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携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞示踪方法 预览
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作者 王福科 张红 +4 位作者 杨桂然 肖渝 何川 宋恩 李彦林 《昆明医科大学学报》 CAS 2019年第5期24-30,共7页
目的本实验研究旨在研究使用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)的方法,用于解决组织工程骨研究中种子细胞分化、增殖过程中的示... 目的本实验研究旨在研究使用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)的方法,用于解决组织工程骨研究中种子细胞分化、增殖过程中的示踪问题。方法用携带eGFP的慢病毒转染第3 代BMSCs,用流式细胞仪检测转染率,获得稳定表达eGFP 的BMSCs,并通过描绘生长曲线来判定对BMSCs 增殖性能的影响。结果当MOI值为70 时,经eGFP 慢病毒转染后的BMSCs 能够得到活性较好、转染率高的eGFP-BMSCs;转染后各细胞生长曲线呈"S"形,MOI=70 与MOI=0 时细胞增殖最好,MOI=100 会对BMSCs 增殖造成影响。结论MOI=70 时携载eGFP基因慢病毒转染BMSC效果最好。 展开更多
关键词 EGFP基因 慢病毒 转染 骨髓间充质干细胞
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MicroRNA-183抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移 预览
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作者 董然 朱晓雷 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第13期2267-2271,共5页
目的:探讨microRNA183 (miRNA-183)对结直肠癌肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法:使用慢病毒技术,分别转染HT29细胞株,建立稳定过表达细胞株miRNA-183 mimics,抑制miRNA-183表达的稳定细胞株miRNA-183 inhibitor以及阴性对照组negat... 目的:探讨microRNA183 (miRNA-183)对结直肠癌肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法:使用慢病毒技术,分别转染HT29细胞株,建立稳定过表达细胞株miRNA-183 mimics,抑制miRNA-183表达的稳定细胞株miRNA-183 inhibitor以及阴性对照组negative control。qRT-PCR检测各组细胞miRNA-183的表达,Western blot检测miRNA-183下游靶基因PDCD4蛋白水平表达变化,CCK8增殖实验检测各组细胞的增殖情况,同时以划痕实验和Transwell实验分析转染miRNA-183 mimics和miRNA-183 inhibitor对HT29细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:与阴性对照组相比,miRNA-183 mimics组细胞增殖速度明显下降,其迁移和侵袭能力也显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);miRNA-183下游靶基因PDCD4蛋白水平表达明显增加。结论:miRNA-183可有效地抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移。 展开更多
关键词 microRNA-183 结直肠癌肿瘤细胞 转染 增殖 侵袭 迁移
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SMAD4基因新突变体对胰腺导管腺癌细胞迁移能力的影响 预览
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作者 占世雄 张顺 +2 位作者 张璐 刘世国 王祖森 《精准医学杂志》 2019年第3期254-258,共5页
目的研究SMAD4新突变体对胰腺导管腺癌(PDAC)发生发展的影响。方法 将构建好的空白对照组(NC组)、野生型组(SMAD4 wt组)、突变型组(SMAD4 Y353C组)3组质粒用TransIntro TM EL转染试剂分别导入PDAC细胞PANC-1中,首先进行实时荧光定量聚... 目的研究SMAD4新突变体对胰腺导管腺癌(PDAC)发生发展的影响。方法 将构建好的空白对照组(NC组)、野生型组(SMAD4 wt组)、突变型组(SMAD4 Y353C组)3组质粒用TransIntro TM EL转染试剂分别导入PDAC细胞PANC-1中,首先进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western Blot实验,分析不同质粒对PDAC细胞mRNA和蛋白质表达的影响,然后进行伤口愈合实验和细胞侵袭实验,研究不同质粒对PDAC细胞PANC-1伤口愈合和侵袭能力的影响。