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Ⅲ型登革病毒在C6/36及Vero细胞中复制对其毒力的影响
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作者 林垚 洪珊 +3 位作者 王晓丹 陈俊英 潘玥 孙强明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第10期1070-1073,1079,共5页
目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,... 目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,PCR扩增获得传代毒种全长基因序列,并与原代病毒基因序列进行比对。结果DV3-1在C6/36细胞上传代至第17代次(P17-C6/36)时毒力保持稳定,DV3-2在盲传过程中均未见明显的细胞病变;将DV3-1和DV3-2第17代次病毒在Vero细胞上继续传代,DV3-1传至第10代次(P10-Vero)CPE为40%,DV3-2传至第4代次CPE达30%。DV3-1在P17-C6/36时具有较高的病毒拷贝数,在P0(原代病毒)及P10-Vero时病毒拷贝数偏低。与P0比较,P17-C6/36及P10-Vero全长碱基共16处发生突变,导致12个氨基酸的非同义突变,其中P0和P10-Vero在第5826、6251、7907位点碱基相同,P17-C6/36相应的氨基酸位点(第1942、2084、2636位点)均发生非同义突变。结论传代细胞更换可对Ⅲ型DENV的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为后续DENV减毒策略的研究提供了实验依据。 展开更多
关键词 Ⅲ型登革病毒 C6/36细胞 VERO细胞 毒力
3种中和剂对常用消毒剂在Vero细胞上的中和效果 被引量:1
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作者 律苗 杜雪娜 +3 位作者 杨杨 吕晓枫 李拓 李娜 《国际生物制品学杂志》 CAS 2019年第1期11-14,共4页
目的 研究0.5%硫代硫酸钠、10%胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基、10% Letheen肉汤培养基对实验室常用的4种消毒剂的中和效果,为疫苗生产和检定中科学选择中和剂提供依据.方法 取生长良好的Vero细胞接种于96孔培养板,每组... 目的 研究0.5%硫代硫酸钠、10%胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基、10% Letheen肉汤培养基对实验室常用的4种消毒剂的中和效果,为疫苗生产和检定中科学选择中和剂提供依据.方法 取生长良好的Vero细胞接种于96孔培养板,每组8个复孔,置于37℃、5% CO2培养箱培养过夜.将3种中和剂分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐4种消毒剂中和后,接种于单层生长的Vero细胞,显微镜下观察细胞生长情况.结果 0.5%硫代硫酸钠分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液中和后接种细胞,8孔细胞全部存活;而0.5%硫代硫酸钠分别与酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的中和产物接种细胞后,细胞全部死亡.10% TSB培养基分别与酸性苯酚盐、碱性苯酚盐中和后接种细胞,8孔细胞全部存活;而10% TSB培养基分别与杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的中和产物接种细胞后,细胞全部死亡.10% Letheen肉汤培养基接种细胞后,8个孔细胞全部死亡.结论 0.5%硫代硫酸钠可中和杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的消毒作用,10% TSB培养基可中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的消毒作用.10% Letheen肉汤培养对Vero细胞有毒性作用. 展开更多
关键词 硫代硫酸盐类 培养基 消毒药(剂) VERO细胞 中和效果
慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立 预览 被引量:1
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作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 蒙学莲 惠小婷 王耀杰 关玉华 尚佑军 刘永生 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期218-226,共9页
利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定... 利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组TotalRNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging MixpLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Real-time RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4~7d缩短为3.5d,TCID50·0.1mL^-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 SLAM Vero细胞系 GATEWAY技术 慢病毒表达系统
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Vero细胞培养H3N2流感病毒冷适应株条件的优化
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作者 纪燕燕 范家佑 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期7-9,共3页
目的对Vero细胞培养H3N2流感病毒条件进行优化。方法使用Vero细胞培养H3N2流感病毒,对病毒感染复数(MOI)、吸附时间、维持液中NaHCO3含量、TPCK-胰酶终浓度和细胞病变效应(CPE)等培养条件进行优化。结果在MOI为0.05,病毒吸附1.5 h,病毒... 目的对Vero细胞培养H3N2流感病毒条件进行优化。方法使用Vero细胞培养H3N2流感病毒,对病毒感染复数(MOI)、吸附时间、维持液中NaHCO3含量、TPCK-胰酶终浓度和细胞病变效应(CPE)等培养条件进行优化。结果在MOI为0.05,病毒吸附1.5 h,病毒维持液中6.6%NaHCO3溶液加入量为2%,TPCK-胰酶终浓度为1 mg/L,40%~50%细胞出现CPE情况下收获病毒,血凝(hemagglutination,HA)效价最高。结论优化后的培养条件可用于大规模流感疫苗的生产。 展开更多
