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天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析 预览
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作者 赵峻 时磊 张芳 《南京中医药大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期73-77,共5页
目的通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的... 目的通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位点具有同源序列。结论噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。 展开更多
关键词 噬菌体展示 天花粉蛋白 筛选 同源分析
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噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建 预览
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作者 田栢会 易乐 +8 位作者 王习文 李颂 付世杰 王雨田 曲晗 李志萍 王丽萍 张淑华 夏志平 《吉林大学学报:理学版》 CAS 北大核心 2019年第4期989-996,共8页
构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接... 构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上,构成重组噬菌体DNA.最后,重组噬菌体DNA经体外包装和扩增,得到T7噬菌体展示文库,并进行T7噬菌体展示文库滴度、重组率和免疫活性测定.实验结果表明,从Gene Bank中查找、筛选、剪切和修饰共获得96258条序列构建T7噬菌体展示文库,原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL,重组率大于90%.用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定,得到理想目的条带,证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性,可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选。 展开更多
关键词 T7噬菌体 噬菌体展示 禽流感病毒 抗原变异性基因 文库鉴定
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Lipocalin噬菌体文库的构建及与FcεRI-α受体结合分子的初步筛选
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作者 彭华 马金魁 +2 位作者 程洁 黄成志 张宏斌 《中国药学:英文版》 CAS CSCD 2019年第11期770-777,共8页
根据Lipocalin蛋白家族的基因序列设计引物,通过PCR重叠延伸得到含随机突变蛋白的基因序列,重组到噬菌粒载体构建随机突变Lipocalin文库。以NSF60细胞对Lipocalin文库进行差减筛选,再用肥大细胞进行亲和筛选,得到结合肥大细胞的Lipocali... 根据Lipocalin蛋白家族的基因序列设计引物,通过PCR重叠延伸得到含随机突变蛋白的基因序列,重组到噬菌粒载体构建随机突变Lipocalin文库。以NSF60细胞对Lipocalin文库进行差减筛选,再用肥大细胞进行亲和筛选,得到结合肥大细胞的Lipocalin次级文库。以FcεRI-α受体蛋白为靶分子对Lipocalin次级文库进行富集筛选,洗脱特异性结合的噬菌体。经过3轮筛选,从第3轮的洗脱克隆中随机挑取8个重组噬菌体克隆。ELISA法检测出3个Anticalins分子能与肥大细胞FcεRI-α受体特异性结合。这为研发肥大细胞FcεRI-α受体阻断药物提供了生物类候选分子,也为Ig E相关的变态反应疾病的生物类小分子药物研发奠定了基础。 展开更多
关键词 Lipocalin FcεRI-α受体 Anticalin分子 噬菌体展示 肥大细胞
噬菌体展示技术鉴定软物质肽适体的研究进展
4
作者 李玉波 袁鸣 巩培 《生命科学》 CSCD 北大核心 2019年第3期316-322,共7页
噬菌体展示是筛选高亲和性短肽适体的有效技术,其最初主要用于鉴定蛋白质的适体,但目前该技术被越来越多地用于鉴定选择性结合多种高亲和性底物的适体,这些底物包括天然聚合物、合成聚合物以及各种有机小分子。经此鉴定出的肽适体具有... 噬菌体展示是筛选高亲和性短肽适体的有效技术,其最初主要用于鉴定蛋白质的适体,但目前该技术被越来越多地用于鉴定选择性结合多种高亲和性底物的适体,这些底物包括天然聚合物、合成聚合物以及各种有机小分子。经此鉴定出的肽适体具有强选择性、高亲和性结合目的底物的能力,且可调节与底物界面间的相互作用。现在对利用噬菌体展示技术鉴定出的与软物质底物结合的不同肽适体进行综述。 展开更多