结果 RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,NC组、SMAD4 wt组、SMAD4 Y353C组PDAC细胞PANC-1 SMAD4 mRNA和蛋白表达量比较差异均有统计学意义( F =695.76、 194.98 , P <0.05),而且SMAD4 Y353C组mRNA和蛋白表达量均低于SMAD4 wt组,高于NC组,差异均有显著性( P <0.05)。体外伤口愈合实验和细胞侵袭实验结果显示,NC组、SMAD4 wt组和SMAD4 Y353C组细胞的迁移面积和侵袭能力比较差异有统计学意义( F =1 741.15、299.12, P <0.05),SMAD4 Y353C组细胞的迁移面积和侵袭能力明显大于SMAD4 wt组细胞,小于NC组细胞,差异均有显著意义( P <0.05)。结论 突变型SMAD4 Y353C能抑制PANC-1细胞 SMAD4 mRNA和蛋白质的表达,促进PANC-1细胞的迁移和侵袭,为PDAC的治疗提供理论依据。 展开更多
关键词 Smad4蛋白质 胰腺管 突变 转染 细胞运动 肿瘤侵润
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PURα介导糖尿病神经病变大鼠发病神经元中p27^kip-1和TNF-α的表达及其意义 预览
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作者 闵静 何婷 +3 位作者 王莉 唐莎 付莎莉 徐子辉 《东南大学学报:医学版》 CAS 2019年第3期427-432,共6页
目的:探讨人转录因子活性蛋白α(PURα)介导糖尿病神经病变(DN)神经元中抑制蛋白p27^kip-1和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达及其意义。方法:采用腹膜腔注射链脲佐菌素法制备DN大鼠作为DN组,以健康大鼠为对照组,每组20只。比较1周内两组... 目的:探讨人转录因子活性蛋白α(PURα)介导糖尿病神经病变(DN)神经元中抑制蛋白p27^kip-1和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达及其意义。方法:采用腹膜腔注射链脲佐菌素法制备DN大鼠作为DN组,以健康大鼠为对照组,每组20只。比较1周内两组大鼠病理性疼痛和热痛觉过敏情况,分析两组大鼠背根节(DRG)神经元PURα、p27^kip-1和TNF-α的表达。取鼠源海马神经元细胞株HT-22,转染为4组:PURα过表达组(转染PURα表达质粒)、mock组(不转染任何表达载体)、空白对照组(转染空表达载体)及PURα沉默组(转染PURαRNAi表达质粒),分析细胞株PURα、p27^kip-1和TNF-α的表达。结果:与对照组比较,DN组大鼠出现明显的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏(P<0.05),DN组大鼠DRG神经元PURα、p27^kip-1及TNF-α的表达上调(P<0.05),PURα与p27^kip-1及TNF-α的表达呈显著正相关(P<0.05)。神经元细胞株中上调PURα的表达能显著提高p27^kip-1及TNF-α的表达水平(P<0.05),抑制细胞内源PURα表达,p27^kip-1及TNFα的表达水平则显著降低(P<0.05)。结论:PURα可介导p27^kip-1和TNF-α蛋白表达,可能参与了DN的发病过程。 展开更多
关键词 糖尿病神经病变 人转录因子活性蛋白α p27^kip-1 肿瘤坏死因子Α 大鼠 转染
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rTNSALP-FcD10重组表达质粒的构建及在CHO-K1细胞的稳定表达
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作者 徐颖 付加芳 +2 位作者 唐超 韩金祥 王世立 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第5期521-526,共6页
目的构建重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及p EF1-rTNSALP-FcD10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株。方法去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)多钛链C端氨基酸连接IgG... 目的构建重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及p EF1-rTNSALP-FcD10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株。方法去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)多钛链C端氨基酸连接IgG1的Fc片段及10个天冬氨酸,构建目的基因rhALP-FcD10,将基因分别克隆至pcDNA3.1及p EF1/Myc-His B载体上,均转化E.coli DH5α细胞;将签定正确的两组重组质粒均转染CHO-K1细胞,进行G418压力筛选,建立稳定转染的CHO-K1细胞系,采用RT-qPCR及Western blot方法检测细胞中rTNSALPFcD10 mRNA转录水平及蛋白表达量。