the present study.The results showed that subculturing cells has no effect on Cas9-mediated cleavage of PRV.Different passages of PX459-PRV cells can stably express sgRNA to facilitate Cas9/sgRNA cleavage on the UL30 gene of PRV,resulting in a pronounced inhibition of PRV infection.Studies to elucidate the mechanism of PRV escape are currently in progress. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 PSEUDORABIES virus(PRV) single-guide RNA(sgRNA) UL30 protein
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