关键词 噬菌体展示 软物质 肽配体
模拟表位结合夹心化学发光法检测抗A和抗B效价
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作者 周水梅 沈长新 +4 位作者 宋晶晶 王娇 林晨瑶 黄爽 贺学宇 《现代生物医学进展》 CAS 2019年第15期2822-2828,共7页
目的:获得A/B血型抗原的模拟多肽,并将其与夹心化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)相结合,以开发更有效的方法来测量A/B抗体的效价。方法:分别用NaM87-1F6和HEB-29对噬菌体12肽库进行三轮淘选。对经酶联免疫吸附实... 目的:获得A/B血型抗原的模拟多肽,并将其与夹心化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)相结合,以开发更有效的方法来测量A/B抗体的效价。方法:分别用NaM87-1F6和HEB-29对噬菌体12肽库进行三轮淘选。对经酶联免疫吸附实验(ELISA)确定的阳性菌斑进行测序分析,根据其氨基酸组成合成模拟多肽,并通过竞争性ELISA、凝集抑制等方法检测其抗原性。随后将获得的模拟多肽与CLIA结合,检测A、B抗体效价,制作标准曲线以及与现有的微柱凝胶法(CAT)进行相关性对比。结果:经过三轮淘选和相关鉴定后得到13个与抗A抗体和19个与抗B抗体特异性相互作用的噬菌体克隆,其中分别有9个(MTRIQLRMMRLH)和12个(PQMSRHRMRMLP)展示相同的氨基酸序列,据此合成的多肽分别命名为MTR和PQM。竞争性ELISA结果表明,MTR能够特异性拮抗A抗体和A抗原的替代多肽的免疫结合;PQM能够特异性拮抗B抗体和B抗原的替代多肽的免疫结合。凝集抑制实验表明MTR/PQM可以特异性抑制A/B型红细胞与抗A/B之间的相互作用。结合模拟肽的夹心CLIA具有较宽的线性范围(2-2048)和良好的线性相关系数(对于A抗体R2=0.9566,对于B抗体R2=0.9762)。基于CLIA方法和CAT测得的抗体滴度结果高度相关(P<0.001)。结论:MTR和PQM有良好的A或B抗原性,具有成为其人工替代品的潜能。模拟多肽与夹心CLIA相结合能够实现对A、B抗体滴度的定量检测,且其结果准确可靠。 展开更多
关键词 噬菌体展示 A、B抗体 化学发光 血型A B抗原
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒GP5蛋白羧基端的噬菌体展示及其诱导仔猪产生中和抗体水平
6
作者 王艳梅 顾敬敏 +3 位作者 雷连成 冯新 孙长江 韩文瑜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期830-834,841共6页
为了发现并验证猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)保护性抗原GP5蛋白羧基端新的中和性表位,本研究运用生物信息学软件预测PRRSV GP5蛋白羧基端的抗原性,全基因合成GP5蛋白羧基端168~198位氨基酸的编码序列,构建了重组噬菌体M13-GP5aa16... 为了发现并验证猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)保护性抗原GP5蛋白羧基端新的中和性表位,本研究运用生物信息学软件预测PRRSV GP5蛋白羧基端的抗原性,全基因合成GP5蛋白羧基端168~198位氨基酸的编码序列,构建了重组噬菌体M13-GP5aa168~198,以临床阳性血清进行Western blot分析重组噬菌体表面展示的GP5aa168~198多肽的免疫反应原性。以1.0×1013 PFU/mL重组噬菌体混合氢氧化铝佐剂制备免疫抗原,按照灭活疫苗免疫程序肌肉注射免疫PRRSV抗体阴性断乳仔猪2次,间隔2周,分别于末次免疫后的第2,4和6周采血,分离血清,以临床分离PRRSV强毒株进行中和试验。结果显示:重组噬菌体表面展示的GP5aa168~198多肽具有免疫反应原性,免疫仔猪后,能够诱导仔猪产生较高水平的中和性抗体,为构建PRRSV GP5新型多表位疫苗的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 噬菌体展示 中和抗体
浅谈2018年诺贝尔化学奖:驾驭进化的力量 预览
7
作者 周颖 朱理源 邹鹏 《大学化学》 CAS 2019年第1期1-6,共6页
定向分子进化是蛋白质工程领域的一项关键技术。通过在试管中模拟并加速自然界中的生物进化过程,定向进化技术直接针对生物大分子的功能进行突变改造和筛选,从中发现具有特殊功能的多肽和蛋白质。2018年的诺贝尔化学奖颁发给了美国加州... 定向分子进化是蛋白质工程领域的一项关键技术。通过在试管中模拟并加速自然界中的生物进化过程,定向进化技术直接针对生物大分子的功能进行突变改造和筛选,从中发现具有特殊功能的多肽和蛋白质。2018年的诺贝尔化学奖颁发给了美国加州理工学院的弗朗西斯.阿诺德、美国密苏里大学的乔治.史密斯和英国医学研究理事会分子生物学实验室的格里高利.温特,以表彰他们在定向分子进化领域做出的开创性贡献。本文简述了定向分子进化技术的发展历程及其对绿色能源和生物医药行业的重要贡献。 展开更多
