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刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用
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作者 闫爱霞 邹洋 +5 位作者 黄敏君 李晶晶 李威 田小军 贾永根 谷俊朝 《中国热带医学》 CAS 2019年第7期634-637,共4页
目的原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAG... 目的原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示:TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 弓形虫前纤维蛋白 多克隆抗体 内参抗体
双抗夹心ELISA快速检测冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a
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作者 王怡雯 张帅 +4 位作者 张红星 齐颖颖 谢远红 刘慧 鲁舟 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第2期230-235,共6页
为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1... 为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1∶10.24×104,抗体纯度为96%,免疫球蛋白亚型为IgG2a。用此单克隆抗体作为检测抗体,多克隆抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心ELISA体系,检测限为1 000 CFU/g。用此体系检测宋内志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌及阪崎肠杆菌,均无交叉反应。本研究可为冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a的检测提供一种特异性强,准确度高的ELISA检测方法。 展开更多
关键词 福氏志贺氏菌2a 双抗夹心ELISA 单克隆抗体 多克隆抗体
小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体的制备及鉴别 预览
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作者 吴国娣 蒋煊 +3 位作者 徐福远 吴岚岚 陈佳妮 傅红兴 《生物化工》 2019年第3期67-69,共3页
目的:制备得到小鼠抗家兔胰岛细胞的多克隆抗体。方法:选择雄性新西兰大白兔作为胰岛供体,采用胆总管灌注胶原酶的方法进行胰岛细胞团的分离,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂超声乳化后,选择雌性Balb/c小鼠进... 目的:制备得到小鼠抗家兔胰岛细胞的多克隆抗体。方法:选择雄性新西兰大白兔作为胰岛供体,采用胆总管灌注胶原酶的方法进行胰岛细胞团的分离,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂超声乳化后,选择雌性Balb/c小鼠进行多次免疫接种,收集含抗体的小鼠血清,进行家兔胰腺组织的免疫组化实验,观察阳性染色情况。结果:通过家兔胰腺组织HE染色和免疫组化染色,可明显观察到胰岛部位呈阳性染色,确认小鼠血清中存在抗家兔胰岛细胞多克隆抗体。结论:通过本方法可制得小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体。 展开更多
关键词 抗胰岛细胞抗体 多克隆抗体 免疫组化 胰岛分离纯化
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牛对氧磷酶-1蛋白多克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立
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作者 赵畅 张江 +4 位作者 范子玲 白云龙 孙书函 宋玉曦 夏成 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第10期1126-1130,1137共6页
目的制备牛对氧磷酶-1(paraoxonase-1,PON-1)蛋白多克隆抗体,并建立PON-1的双抗夹心ELISA检测方法。方法将重组牛PON-1蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,经AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。以获得的多克隆抗体为捕获抗体,牛PON-1单克隆抗体为检... 目的制备牛对氧磷酶-1(paraoxonase-1,PON-1)蛋白多克隆抗体,并建立PON-1的双抗夹心ELISA检测方法。方法将重组牛PON-1蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,经AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。以获得的多克隆抗体为捕获抗体,牛PON-1单克隆抗体为检测抗体,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,构建牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测法,并对多克隆抗体(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800)及单克隆抗体浓度(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL)、包被条件(37℃孵育2 h、4℃孵育过夜)、封闭液(1%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、0.5 mol/L氯化铵)、封闭条件(37℃2 h、37℃4 h、4℃过夜)进行优化,同时验证方法的线性及准确度。采用该方法及市售试剂盒同时检测酮病组及对照组奶牛血清中的PON-1含量。结果建立的双抗夹心ELISA法最适检测条件为:单克隆抗体浓度为3.2 mg/mL,多克隆抗体工作浓度为1∶800稀释,封闭液为5%脱脂奶粉,包被及封闭条件均为4℃过夜。牛PON-1蛋白标准品浓度在90~3125 ng/mL浓度范围内,与A450值呈良好的线性关系,标准曲线方程为y=0.6186 x-0.7536,R2=0.9813;5份样品检测结果均值为764.21 ng/mL,回收率为97.97%。市售试剂盒和本实验建立方法检测酮病组奶牛体内PON-1含量均显著低于对照组(P<0.001)。结论成功获得了抗牛PON-1蛋白的多克隆抗体,并建立了牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,且该方法具有良好的线性及准确度。 展开更多
关键词 对氧磷酶-1蛋白 多克隆抗体 双抗夹心ELISA法
人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定
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作者 王石磊 靳鑫 +4 位作者 魏杰 张祥 阳媛 牛司强 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期555-560,共6页
目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后... 目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的 rhNGAL 抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G 亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争 ELISA 法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE 分析纯度;最后运用 Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度 NGAL 重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得 6 株高效价单克隆抗体;其中,25 号单抗为 IgG1 亚型,余者均属 IgG2a 亚型,且 19、35 号单抗的亲和常数分别为 3.06×10^9、2.14×10^9。SDS-PAGE 分析表明纯度均大于 90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论:本研究利用密码子优化技术高效表达制备了 NGAL 重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为 NGAL 的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。 展开更多