关键词 流感病毒 H3N2 VERO细胞 培养条件
氯喹抑制寨卡病毒在vero细胞中感染复制的实验研究
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作者 姚向阳 黄璐 +1 位作者 徐雪 况二胜 《热带医学杂志》 CAS 2019年第4期409-412,421,528共6页
目的探究氯喹对寨卡病毒在vero细胞上感染复制的抑制效果,寻找一种可预防和治疗寨卡病毒感染的药物。方法寨卡病毒分别感染用不同浓度(0、5、10和20μmol/L)的氯喹预处理的对数生长期vero细胞,然后通过显微镜观察、免疫荧光、免疫印迹... 目的探究氯喹对寨卡病毒在vero细胞上感染复制的抑制效果,寻找一种可预防和治疗寨卡病毒感染的药物。方法寨卡病毒分别感染用不同浓度(0、5、10和20μmol/L)的氯喹预处理的对数生长期vero细胞,然后通过显微镜观察、免疫荧光、免疫印迹分析等方法检测氯喹对寨卡病毒基因表达和复制的抑制作用。结果显微镜观察发现,与无寨卡病毒感染的细胞相比,分别加入5、10和20μmol/L的氯喹处理寨卡病毒感染的vero细胞72 h后发现,细胞脱落、死亡等现象逐渐消失,寨卡病毒的致细胞病变效应明显减弱。间接免疫荧光结果显示,感染复数(MOI)=1的寨卡病毒感染vero细胞48 h后,几乎所有细胞都被染成红色,显示E抗原阳性,随着氯喹浓度的增加,荧光强度逐渐减弱,当加入20μmol/L的氯喹后,荧光基本消失了,氯喹很好地抑制了寨卡病毒E蛋白的表达,且这种抑制效应具有剂量依赖性。免疫印迹法检测显示,用MOI=1的寨卡病毒感染vero细胞48 h后,在细胞中能够检测到NS5蛋白的表达,而随着氯喹加入浓度的增加,寨卡病毒NS5蛋白的表达逐渐降低,特别是当氯喹的浓度达到20μmol/L后,抑制效果更明显。qRT-PCR结果显示,5μmol/L的氯喹即可抑制上清中病毒产量的90%(P<0.01)。结论氯喹能够抑制寨卡病毒在vero细胞中的感染和复制,表明氯喹可作为一种治疗寨卡病毒感染的潜在药物。 展开更多
关键词 寨卡病毒 氯喹 复制 VERO细胞
4种有机溶剂对Vero细胞活力和弓形虫增殖的影响 预览
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作者 薛俊欣 熊炜 +6 位作者 张强 黄忠荣 李树清 李春阳 赵新宇 李健 王权 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第8期2265-2272,共8页
本研究旨在筛选低细胞毒性和低弓形虫毒性的有机溶剂。Vero细胞在96孔板培养12 h后,将培养基更换为200μL分别含0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇的完全培养基,同时设立空白对照... 本研究旨在筛选低细胞毒性和低弓形虫毒性的有机溶剂。Vero细胞在96孔板培养12 h后,将培养基更换为200μL分别含0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇的完全培养基,同时设立空白对照孔,继续培养12和24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法评价4种有机溶剂对Vero细胞增殖活力的影响,筛选出对宿主细胞毒性最小的有机溶剂并确定其安全浓度;弓形虫接种Vero细胞12 h后,弃上清后分别加入含有0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%(V/V)的DMSO、二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇的完全培养基120μL,接种36 h后判定各组溶剂对弓形虫增殖的影响,计数感染细胞数并计算相对感染率,筛选出对弓形虫增殖影响最小的有机溶剂及其安全浓度。结果显示,对于Vero细胞,DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇分别在其体积分数低于1%、0.1%、3%和1%时无明显毒性;对于弓形虫,DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇对弓形虫增殖的安全添加浓度分别为1%、0.1%、1%和0.1%。本研究表明,DMSO、甲醇对Vero细胞、弓形虫的毒性较小,可作为水溶性较差药物进行抗弓形虫筛选时优先选择的有机溶剂。 展开更多
关键词 有机溶剂 VERO细胞 弓形虫 活力 增殖
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冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)蛋白结构特性分析
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作者 匡志新 柴博雅 +7 位作者 李春艳 孙宏亮 朱美宣 熊晋峰 谢冰丽 王帆 解辉 邹勇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第4期375-379,共5页
目的分析冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)蛋白的结构特性。方法 SDS-PAGE电泳分离4批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液,电泳条带经nano LC-MS/MS进行蛋白鉴定,Native-PAGE分析病毒颗粒的完整性,并分析蛋白相对分子质量。同时进行N-末端... 目的分析冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)蛋白的结构特性。方法 SDS-PAGE电泳分离4批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液,电泳条带经nano LC-MS/MS进行蛋白鉴定,Native-PAGE分析病毒颗粒的完整性,并分析蛋白相对分子质量。同时进行N-末端氨基酸序列分析。结果 SDS-PAGE分析可见5个主条带,分别为狂犬病毒G、M、N、P蛋白及G蛋白二聚体(G-1),经nano LC-MS/MS鉴定,确定相对分子质量分别为74 000、21 885、57 287、40 934及141 067,各结构蛋白均包含在病毒颗粒中,M、N、P、G蛋白的N-末端起始氨基酸序列为分别为MNFLR、MDADR、MSKIF、MVPQA,与预期一致。结论 4批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液所含结构蛋白源于狂犬病病毒。 展开更多
关键词 狂犬病疫苗 结构蛋白 SDS-PAGE分析 nano LC-MS/MS 氨基酸序列分析 VERO细胞
猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究 预览