关键词 定向进化 抗体 噬菌体展示 诺贝尔化学奖
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噬菌体展示随机环八肽库的构建 预览
8
作者 叶长烂 周霞 +2 位作者 谢浩然 马金魁 张宏斌 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第14期1670-1673,共4页
目的 构建表达于噬菌体表面的随机环八肽库。方法 通过自行设计,人工合成编码随机环八肽的寡核苷酸片段,通过延伸引物扩增获得编码随机环八肽的基因片段。将编码基因片段和M13KE噬菌体载体经过EagⅠ和KpnⅠ限制性内切酶双酶切后进行连接... 目的 构建表达于噬菌体表面的随机环八肽库。方法 通过自行设计,人工合成编码随机环八肽的寡核苷酸片段,通过延伸引物扩增获得编码随机环八肽的基因片段。将编码基因片段和M13KE噬菌体载体经过EagⅠ和KpnⅠ限制性内切酶双酶切后进行连接,重组产物电转入大肠杆菌ER2738感受态细胞获得噬菌体展示随机环八肽库,噬斑及测序检测库容和多样性。结果 构建的环八肽库库容超过7.5×10 9,重组阳性率为92.5%,不同率为97.3%。结论 成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机环八肽库。 展开更多
关键词 噬菌体展示 环八肽 构建
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全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立 被引量:1
9
作者 张雨超 丁龙飞 +2 位作者 陈健 张晓燕 徐建青 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期80-84,90共6页
目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合... 目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL),然后以VH和VL为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfiⅠ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清液经PEG-NaCl沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定。结果成功构建了库容为2.6×10^9的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体。结论成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选。 展开更多
关键词 抗体库 单链抗体 噬菌体展示
HIV-1衣壳蛋白抑制剂体外筛选方法研究进展 预览
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作者 张大为 许晓双 常珊 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期473-477,共5页
HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的“富勒烯”型衣壳。衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成。近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点。目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外... HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的“富勒烯”型衣壳。衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成。近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点。目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外筛选方法进行综述。 展开更多
关键词 HIV-1 衣壳蛋白抑制剂 邻近闪烁分析 均相时间分辨荧光 放大化学发光临近均相检测 噬菌体展示 双分子荧光互补 假病毒 虚拟筛选
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抗金黄色葡萄球菌α-溶血素全人源单链抗体的筛选及初步鉴定 预览