关键词 密码子优化 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体
草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用 预览
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作者 范成坚 苏博洋 苏建国 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2019年第1期9-13,共5页
为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼... 为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 干扰素3 多克隆抗体 抗体效价 蛋白表达
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卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 预览
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作者 何明旺 项雅婧 +2 位作者 孙云 曹贞洁 周永灿 《海南大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第1期34-40,共7页
为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(D... 为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础. 展开更多
关键词 卵形鲳鲹 hepcidin-5 原核表达 多克隆抗体
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吲哚美辛人工抗原及其多克隆抗体的制备
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作者 宋炎博 赵贵山 +5 位作者 汝晓飞 侯珂 林梦舟 李辛洁 孟庆蓉 王捍东 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第10期44-48,共5页
为了建立吲哚美辛(indomethacin,IDM)残留的免疫学检测方法,采用碳二亚胺法将载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别与IDM偶联,人工合成免疫原(IDM-BSA)和包被原(IDM-OVA)。通过紫外分光光度法、SDS-PAGE、ELISA等方法鉴定人... 为了建立吲哚美辛(indomethacin,IDM)残留的免疫学检测方法,采用碳二亚胺法将载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别与IDM偶联,人工合成免疫原(IDM-BSA)和包被原(IDM-OVA)。通过紫外分光光度法、SDS-PAGE、ELISA等方法鉴定人工抗原的合成效果;将IDM-BSA免疫小鼠,利用iELISA和icELISA来测定抗体血清效价。结果显示:IDM能与BSA和OVA成功偶联,通过免疫小鼠获得高效价的多克隆抗体,效价可达1∶6.4×10~4,半数抑制率为27.23 ng/mL。本研究结果为建立动物源性食品中IDM残留的免疫学检测方法奠定基础。 展开更多
关键词 吲哚美辛 多克隆抗体 免疫原性 药物残留 效价
猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立 预览
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作者 闫瑞杰 张云飞 +3 位作者 刘玲玲 张红垒 王亚宾 胡慧 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第10期1-8,17共9页
[目的]制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PD-CoV N蛋白抗体的间接ELISA方法.[方法]从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL... [目的]制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PD-CoV N蛋白抗体的间接ELISA方法.[方法]从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定.诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测.[结果]成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应.制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200.以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10g/L BSA在37℃下封闭2h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD450值≥0.272判定为阳性.特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%.用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%.[结论]成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测. 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体 血清学检测
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阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子的原核表达及多克隆抗体制备 预览
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作者 卢叶 朱雨莲 +7 位作者 朱莉 刘卿 朱昱蓉 凌薇 唐昌霞 姜旭淦 陈盛霞 曹建平 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期17-20,共4页
目的:原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF)并制备多克隆抗体.方法:采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19-T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET-30a(+... 目的:原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF)并制备多克隆抗体.方法:采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19-T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET-30a(+)载体.将重组载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白表达.采用镍柱亲和层析法纯化TvMIF蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,蛋白质印迹法检测多克隆抗体.结果:从阴道毛滴虫cDNA中扩增出TvMIF基因片段,测序结果与基因库收录序列一致.成功构建pET-30a-TvMIF重组质粒,重组TvMIF蛋白约为15.5kDa,以可溶性蛋白形式存在.获得TvMIF重组蛋白的多克隆抗体,蛋白印迹法检出TvMIF的特异性条带.结论:成功获得阴道毛滴虫MIF蛋白并制备了多克隆抗体,可用于后续研究阴道毛滴虫致病机制. 展开更多