结果重组质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10经双酶切鉴定证明构建正确;G418最低致死浓度确定为800μg/mL;CHO-K1细胞中rTNSALP-FcD10m RNA转录及蛋白水平均高于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);转染p EF1-rTNSALP-FcD10组的蛋白表达量较转染pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10组高。结论成功构建了rTNSALP-FcD10的重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10,获得了稳定转染的CHO-K1细胞系,成功表达目的蛋白rTNSALP-FcD10,为蛋白进一步纯化奠定了良好的实验基础。 展开更多
关键词 重组人非组织特异碱性磷酸酶 CHO-K1细胞 转染 稳定表达
Bcl-2改善老年人骨髓间充质干细胞抗缺氧损伤能力的研究 预览
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作者 陈巍 张东旸 +3 位作者 白龙 范明 蒋树林 田海 《心肺血管病杂志》 2019年第2期194-197,205共5页
目的:通过转染Bcl-2基因增强老年人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的Bcl-2表达,尝试改善老年hMSCs在缺氧环境下的抗凋亡、抗损伤能力,为基因联合细胞移植改善老年hMSCs自体移植治疗缺血性心脏病的提供依据。方法:分离培养老年hMSCs并进行鉴定... 目的:通过转染Bcl-2基因增强老年人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的Bcl-2表达,尝试改善老年hMSCs在缺氧环境下的抗凋亡、抗损伤能力,为基因联合细胞移植改善老年hMSCs自体移植治疗缺血性心脏病的提供依据。方法:分离培养老年hMSCs并进行鉴定。构建Bcl-2基因质粒并对老年人hMSCs进行Bcl-2基因的转染。应用CO2和N2的混合气体建立稳定的缺氧培养环境模拟心肌梗死时的缺氧环境,分别对老年hMSCs及Bcl-2转染后老年hMSCs进行缺氧培养,比较各组细胞的细胞凋亡及损伤情况。通过冠状动脉结扎建立稳定的大鼠心肌梗死模型,分别应用老年hMSCs及Bcl-2转染后的老年hMSCs进行细胞移植,比较各组细胞在心肌梗死区域缺氧环境下的存活情况,同时应用超声心动图对比两组细胞移植后心肌梗死大鼠心脏功能的改善情况。结果:转染Bcl-2的老年hMSCs能够稳定表达Bcl-2的基因及蛋白。转染Bcl-2后的老年hMSCs在缺氧环境下较未转染的老年细胞其凋亡数量明显下降、生存率明显提高,表达的Bcl-2基因及蛋白也多于未转染的老年细胞。各组细胞移植至大鼠梗死心脏后可见转染Bcl-2的老年hMSCs组的细胞存活数量明显高于未转染组,梗死心脏的Bcl-2的基因含量和蛋白表达量也高于未转染老年细胞移植组,心肌梗死大鼠在移植了转染Bcl-2的老年hMSCs组后其心脏的射血分数和左心室短轴缩短率好于未行细胞移植组和移植未转染细胞组。结论:增加老年hMSCs中Bcl-2基因的含量能够增加其Bcl-2蛋白表达量、增强其在缺氧环境中的抗凋亡能力。应用Bcl-2转染的方法能够增强老年hMSCs移植治疗心肌梗死时的移植后细胞存活能力、提高梗死区域的Bcl-2蛋白表达量并增强了老年hMSCs移植改善心肌梗死后心脏功能的效果。 展开更多
关键词 转染 BCL-2 老年人骨髓间充质干细胞 抗缺氧损伤 细胞移植 心肌梗死
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Ndfip1对神经细胞铁超载损伤的保护作用及机制探讨 预览
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作者 陈明辉 田娟 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期118-121,共4页
目的探讨Ndfip1过表达对神经细胞SH-SY5Y铁超载损伤的保护作用及机制。方法以SH-SY5Y细胞为细胞模型,并成功构建Ndfip1质粒。应用Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,建立实验组和对照组。MTT法检测不同浓度FeSO4作用下,SH-SY5Y细... 目的探讨Ndfip1过表达对神经细胞SH-SY5Y铁超载损伤的保护作用及机制。方法以SH-SY5Y细胞为细胞模型,并成功构建Ndfip1质粒。应用Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,建立实验组和对照组。MTT法检测不同浓度FeSO4作用下,SH-SY5Y细胞存活率的变化,确定铁超载浓度;Ndfip1质粒转染SH-SY5Y细胞,确定转染效率;Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,MTT法检测2组细胞存活率的变化;应用Calcein AM法处理细胞,荧光显微镜下观察2组细胞的荧光强度,以确定细胞内铁离子的含量;荧光分光光度计检测2组细胞的荧光强度变化,以确定细胞铁摄入能力的改变。结果随着FeSO4浓度增加,SH-SY5Y细胞存活率逐渐降低。200μmol/L FeSO4可导致SH-SY5Y细胞存活率明显下降。Ndfip1质粒转染可明显增加SH-SY5Y细胞Ndfip1蛋白表达量,提高SH-SY5Y细胞铁超载损伤后的存活率,减少细胞内铁离子含量及细胞对铁离子的摄入。结论铁超载对神经细胞造成损伤,导致其存活率降低;Ndfip1可减少铁离子进入神经细胞,减轻神经细胞内铁蓄积,降低铁超载对神经细胞的损伤作用,提高细胞存活率,从而发挥其保护作用。 展开更多