11
作者 李春 吴桐 +4 位作者 秦大莲 于红 谢翔 李雪 袁青(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1100-1104,共5页
目的:从全人源单链抗体文库中筛选并鉴定抗金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)单链抗体。方法:IPTG低温诱导α-HL融合蛋白表达并纯化鉴定;采用噬菌体展示技术从单链抗体文库中筛选抗α-HL全人源单链抗体(scFv)。将筛选并测序鉴定正确的15株... 目的:从全人源单链抗体文库中筛选并鉴定抗金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)单链抗体。方法:IPTG低温诱导α-HL融合蛋白表达并纯化鉴定;采用噬菌体展示技术从单链抗体文库中筛选抗α-HL全人源单链抗体(scFv)。将筛选并测序鉴定正确的15株scFvs插入pLZ16载体进行表达验证和ELISA鉴定。结果:表达纯化的α-HL融合蛋白为可溶性蛋白,大小约为90kD。采用表达的α-HL融合蛋白作为抗原,经过4轮噬菌体展示筛选,ELISA结果显示大约有34%的scFvs与α-HL具有结合特性。将与α-HL结合良好且序列正确的15株scFvs插入pLZ16载体中进行可溶性表达后,经Westernblot验证正确;ELISA鉴定结果显示:scFvs与购买的α-HL(Sigma,USA)、金黄色葡萄球菌都具有较高的结合活性且对金黄色葡萄球菌特异,与白色葡萄球菌无交叉反应。结论:成功筛选到抗α-HL全人源单链抗体。 展开更多
关键词 α-HL 全人源单链抗体 噬菌体展示 筛选
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对硫磷纳米抗体筛选及分子识别机制研究 预览
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作者 张玉琪 张瑾如 +7 位作者 王锋 李家冬 司睿 吕丽珊 沈玉栋 王弘 HAMMOCK Bruce D 孙远明 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1419-1426,I0007,I0008共10页
对硫磷是一种广谱的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂,毒性极强,可对环境和人类健康造成严重危害。尽管我国已禁止使用对硫磷,但仍存在违禁使用现象,加强对其监测十分必要。纳米抗体是已知最小的与抗原结合的片段(15 kDa),来源于骆驼科动物体... 对硫磷是一种广谱的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂,毒性极强,可对环境和人类健康造成严重危害。尽管我国已禁止使用对硫磷,但仍存在违禁使用现象,加强对其监测十分必要。纳米抗体是已知最小的与抗原结合的片段(15 kDa),来源于骆驼科动物体内重链抗体的可变区,具有稳定性强、灵敏度高、易表达、水溶性好等特性。本研究基于噬菌体展示技术构建了抗对硫磷纳米抗体库,其库容为2.41×10^7 cfu/mL,经抗原-抗体固相亲和筛选及噬菌体酶联免疫法(Phage ELISA)鉴定,获得5种抗对硫磷纳米抗体VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以结合能力最强的VHH1为基础,采用同源建模和分子对接技术探讨VHH1与对硫磷分子的识别机制,发现VHH1与对硫磷存在氢键和疏水间分子作用力,关键氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究为抗体的进化改造和半抗原的设计提供了新思路。 展开更多
关键词 纳米抗体 对硫磷 噬菌体展示 分子模拟
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柯萨奇病毒A组16型抗原表位预测
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作者 白晗 马淑花 +2 位作者 郭会杰 刘少华 李秀玲 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第10期1064-1069,共6页