关键词 阴道毛滴虫 巨噬细胞迁移抑制因子 原核表达 多克隆抗体
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猪源CD163受体蛋白多克隆抗体的制备及其PRRSV阻断效力研究
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作者 马晓莉 舒会友 +3 位作者 夏兆伦 余文兰 刘永伦 徐铮 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第10期76-80,共5页
为了制备猪源CD163受体蛋白鼠源多克隆抗体并检验其病毒阻断效力,采用RT-PCR方法扩增了猪肺泡巨噬细胞(PAM)CD163受体SRCR4-6功能区域片段,将其克隆至载体pET-32a中,并在大肠杆菌中表达重组CD163受体蛋白,纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充... 为了制备猪源CD163受体蛋白鼠源多克隆抗体并检验其病毒阻断效力,采用RT-PCR方法扩增了猪肺泡巨噬细胞(PAM)CD163受体SRCR4-6功能区域片段,将其克隆至载体pET-32a中,并在大肠杆菌中表达重组CD163受体蛋白,纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化;采用皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,应用间接ELISA方法检测抗体含量,以病毒阻断试验和间接免疫荧光法验证其病毒阻断效力。结果显示:重组蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子量约为50 kDa,制备的CD163受体蛋白多克隆抗体含量较高,经2~8倍稀释后,抗体阻断PRRSV感染细胞的能力逐渐下降。研究表明,在大肠杆菌中成功表达了PRRSV重组CD163受体蛋白,制备的鼠源多克隆抗体具有较明显的阻断PRRSV感染细胞的效力。本研究为深入研究病毒的入侵机制和PRRSV的防控提供了试验基础和新的思路。 展开更多
关键词 CD163受体蛋白 原核表达 弗氏佐剂 多克隆抗体 病毒阻断效力
尼罗罗非鱼PPARδ的原核表达及其多抗制备和纯化 预览
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作者 潘传燕 冯鹏霏 +1 位作者 张永德 罗洪林 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1053-1058,共6页
【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体p... 【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2048000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 尼罗罗非鱼 PPARΔ 原核表达 多克隆抗体
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中国绿水螅抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、抗体制备及表达分析 预览
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作者 张行 田晓晓 +2 位作者 董文芳 王茹梦 潘红春 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期305-314,共10页
为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放... 为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame,ORF)1104 bp,共编码367个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.79 kD。BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界;通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的APX序列各自形成单系群。把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株,IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX,再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay,WB)。在不同光照时长梯度(光强度2000 lx,每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d,实时定量PCR(Quantitative real-timePCR,qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调。在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内,此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧。 展开更多
关键词 中国绿水螅 抗坏血酸过氧化物酶 多克隆抗体 实时定量PCR 免疫印迹分析
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重组UK114融合蛋白的表达纯化及免疫组化定位 预览
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作者 尹淑琴 范艳 +2 位作者 朱宏 梁娟 常泓 《山西农业大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第3期95-100,共6页
[目的]UK114(山羊肝脏肿瘤抗原)是钙蛋白酶系统的主要成分钙蛋白酶ⅠCAPN1/S1(μ-calpain)的激活蛋白,本研究旨在利用原核表达系统体外制备重组UK114蛋白,获得融合蛋白制备抗体,对其进行组织定位,为深入研究其功能提供蛋白水平的证据。... [目的]UK114(山羊肝脏肿瘤抗原)是钙蛋白酶系统的主要成分钙蛋白酶ⅠCAPN1/S1(μ-calpain)的激活蛋白,本研究旨在利用原核表达系统体外制备重组UK114蛋白,获得融合蛋白制备抗体,对其进行组织定位,为深入研究其功能提供蛋白水平的证据。[方法]将重组质粒pGEX-4T-3-UK114转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达、纯化,用凝血酶对GST-UK114融合蛋白进行酶切,制备抗UK114多克隆抗体,免疫组化分析重组UK114蛋白在组织中的分布情况。[结果]GST-UK114融合蛋白的分子量为40kD,酶切得到目标蛋白,其分子量为14kD;用UK114蛋白免疫家兔,得到了理想的高效价兔抗UK114多克隆抗血清,效价大于1∶125000,抗血清经纯化得到兔抗UK114多克隆抗体,效价大于1∶25000;Western blot分析结果显示,GST-UK114融合蛋白在约40kD处有一明显条带,融合蛋白酶切后在14kD附近出现一条带;免疫组织化学分析表明,免疫组化染色主要发生在细胞质中,山羊肝脏组织中肝小叶边缘区有肝细胞出现棕色的阳性着色,部分肝窦内皮细胞也有棕色的阳性着色。肾脏皮质中的肾小管上皮细胞有棕色的阳性着色出现,肾小球中没有出现着色。[结论]试验成功获得纯化后的重组UK114蛋白,制备的抗UK114抗体可以与正常山羊肝脏和肾脏组织中的UK114蛋白结合,为其后续分子伴侣特性以及抗肿瘤特性的研究提供一定的蛋白试验依据。 展开更多
关键词 重组UK114 多克隆抗体 蛋白免疫印迹 免疫组织化学定位
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Cas9蛋白的克隆表达、分离纯化及多克隆抗体制备 预览
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作者 刘芳 卢婷 +5 位作者 蔡梦迪 吴芳草 陈相好 王彩霞 崔古贞 陈峥宏 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期757-761,766共6页