关键词 神经元 转染 Ndfip1 神经保护
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大鼠microRNA-327重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的转染效率 预览
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作者 李奇 杨俊 +3 位作者 杨简 杨英 郑涛 刘晓雯 《解剖学杂志》 CAS 2019年第3期244-248,共5页
目的:构建含微小RNA-327(miRNA-327)基因的腺病毒载体,并观察其在H9C2心肌细胞中的转染效率。方法:利用聚合酶链反应(PCR)法钓取目的基因miRNA-327,并将目的基因与穿梭载体GV202连接形成miRNA-327腺病毒表达载体。经酶切及测序鉴定后,... 目的:构建含微小RNA-327(miRNA-327)基因的腺病毒载体,并观察其在H9C2心肌细胞中的转染效率。方法:利用聚合酶链反应(PCR)法钓取目的基因miRNA-327,并将目的基因与穿梭载体GV202连接形成miRNA-327腺病毒表达载体。经酶切及测序鉴定后,将构建的miRNA-327腺病毒表达载体与包装质粒共转染到人胚肾293细胞,再通过Cre/loxP重组酶系统以获得重组腺病毒,并对其进行扩增、纯化及滴度测定。最后将构建成功的重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞48h,并通过荧光显微镜以及流式细胞仪测定其转染效率。结果:双酶切与测序结果证明了大鼠miRNA-327腺病毒载体构建成功,且最终获得滴度为2×10^10PFU/ml的病毒液。转染心肌细胞48h后倒置荧光显微镜观察结果显示,腺病毒转染效率为90.15%±5.15%,流式细胞仪检测结果显示其转染效率为85.46%±3.08%。结论:成功构建了含miRNA-327基因的重组腺病毒载体,其在H9C2心肌细胞中具有较高的转染效率。 展开更多
关键词 腺病毒载体 微小RNA-327 心肌 转染 大鼠
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BC200在乳腺癌细胞系中的表达及其作用 预览
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作者 李晓锋 邹雪婷 +2 位作者 汪园园 张冠军 刘希 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第23期4151-4156,共6页
目的:探究长链非编码RNA BC200在不同侵袭力的人乳腺上皮细胞中的差异性表达,阐明BC200对人乳腺癌细胞迁移、增殖、侵袭及凋亡的生物学行为的影响。方法:通过实时定量PCR方法检测BC200在不同乳腺癌细胞系中的表达,通过慢病毒转染下调、... 目的:探究长链非编码RNA BC200在不同侵袭力的人乳腺上皮细胞中的差异性表达,阐明BC200对人乳腺癌细胞迁移、增殖、侵袭及凋亡的生物学行为的影响。方法:通过实时定量PCR方法检测BC200在不同乳腺癌细胞系中的表达,通过慢病毒转染下调、过表达BC200,比较各组细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的变化。结果:BC200在MDA-MB-453细胞中表达最高,在BT549细胞中表达最低。转染过表达BC200慢病毒的BT549细胞的增殖、迁移、侵袭能力高于对照组,细胞凋亡低于对照组;转染下调BC200慢病毒的MDA-MB-453细胞的增殖、迁移、侵袭能力低于对照组,细胞凋亡高于对照组。结论:BC200在乳腺癌细胞中呈异常过表达。过表达BC200的乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均增强并抑制凋亡,提示BC200在乳腺癌的发生发展中可发挥重要的促进作用。 展开更多
关键词 乳腺癌 BC200 迁移 转染 长链非编码RNA
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对氧磷酶3基因过表达对急性中毒小鼠肝损伤的保护作用及机制
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作者 伍洋 刘英 +1 位作者 刘济滔 尹德锋 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期179-184,共6页