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作者 韩伟 周建民 +2 位作者 郝霖雨 潘文 潘京学 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第12期3572-3578,共7页
试验旨在对猪乙型脑炎病毒(JEV,SA14-14-2株)在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间... 试验旨在对猪乙型脑炎病毒(JEV,SA14-14-2株)在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫(间隔14 d)接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前(0d)、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前(0 d)、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48 h进行病毒接种,接种量为1 000 PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90 min,吸附后用pH 7.6?8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96 h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护_本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒(JEV) VERO细胞 繁殖特性 病毒滴度 灭活疫苗 免疫原性
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Vero细胞培养A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va流感病毒适宜条件研究 预览
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作者 非成瑞 马磊 +4 位作者 高菁霞 崔兆海 宋绍辉 李卫东 廖国阳 《生物技术通讯》 CAS 2018年第6期778-782,共5页
目的:优化Vero细胞培养H7N9流感病毒的培养条件,建立细胞培养病毒高产培养系统。方法:采用不同病毒接种MOI、培养温度、pH值和TPCK胰酶等条件优化培养H7N9流感病毒Vero细胞适应株A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va的条件,并将其连续传代后扩... 目的:优化Vero细胞培养H7N9流感病毒的培养条件,建立细胞培养病毒高产培养系统。方法:采用不同病毒接种MOI、培养温度、pH值和TPCK胰酶等条件优化培养H7N9流感病毒Vero细胞适应株A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va的条件,并将其连续传代后扩大至细胞工厂大规模培养。结果:Vero细胞高产H7N9流感病毒培养条件为DMEM/F12和MEM以1∶1混合,并添加0.3mg/mL牛血清白蛋白、1%谷氨酰胺、0.5%双抗和1.5μg/mLTPCK胰蛋白酶,pH为7.4时,连续传代病毒血凝效价保持在512,扩大至细胞工厂大规模培养病毒产量稳定。结论:建立的Vero细胞培养H7N9流感病毒条件,能够持续稳定高产,并适用于细胞工厂大规模培养,有望用于H7N9流感细胞疫苗的大规模制备。 展开更多
关键词 H7N9流感病毒 培养条件 VERO细胞 高产
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基于Vero细胞的流感病毒高产株的研究进展
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作者 徐国峰 廖国阳 李卫东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第3期319-322,共4页
流感是由流感病毒引起的严重急性呼吸道疾病,目前,接种疫苗是预防流感的最有效手段。Vero细胞是WHO推荐用于生物制品的细胞系,大多数流感病毒在Vero细胞上生长性能较差,因此筛选一株具有Vero细胞稳定高产特性的流感病毒母本株是Vero细... 流感是由流感病毒引起的严重急性呼吸道疾病,目前,接种疫苗是预防流感的最有效手段。Vero细胞是WHO推荐用于生物制品的细胞系,大多数流感病毒在Vero细胞上生长性能较差,因此筛选一株具有Vero细胞稳定高产特性的流感病毒母本株是Vero细胞流感疫苗研发及生产的关键环节。本文对流感病毒Vero细胞高产株几种选育方法的研究进展及影响流感病毒Vero细胞产量的相关因素作一综述。 展开更多
关键词 VERO细胞 流感病毒 高产株 疫苗
猪圆环病毒2型ORF2基因在Vero细胞中真核表达的研究
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作者 马晓莉 林彦星 +4 位作者 董建国 刘燕玲 刘清神 宋长绪 徐铮 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第11期12-15,19,250共6页
为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)ORF2基因在Vero细胞中的表达情况,试验利用PCR方法将扩增的PCV-2 ORF2基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组表达质粒pcDNA-ORF2,测序后对4株毒株的ORF2基因... 为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)ORF2基因在Vero细胞中的表达情况,试验利用PCR方法将扩增的PCV-2 ORF2基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组表达质粒pcDNA-ORF2,测序后对4株毒株的ORF2基因进行核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较分析,并分别采用磷酸钙法和脂质体法将重组表达质粒pcDNA-ORF2导入哺乳动物Vero细胞内,通过间接免疫荧光试验验证重组表达质粒在Vero细胞中的表达情况。结果表明:PCR方法成功扩增出4株PCV-2毒株的ORF2基因;成功构建出重组表达质粒pcDNA-ORF2;4株毒株的ORF2基因核苷酸序列同源性在98.6%-99.1%之间,推导氨基酸序列的同源性在97.4%-98.7%之间;间接免疫荧光试验检测到Vero细胞内发出绿色荧光。说明重组表达质粒pcDNA-ORF2在Vero细胞中得到了正确表达。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 ORF2基因 VERO细胞 真核表达载体 重组表达质粒 间接免疫荧光试验
生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒
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作者 周健 李国良 +5 位作者 宋绍辉 欧阳圣洁 刘泽 戴永娟 廖国阳 李卫东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第5期547-551,共5页
目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度... 目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10^4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10^4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。 展开更多
关键词 生物反应器 VERO细胞 微载体 H1N1流感病毒
篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒工艺的建立
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作者 梁宏阳 赵玉秀 +6 位作者 于守智 张弓 刘超 刘小娟 张晋 张达伦 王辉 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第12期1360-1366,共7页
目的建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺。方法对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析... 目的建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺。方法对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析并确定脊髓灰质炎病毒的最适培养工艺参数。结果载体装量400~600 g,细胞接种密度1×10^6个/mL时,葡萄糖消耗量最大,平台期持续2~3 d,此时细胞接种病毒最佳。以0. 01~0. 3 MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,采用199培养基于(33±0. 5)℃,pH 7. 4~7. 6条件下培养时,病毒滴度最高,HCP残留量较低,为最适培养工艺。结论初步建立了基于篮式生物反应器的脊髓灰质炎病毒高效制备工艺。 展开更多
关键词 篮式生物反应器 Sabin株脊髓灰质炎病毒 病毒培养 VERO细胞
登革病毒感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞CPE的比较及病毒检测 被引量:1
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作者 杨佳佳 姜黎明 +3 位作者 罗佳 叶超 文送娇 孙强明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期362-365,371共5页
目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-2... 目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒。结果C6/36细胞对DV最敏感并有明显的病变,细胞几乎100%聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE。PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV。结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存在较大差异。 展开更多
关键词 登革病毒 细胞病变 C6/36细胞 Vero细胞 BHK-21细胞 THP-1细胞
^60Co γ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响
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作者 乔自林 马桂兰 +4 位作者 王家敏 李明生 冯若飞 令世鑫 马忠仁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第5期481-484,共4页
目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经^60Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy^60Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero... 目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经^60Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy^60Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的最大增殖密度为73.38×10^4和65.33×10^4个/ml(P〉0.05),倍增时间为24.38和25.33 h(P〉0.05);CHOK1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的最大增殖密度为80.03×10^4和79.3×10^4个/ml(P〉0.05),倍增时间为19.73和23.62 h(P〈0.05)。结论 NBCS经20 k Gy ^60Coγ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢。 展开更多
关键词 牛血清 γ-射线 细胞培养 VERO细胞 CHO-K1细胞
生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型 被引量:1
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作者 刘志成 卿琰 +3 位作者 岳凤先 井敏敏 黄芬 井申荣 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期79-81,共3页
目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测... 目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×10~5个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达最高,约7.75 TCID_(50)/ml。结论成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 生物反应器 微载体 VERO细胞 柯萨奇病毒A组16型
非洲绿猴肾细胞中猪圆环病毒1型的检测