目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Ta... 目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Tag技术分离纯化Cas9蛋白;将纯化获得的Cas9蛋白免疫新西兰大白兔,制备Cas9蛋白多克隆抗体。结果:pET28a-Cas9重组表达载体转化的E.coliBL21(DE3)可表达Cas9蛋白,纯化的Cas9蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体效价>1∶256 K。结论:本研究获得了高质量Cas9蛋白及多克隆抗体,为后续CRISPR-Cas9基因编辑的应用奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 Cas9蛋白 蛋白表达与纯化 多克隆抗体
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弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备 预览
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作者 张芳菲 曹佳欣 +5 位作者 王晨红 毛懿杰 华倩倩 刘淑贤 谭峰 胡昕 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期120-125,137共7页
目的制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙... 目的制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体。最后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况。结果同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列。PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白。结论制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 沉默信号调节子2 蛋白翻译后修饰 组蛋白去乙酰化酶 多克隆抗体
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鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白原核表达及多克隆抗体制备 预览
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作者 毕可然 李银 +5 位作者 韩凯凯 赵冬敏 刘青涛 刘宇卓 黄欣梅 杨婧 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第23期4429-4436,共8页
【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该... 【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)^TM,经终浓度为0.5 mmol·L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L^-1 Tris-HCL和0.10 mol·L^-1NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被� 展开更多
关键词 鸭寡腺苷酸合成酶 原核表达 多克隆抗体
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胭脂红酸ELISA检测试剂盒的制备及应用 预览
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作者 李佳楠 杨帆帆 何峰容 《江汉大学学报:自然科学版》 2019年第5期436-441,共6页
为了快速高效检测肉类食品中胭脂红酸含量,制备了胭脂红酸ELISA检测试剂盒,检测了市售肉类样品中胭脂红酸含量,并通过高效液相色谱法进行了验证。结果显示试剂盒的检测限为1 ng/mL,线性范围7.8~1 150 ng/mL,灵敏度IC50值为95.2 ng/mL;... 为了快速高效检测肉类食品中胭脂红酸含量,制备了胭脂红酸ELISA检测试剂盒,检测了市售肉类样品中胭脂红酸含量,并通过高效液相色谱法进行了验证。结果显示试剂盒的检测限为1 ng/mL,线性范围7.8~1 150 ng/mL,灵敏度IC50值为95.2 ng/mL;该试剂盒中的检测抗体对胭脂红的交叉反应率为108.7%,但与其他4种色素添加剂均未见交叉反应。检测市售肉类样品的批内回收率在79.1%~103.1%之间,批间回收率在81.6%~98.8%之间;批内、批间试验的相对标准偏差基本小于10%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.927),说明该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为胭脂红酸免疫学快速检测方法的建立提供了技术基础。 展开更多
关键词 胭脂红酸 酶联免疫吸附试验(ELISA) 多克隆抗体 高效液相色谱(HPLC)
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Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 预览
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作者 余琳 吕利群 王浩 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1463-1471,共9页
针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基... 针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型鲤疱疹病毒 ORF121 原核表达 多克隆抗体 间接免疫荧光检测
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NMHC-ⅡA蛋白的重组表达、多克隆抗体制备及其功能的初步探讨 预览
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作者 熊丹 杜勇 +3 位作者 张华 武薇 莫红梅 张秀明 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第11期1281-1285,1292共6页
目的 对人源非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHC-ⅡA)蛋白进行重组表达、纯化并制备其多克隆抗体,初步探讨其生物学功能。方法 将MYH9编码基因克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG诱导重组表达。以谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠纯化产物为免疫原制备兔抗N... 目的 对人源非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHC-ⅡA)蛋白进行重组表达、纯化并制备其多克隆抗体,初步探讨其生物学功能。方法 将MYH9编码基因克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG诱导重组表达。以谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠纯化产物为免疫原制备兔抗NMHC-ⅡA多克隆抗体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和免疫印迹(Western-blot)检测抗体特异性;采用酶联免疫吸附法(ELISA)对纯化抗体的活性进行评价;采用抗体阻断试验进一步证实NMHC-ⅡA在EB病毒(EBV)感染鼻咽上皮细胞中的作用。结果 本研究生产和纯化两株多克隆NMHC-ⅡA抗体的浓度分别是600μg/mL和1.35mg/mL。制备的NMHC-ⅡA多克隆抗体以剂量依赖性的方式抑制EB病毒感染上皮细胞。结论 本研究成功实现NMHC-ⅡA的重组表达、抗体制备,实现了对其功能的初步研究,为其在鼻咽癌的发生发展过程中进一步深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 EB病毒 非肌肉肌球蛋白重链ⅡA 多克隆抗体 免疫特异性
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