目的应用模拟表位策略研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)抗原表位。方法分别以具有中和活性的抗CA16单克隆抗体2C6、4F9、1D8为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选可与之特异性结合的阳性克隆,对淘选得到的阳性克隆进行序列测... 目的应用模拟表位策略研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)抗原表位。方法分别以具有中和活性的抗CA16单克隆抗体2C6、4F9、1D8为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选可与之特异性结合的阳性克隆,对淘选得到的阳性克隆进行序列测定和比对,并采用Phage ELISA法进行特异性鉴定。同时利用生物信息学方法对CA16衣壳蛋白理化性质进行分析,并与阳性噬菌体多肽序列和结构进行比对,预测CA16中和抗原表位。结果经噬菌体12肽库筛选,单克隆抗体2C6、4F9、1D8淘选阳性噬菌体富集率分别为2.39×103、1.32×104和3.762×10,获得可与单克隆抗体2C6、4F9、1D8结合的阳性克隆分别为10、11、6种,其中各组共有基序分别为K+X+WW和N/Q+S/T+Y/F/W、K+X+WW+D/E、T+X+P+W。Phage ELISA特异性鉴定阳性克隆肽CA1和CB1、FB3和FC3、DA1和DA2、DA5分别强特异性结合单克隆抗体2C6、4F9、1D8。经计算机预测分析,确定了主要位于CA16 VP1800-810区域,并涉及VP4、VP3上的多个中和表位区域。结论应用模拟表位策略成功筛选出了CA16中和抗原表位,为CA16蛋白抗原结构、新型表位疫苗及诊断试剂的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 柯萨奇病毒A组16型 模拟表位 单克隆抗体 噬菌体展示 生物淘选
2018诺贝尔化学奖:酶定向进化与噬菌体展示技术 预览 被引量:3
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作者 曲戈 张锟 +1 位作者 蒋迎迎 孙周通 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期1-6,19共7页
2018年诺贝尔化学奖授予Frances H.Arnold、George P.Smith和Gregory P.Winter教授,分别表彰他们在酶的定向进化以及噬菌体展示技术方面取得的成就。这两项技术既有区别又有联系,其本质都是利用生物细胞在基因控制下合成蛋白质的生理过... 2018年诺贝尔化学奖授予Frances H.Arnold、George P.Smith和Gregory P.Winter教授,分别表彰他们在酶的定向进化以及噬菌体展示技术方面取得的成就。这两项技术既有区别又有联系,其本质都是利用生物细胞在基因控制下合成蛋白质的生理过程并通过人工筛选来实现特定的应用目的,而噬菌体展示技术是定向进化筛选策略的拓展。两项技术融合了有机化学、分子生物学以及蛋白质科学等多个学科,被世界各国实验室广泛使用。以2018年诺贝尔化学奖为主题,综述了定向进化以及噬菌体展示技术的发展历程、关键时间节点及其在相应领域的重要应用。 展开更多
关键词 诺贝尔化学奖 定向进化 噬菌体展示 高通量筛选
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噬菌体展示布鲁氏菌蛋白文库构建及差减筛选融合蛋白 预览
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作者 王阔鹏 于凌娇 +2 位作者 刘倩宏 刘麒 张履冰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期376-381,共6页
目的建立噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M株表面蛋白文库,差减筛选具有良好特异性、亲和力及反应原性的蛋白,为确定新型诊断用抗原奠定基础。方法利用噬菌粒载体pYW01构建重组羊型布鲁氏菌16M株基因文库,辅助噬菌体VCSM13感染基因文库进而构... 目的建立噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M株表面蛋白文库,差减筛选具有良好特异性、亲和力及反应原性的蛋白,为确定新型诊断用抗原奠定基础。方法利用噬菌粒载体pYW01构建重组羊型布鲁氏菌16M株基因文库,辅助噬菌体VCSM13感染基因文库进而构建噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M蛋白文库。利用PEG纯化后,扩增蛋白文库。随机挑取单克隆,提取质粒,测序鉴定蛋白文库。通过差减筛选,选择具有良好特异性、亲和力及反应原性的表面蛋白,为确定诊断用抗原奠定基础。结果通过DNA重组技术,构建羊型布鲁氏菌16M基因文库,库容量达到10^8 pfu/mL,并且随机性良好。利用辅助噬菌体VCSM13包装基因文库,随机挑取蛋白文库中单克隆,提取质粒,经测序鉴定,成功构建噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M株表面蛋白文库。利用免疫血清及感染血清对噬菌体展示蛋白文库进行差减淘选,筛选出6个噬菌体融合蛋白。经Western-blot分析6个噬菌体融合蛋白均具有较好的反应原性及特异性。结论成功构建噬菌体展示布鲁氏菌蛋白文库,差减筛选出6个具有较好反应原性及特异性的融合蛋白,为后续新型血清学诊断制剂筛选奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 噬菌体展示 融合蛋白 差减筛选