目的探讨对氧磷酶3(PON3)对急性中毒肝损伤的保护作用及作用机制。方法将40只Balb/c小鼠随机分为4组,正常对照(NC)组、敌敌畏(DDVT)对照组、绿色荧光蛋白慢病毒(Lv-GFP)组和重组PON3慢病毒(Lv-PON3)组,每组10只。LV-GFP组和Lv-PON3组小... 目的探讨对氧磷酶3(PON3)对急性中毒肝损伤的保护作用及作用机制。方法将40只Balb/c小鼠随机分为4组,正常对照(NC)组、敌敌畏(DDVT)对照组、绿色荧光蛋白慢病毒(Lv-GFP)组和重组PON3慢病毒(Lv-PON3)组,每组10只。LV-GFP组和Lv-PON3组小鼠经尾静脉分别注射2×107TU的Lv-GFP、Lv-PON3慢病毒,3 d后腹腔注射敌敌畏(DDVT)溶液9 mg/kg,DDVT组只需腹腔注射同等剂量DDVT,NC组注射同等剂量生理盐水。各组于DDVT染毒后12 h麻醉处死10只小鼠取肝组织,ELISA法检测各组血清乙酰胆碱酯酶(ACh E)、肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)和肝组织氧化应激指标丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH),HE染色法观察肝组织形态学改变,Real-time PCR检测肝组织Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、血红蛋白加氧酶(HO-1)和转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2) mRNA的表达。结果与NC组比较,DDVT组和Lv-GFP组肝组织MDA、ALT、AST水平,HO-1和Nrf2 mRNA表达量明显升高,ACh E、CAT、SOD、GSH水平和Keap1 mRNA表达量均明显降低(P <0. 05)。与DDVT组比较,Lv-PON3组肝组织MDA、ALT、AST水平,Keap1 mRNA表达量降低,ACh E、CAT、SOD和GSH水平均明显著升高,HO-1和Nrf2 mRNA表达量显著上升(P<0. 05)。正常对照组肝细胞结构清晰,未出现肝细胞坏死和脂肪病变的情况,DDVT组和Lv-GFP组出现肝细胞坏死和脂肪变性等病理改变,Lv-PON3组肝脏病变组织肝细胞坏死和脂肪变性细胞数有一定的减少。结论PON3可通过Keap1-Nrf2/HO-1途径缓解氧化应激反应,改善肝功能,对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤有一定的保护作用。 展开更多
关键词 对氧磷酶3 急性中毒 肝损伤 氧化应激 转染 实时定量聚合酶链反应 小鼠
3种转染试剂对牛原代骨骼肌卫星细胞转染条件的优化 预览
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作者 陈明明 李燕 +5 位作者 张晓娟 张林林 李新 丁向彬 刘新峰 郭宏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期62-71,共10页
为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察... 为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及Hoechst 33342染色评价转染效率。结果表明,对于同一时期、同一转染试剂,pcDNA3.1-EGFP转染效果优于pEGFP-C1;不同转染试剂之间,Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染效果优于FuGENE HD。Lipofectamine 3000转染后分化72h肌管最明显,FuGENE HD次之,X-tremeGENE HP转染后细胞死亡较多。采用1.0μL Lipofectamine 3000、1.5μL Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染细胞后EGFP表达量极显著高于FuGENE HD (P<0.01),但这三者之间差异不显著(P>0.05)。细胞转染效率与EGFP定量结果基本一致,1.0、1.5μL Lipofectamine 3000转染效率较高,分别达26.07%和24.77%,极显著高于FuGENE HD(5.59%)和X-tremeGENE HP(10.87%)的转染效率(P<0.01),但二者之间无显著差异(P>0.05);X-tremeGENE HP的转染效率极显著高于FuGENE HD (P<0.01)。综合考虑转染试剂的用量、细胞毒性及经济效益,本试验初步认为牛原代骨骼肌卫星细胞转染宜采用Lipofectamine 3000,其与质粒DNA的比例为1∶1时转染效率最高。本试验结果可为原代细胞的转染提供重要的参考价值。 展开更多
关键词 牛原代骨骼肌卫星细胞 转染 LIPOFECTAMINE 3000 X-tremeGENE HP FuGENE HD
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pVAX-eNOS转染急性心肌梗死患者早期内皮祖细胞及对其活性的影响 预览
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作者 黄晓燕 王沙 +6 位作者 沈鑫 孙晶莹 董向辉 靳占奎 宋宝国 梁导艳 徐翠香 《中国医药导报》 CAS 2019年第11期9-13,I0001共6页