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作者 刘艳 于晴川 +7 位作者 杜加亮 刘悦越 李东 高加梅 范行良 张韵祺 赵荣荣 国秦 《国际生物制品学杂志》 CAS 2017年第2期62-66,共5页
目的建立轮状病毒疫苗污染事件中的外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type1,PCV1)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的检测方法。方法培养感染PCV1的Vero细胞6d后,通过定性PCR、定量PCR、电子显微镜(电镜)检查和原位杂交检... 目的建立轮状病毒疫苗污染事件中的外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type1,PCV1)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的检测方法。方法培养感染PCV1的Vero细胞6d后,通过定性PCR、定量PCR、电子显微镜(电镜)检查和原位杂交检测PCV1的复制与增殖。结果从感染PCV1的Vero细胞培养物提取的DNA,其PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带;定量PCR检测显示,感染6d后病毒总拷贝数是感染前的794.3倍;定性和定量PCR的最低检出浓度均为10^2.0拷贝/ml;电镜观察到PCV1特征性形态病毒颗粒;原位杂交检测到出现深色阳性信号的PCV1阳性细胞。结论PCV1感染Vero细胞后的复制增殖可以通过上述方法进行检测。 展开更多
关键词 圆环病毒属 VERO细胞 聚合酶链反应 显微镜检查 电子 原位杂交
无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析 被引量:1
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作者 张香玲 张生琰 +3 位作者 孙燕 刘鹏 赵星文 李薇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期68-73,共6页
目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero... 目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P〉0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P〉0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P〉0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。 展开更多
关键词 无血清无动物源性培养基 VERO细胞 传代稳定性
Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究
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作者 任玉莹 刘建凯 +8 位作者 尹珊珊 徐颖之 邓海清 殷建齐 邢盛宇 张艳红 高宇皎 郝倩 刘杨 《国际生物制品学杂志》 CAS 2017年第3期121-124,138共5页
目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法。方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。比较样品不同处理方式的检测差异。对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证。结果 Vero 细胞... 目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法。方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。比较样品不同处理方式的检测差异。对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证。结果 Vero 细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260 nm与280 nm波长处的吸光度比值为1.88。探针灵敏度达到0.01 pg/μl。采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg。特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交。灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于–70 ℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg。 结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法。采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒疫苗 灭活 DNA污染 VERO细胞 方法
香菊胶囊溶液在Vero细胞中对单纯疱疹病毒2型的抑制作用 被引量:1
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作者 杨励 刘杨 +1 位作者 牛妍艳 张美芳 《中国皮肤性病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期273-276,共4页
目的 研究香菊胶囊溶液对单纯疱疹病毒2型的抗病毒作用,为生殖器疱疹的治疗寻找新的治疗手段。方法 以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率和病毒抑制率来评价... 目的 研究香菊胶囊溶液对单纯疱疹病毒2型的抗病毒作用,为生殖器疱疹的治疗寻找新的治疗手段。方法 以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率和病毒抑制率来评价香菊胶囊溶液体外对单纯疱疹病毒2 型(HSV-2)的抑制作用。结果 香菊胶囊溶液对Vero细胞的半数毒性浓度(TC50)为12.5mg/mL,药物和HSV-2共同作用2h后、病毒感染2h后加入药物、预防给药途径三种条件下对HSV-2 的半数有效浓度(IC50)分别为1.901mg/mL,1.871mg/mL和1.942mg/mL,治疗指数(TI)分别为6.58,6.68和6.44,其抗病毒效果与阿昔洛韦差异无统计学意义(P〉0.05)。结论 香菊胶囊溶液在体外对HSV-2直接灭活作用明显,且对HSV-2的吸附和穿入细胞均有抑制作用,具有很好的体外抗疱疹病毒作用。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒2型 VERO细胞 香菊胶囊
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