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骆驼天然单域重链抗体库的构建与鉴定 预览 被引量:2
16
作者 周景明 翟圆君 +3 位作者 耿玥 祁艳华 刘红亮 王爱萍 《动物医学进展》 北大核心 2018年第1期61-67,共7页
构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因... 构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因库,并分析其库容量及多样性。结果表明,经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与莱克多巴胺人工抗原特异性结合的噬菌体展示纳米抗体。构建的骆驼天然重链单域抗体库的库容量为10 7,多样性良好,独立克隆所占比例为90%,筛选出针对莱克多巴胺人工抗原的噬菌体颗粒。已成功构建骆驼天然噬菌体重链抗体库,并筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和莱克多巴胺的免疫学检测奠定基础,并为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 纳米抗体 噬菌体抗体库 莱克多巴胺 骆驼 噬菌体展示
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高效构建卵清白蛋白scFv噬菌体文库及其筛选
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作者 郎巧利 余琳 +2 位作者 何麒麟 葛良鹏 杨希 《中国生物工程杂志》 CSCD 北大核心 2018年第11期25-31,共7页
目的:建立一种高效噬菌体文库构建方法,获得抗鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库,筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法:用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠,选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA,利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重... 目的:建立一种高效噬菌体文库构建方法,获得抗鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库,筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法:用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠,选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA,利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重链和小鼠轻链基因。通过无缝连接酶一步将小鼠重链基因、轻链基因和linker DNA连接起来,插入噬菌体表达载体中,构建OVA scFv噬菌体展示文库。测定文库容量,对文库进行富集筛选,ELISA鉴定阳性克隆,测序后构建真核表达载体,转入Expi-CHO悬浮细胞进行真核表达,利用Western blot进行鉴定。结果:成功获得库容量为1. 2×10^7cfu的OVA scFv噬菌体展示文库,并从中筛选出8个阳性克隆,选取效价最高的2号克隆,在Expi-CHO悬浮细胞中表达获得可溶性抗体。结论:建立了一种高效构建scFv噬菌体文库的方法,筛选获得高结合活性的OVA单链抗体,并成功进行了真核表达,为OVA ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡卵清蛋白 SCFV 噬菌体展示 真核表达
浅谈2018年诺贝尔自然科学奖与生物学研究的关系 预览
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作者 黄青 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期6-8,共3页
2018年10月1—3日,2018年诺贝尔生理学或医学奖、物理学奖和化学奖分别揭晓,其中物理学奖和化学奖均与生物的研究和应用相关。阐述了2018年诺贝尔奖三大自然科学奖与生物学研究的关系,并简要分析了免疫负调控与癌症治疗、激光操纵细胞... 2018年10月1—3日,2018年诺贝尔生理学或医学奖、物理学奖和化学奖分别揭晓,其中物理学奖和化学奖均与生物的研究和应用相关。阐述了2018年诺贝尔奖三大自然科学奖与生物学研究的关系,并简要分析了免疫负调控与癌症治疗、激光操纵细胞、酶的定向进化等相关研究及其在生物科学领域的应用,以此说明现代物理、化学、生物交叉学科研究的重要性。 展开更多