目的探讨利用pVAX1介导一氧化氮合酶(e NOS)基因体外转染急性心肌梗死患者(AMI)外周血早期内皮祖细胞(EPCs)的可行性。方法选择陕西省人民医院2017年12月~2018年6月因心脏病发病入院且经冠脉造影检查确诊为AMI患者30例。Ficoll密度梯度... 目的探讨利用pVAX1介导一氧化氮合酶(e NOS)基因体外转染急性心肌梗死患者(AMI)外周血早期内皮祖细胞(EPCs)的可行性。方法选择陕西省人民医院2017年12月~2018年6月因心脏病发病入院且经冠脉造影检查确诊为AMI患者30例。Ficoll密度梯度离心法分离患者空腹静脉外周血单个核细胞诱导培养至EPCs并鉴定,纯化pVAX-eNOS质粒。将EPCs分为3组,e NOS转染组:用阳离子聚合物JetPEITM体外转染eNOS基因至EPCs。转染后24 h,硝酸还原酶法检测EPCs中一氧化氮(NO)的含量,ELISA和Western blot检测EPCs分泌eNOS及血管内皮生长因子(VEGF)的能力;采用Wst-1法检测EPCs增殖情况,用Transwell小室检测各组EPCs迁移及黏附功能;空质粒转染组:只转染pVAX空质粒至EPCs中;对照组:不转染EPCs。结果成功转染pVAX-eNOS基因至AMI患者早期EPCs,转染后24 h,与空质粒转染组及对照组比较,NO含量明显升高(P <0.01),eNOS表达量明显增加(P <0.01),分泌VEGF的能力明显增强(P <0.01);EPCs增殖、迁移及黏附能力明显增加(P <0.01),空质粒转染组与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论阳离子聚合物JetPEITM可成功介导pVAX-eNOS有效转染AMI患者早期EPCs,并有效增强EPCs增殖、迁移、黏附及分泌功能,为AMI患者进行自体EPCs移植改善心肌缺血奠定了基础。 展开更多
关键词 pVAX-eNOS 内皮祖细胞 转染 急性心肌梗死
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lncRNA ASB16-AS1在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞增殖的影响 预览
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作者 石峰 唐青 魏晓为 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第10期1167-1172,共6页
目的:探讨lncRNAASB16-AS1在结直肠癌(CRC)中的表达及其对CRC细胞增殖的影响。方法:采用逆转录定量PCR(qRT-PCR)检测26对CRC及其配对癌旁组织、4株CRC细胞(HT-29、SW-480、SW-620及LOVO)中lncRNAASB16-AS1的表达,选择2株lncRNAASB16-AS... 目的:探讨lncRNAASB16-AS1在结直肠癌(CRC)中的表达及其对CRC细胞增殖的影响。方法:采用逆转录定量PCR(qRT-PCR)检测26对CRC及其配对癌旁组织、4株CRC细胞(HT-29、SW-480、SW-620及LOVO)中lncRNAASB16-AS1的表达,选择2株lncRNAASB16-AS1表达最高的CRC转染ASB16-AS1干扰片段作为干扰组,实验设置对照组(不转染)及阴性对照组(转染阴性对照干扰片段),采用CCK-8法检测转染0、24、48、72及96h时细胞的增殖情况,qRT-PCR法检测转染48h时细胞miR-185-5p表达;将含有ASB16-AS1野生型序列或突变序列的质粒与miR-185-5pmimic或阴性对照mimic共转染至293T细胞,转染24h后采用双荧光素酶法检测各组细胞的荧光强度,观察lncRNAASB16-AS1对miR-185-5的调控作用。结果:qRT-PCR结果显示,lncRNAASB16-AS1在CRC组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),CRC细胞HT-29及LOVO中lncRNAASB16-AS1的表达水平显著高于SW-480及SW-620(P<0.01);与阴性对照组比较,转染ASB16-AS1干扰片段的HT-29和LOVO细胞中lncRNAASB16-AS1的表达水平显著降低(P<0.01);转染48h开始,干扰组HT-29和LOVO细胞的增殖水平显著低于阴性对照组(P<0.05);转染48h时,下调ASB16-AS1后细胞中miR-185-5p表达水平显著升高(P<0.05);双荧光素酶结果显示,野生型ASB16-AS1和miR-185-5pmimic共转染,显著降低293T细胞中双荧光素酶的活性(P<0.05)。结论:CRC的发生发展的机制与lncRNAASB16-AS1上调有关。 展开更多
关键词 长链非编码RNA ASB16-AS1 结直肠癌 细胞 增殖 miR-185-5p 转染 双荧光素酶
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I1363T突变致人骨骼肌电压门控钠通道快失活受损的机制 预览
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作者 唐思阳 叶佳 李月舟 《浙江大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期12-18,共7页
目的:探究人源骨骼肌电压门控钠通道hNav1.4I1363T突变体导致患者出现先天性副肌强直症状的机制。方法:利用氨基酸序列比对,检测hNav1.4I1363位点的保守性;将hNav1.4蛋白的羧基端融合荧光蛋白mCherry,利用共聚焦显微镜观察hNav1.4野生型... 目的:探究人源骨骼肌电压门控钠通道hNav1.4I1363T突变体导致患者出现先天性副肌强直症状的机制。方法:利用氨基酸序列比对,检测hNav1.4I1363位点的保守性;将hNav1.4蛋白的羧基端融合荧光蛋白mCherry,利用共聚焦显微镜观察hNav1.4野生型与I1363T突变体蛋白的表达量与分布情况;通过全细胞电生理技术记录野生型与I1363T突变体的稳态激活及快失活参数,并进一步分析野生型与I1363T突变体的窗电流。结果:hNav1.4I1363位点在各类钠通道中高度保守。野生型与I1363T突变体均能正常上膜,且表达量无明显差异。野生型与I1363T突变体的50%激活电压V0.5分别为(-29.08±0.24)mV和(-28.79±0.21)mV,斜率因子k分别为5.06±0.21和4.73±0.18(均P>0.05);野生型与I1363T突变体的50%失活电压V0.5分别为(-68.03±0.34)mV和(-59.01±0.26)mV,斜率因子k分别为4.55±0.21和5.24±0.23(均P<0.05),I1363T突变体的失活电压向去极化方向移动,且更为平缓。I1363T突变体形成的窗电流大于野生型的窗电流。结论:I1363T突变会导致hNav1.4慢失活受损,增加肌肉细胞兴奋性,导致肌强直的发生;而增大的窗电流使得钠离子在细胞内缓慢聚集,最终导致细胞兴奋性下降,引发肌无力。 展开更多
关键词 骨骼肌/病理生理学 先天性肌强直/遗传学 基因表达 电压门控钠通道/遗传学 突变 转染
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过表达维A酸受体α减轻大鼠肾间质纤维化的机制
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作者 余雪云 覃远汉 +3 位作者 蒋玲 韦露明 潘竞 席志杨 《中华实用儿科临床杂志》 CSCD 北大核心 2019年第5期341-346,共6页
目的探讨过表达维A酸受体α(RARα)基因减轻大鼠肾间质纤维化(RIF)的分子机制。方法将40只6周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组、模型组、阴性对照组、转染组,每组10只。模型组大鼠分离并双重结扎左侧输尿管;假手术组大鼠不... 目的探讨过表达维A酸受体α(RARα)基因减轻大鼠肾间质纤维化(RIF)的分子机制。方法将40只6周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组、模型组、阴性对照组、转染组,每组10只。模型组大鼠分离并双重结扎左侧输尿管;假手术组大鼠不结扎输尿管;转染组和阴性对照组大鼠分别在建模的基础上转染携带过表达RARα基因的腺相关病毒和阴性对照病毒。2周末处死大鼠,取左肾组织进行病理学检查并计算RIF指数。采用免疫组织化学法检测肾组织Ⅳ型胶原蛋白(Col-Ⅳ)和纤维连接蛋白(FN)的表达,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测肾组织RARα、抗增殖蛋白(PHB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的mRNA和蛋白表达。结果1.与假手术组相比,模型组大鼠RIF指数显著升高,差异有统计学意义(22.81±2.43比2.34±0.55,q=24.94,P<0.05);模型组和阴性对照组大鼠RIF指数相比,差异无统计学意义(22.81±2.43比22.26±3.43,q=0.67,P>0.05),而转染组大鼠RIF指数显著降低,差异有统计学意义(14.06±2.99比22.81±2.43,q=10.66,P<0.05)。2.与假手术组相比,模型组大鼠肾组织RARα、PHB的mRNA和蛋白表达均显著降低,而TGF-β1的mRNA及蛋白表达,Col-Ⅳ和FN的表达均显著升高,差异均有统计学意义(mRNA:0.43±0.17比1.00±0.00,0.34±0.08比1.00±0.00,2.97±0.54比1.00±0.00,均P<0.05;蛋白:0.25±0.10比0.51±0.06,0.24±0.07比0.58±0.04,0.59±0.09比0.33±0.06,16.01±0.87比8.79±0.39,14.64±0.32比9.36±0.59,均P<0.05);模型组和阴性对照组大鼠肾组织RARα、PHB、TGF-β1的mRNA及蛋白表达,Col-Ⅳ和FN的表达比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);与模型组相比,转染组大鼠肾组织RARα、PHB的mRNA和蛋白表达均显著升高,而TGF-β1的mRNA及蛋白表达、Col-Ⅳ和FN的表达均显著降低,差异均有统计学意义(mRNA:0.86±0.07比0.43±0.17,0.89±0.11比0.34±0.08,1.65±0.28比2.97±0.54,均P<0.05;蛋白:0.40±0.07比0.25±0.10,0.45±0.10比0 展开更多
关键词 维A酸受体α 抗增殖蛋白 肾间质纤维化 转染
稳定过表达环状RNA circ-Fam114a2膀胱癌T24细胞株的建立 预览