关键词 诺贝尔奖 免疫负调控与癌症治疗 激光技术 光镊 啁啾脉冲放大 酶和抗体 噬菌体展示 定向进化
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抗程序性死亡受体-1纳米抗体的制备及鉴定
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作者 范利华 马晓玲 李江伟 《国际生物医学工程杂志》 CAS 2018年第3期230-237,共8页
目的 制备能与程序性死亡受体-1(PD-1)抗原高亲和力结合的骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供实验基础.方法 采用真核表达的PD-1-Fc重组蛋白对新疆双峰驼进行6次免疫,采集其外周血并从中分离得到淋巴细胞,进行巢式PCR扩增获... 目的 制备能与程序性死亡受体-1(PD-1)抗原高亲和力结合的骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供实验基础.方法 采用真核表达的PD-1-Fc重组蛋白对新疆双峰驼进行6次免疫,采集其外周血并从中分离得到淋巴细胞,进行巢式PCR扩增获取骆驼重链抗体可变区(VHH)基因,并构建噬菌体展示文库.然后采用固相酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选噬菌体展示文库,包被质量浓度依次降低(5.00、2.50、1.00 μg/ml)的PD-1抗原于ELISA板中,对噬菌体展示文库进行3轮亲和淘选.接着采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选与PD-1结合的单个克隆.根据DNA测序结果挑选具有多次重复序列的3个VHH单克隆构建至pET22b载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达.最后采用镍柱亲和层析纯化重组VHH抗体蛋白,蛋白质印迹法(Western Blot)和ELISA法检测其与PD-1抗原的结合活性和亲和力.结果 采用重组蛋白PD-1-Fc对双峰驼免疫6次后,激发了高滴度的特异抗体,免疫血清效价达到1∶32 000.从免疫后的骆驼淋巴细胞构建了库容大小为2.6× 108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库.经3轮亲和筛选后,采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选获得46个吸光度(A600)值在0.6以上的单个VHH克隆.其中VHH-B7、VHH-H5和VHH-H12三个克隆序列具有较高重复,表明获得了显著富集.Western Blot及ELISA法检测结果显示,纯化的B7、H5和H12纳米抗体均与PD-1抗原具有较好的结合活性,且具有较高的亲和力,亲和力常数分别为1.19×1011、1.63×1011、1.59×1011 L/mol.结论 通过对VHH噬菌体展示文库进行亲和筛选,获得了能与PD-1抗原高亲和力结合的抗PD-1骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供了实验基础. 展开更多
关键词 程序性死亡受体-1 纳米抗体 重链抗体可变区 鉴定 噬菌体展示
创伤弧菌溶细胞素特定氨基酸序列分析及其人源化单链抗体筛选
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作者 潘振 吕鹏 +6 位作者 邵淑丽 毕艳梅 孙梅 曲业敏 陈英剑 王明义 胡成进 《现代免疫学》 CSCD 北大核心 2018年第5期360-365,共6页
本研究利用生物信息学方法分析创伤弧菌(vibrio vulnificus, V.vulnificus)溶细胞素的蓖麻毒素结构域内氨基酸序列并合成多肽,筛选人工合成的单链抗体噬菌体文库Tomlinson I+J,为创伤弧菌感染的抗体阻断治疗研究奠定基础。通过对未... 本研究利用生物信息学方法分析创伤弧菌(vibrio vulnificus, V.vulnificus)溶细胞素的蓖麻毒素结构域内氨基酸序列并合成多肽,筛选人工合成的单链抗体噬菌体文库Tomlinson I+J,为创伤弧菌感染的抗体阻断治疗研究奠定基础。通过对未经处理的大容量Tomlinson I+J噬菌体文库进行3轮特异性亲和筛选,从中筛到特异性结合溶细胞素多肽的克隆,命名为scFv-D2,经氨基酸序列分析验证其含有完整的人源化抗体重链和轻链可变区。将scFv-D2克隆转化E.coli HB2151并诱导表达,用ELISA方法检测其可溶性scFv片段与溶细胞素毒性多肽的结合活性。结果显示从Tomlinson I+J文库成功筛选出一株具有结合活性的人源化噬菌体单链抗体,可用于创伤弧菌感染抗体阻断治疗策略的研究。 展开更多
关键词 创伤弧菌 溶细胞素 噬菌体展示 单链抗体
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