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作者 王敬梓 韩杰 +5 位作者 于浩 周锐 卢泓成 杨潇 李鹏超 吕强 《现代泌尿外科杂志》 CAS 2019年第6期474-479,共6页
目的利用慢病毒载体建立稳定过表达环状RNAcirc-Fam114a2的膀胱癌T24细胞株。方法利用pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP-Puro质粒,制备慢转录病毒pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP-Puro-circ-Fam114a2(circ-Fam114a2)和pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP... 目的利用慢病毒载体建立稳定过表达环状RNAcirc-Fam114a2的膀胱癌T24细胞株。方法利用pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP-Puro质粒,制备慢转录病毒pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP-Puro-circ-Fam114a2(circ-Fam114a2)和pLVX-CMV-minicrRNA-EF1-GFP-Puro-Vector(Vector),并转染膀胱癌T24细胞系。用嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,并用荧光显微镜,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Northern印记等实验验证circ-Fam114a2基因成环及过表达情况。最后,通过CCK-8实验和克隆形成实验初步探究circ-Fam114a2对T24细胞增殖的影响。结果转染并用嘌呤霉素药筛后的T24细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。qRT-PCR显示过表达组细胞circ-Fam114a2水平是对照组的28倍,而Fam114a2mRNA没有明显变化。Northern印迹显示circ-Fam114a2在T24细胞中成功成环并过表达。CCK-8实验和克隆形成实验表明过表达circ-Fam114a2显著抑制T24细胞增殖。结论该实验成功建立了稳定高表达circ-Fam114a2的膀胱癌T24细胞模型,并初步探究circ-Fam114a2对膀胱癌细胞的增殖抑制作用。为进一步研究circ-Fam114a2在膀胱癌中的作用和机制奠定了基础。 展开更多
关键词 circ-Fam114a2 环状RNA 转染 膀胱癌
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人Annexin A2基因真核表达的构建及活性 预览
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作者 边帅 王佳雯 +3 位作者 赵月 李芳宇 赵大庆 王泽玉 《科学技术与工程》 北大核心 2019年第16期82-86,共5页
为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒... 为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。 展开更多
关键词 ANNEXIN A2 质粒构建 转染 抗凋亡作用
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尼罗罗非鱼TRAF4基因的克隆、表达及功能分析
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作者 韩雪晴 高风英 +5 位作者 卢迈新 刘志刚 曹建萌 王淼 衣萌萌 张德锋 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期381-392,共12页
肿瘤坏死因子受体相关因子4 (tumor necrosis factor receptor associated factors 4, TRAF4)是TRAFs家族中比较特殊的一员,生物学功能较多且较复杂。为了明确TRAF4基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫过程中的作用,本研究首... 肿瘤坏死因子受体相关因子4 (tumor necrosis factor receptor associated factors 4, TRAF4)是TRAFs家族中比较特殊的一员,生物学功能较多且较复杂。为了明确TRAF4基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫过程中的作用,本研究首先通过反转录PCR和分段扩增获得尼罗罗非鱼TRAF4基因c DNA (GenBank No. MH986338)及基因组序列,并进行基因和蛋白质结构等生物信息学分析;然后利用qRT-PCR技术检测该基因在健康个体中的组织表达、受精后不同发育阶段的表达以及人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后的表达特征;最后构建重组真核表达载体,分析TRAF4在人胚肾细胞293T中的亚细胞定位及其在Nuclear factorκB (NF-κB)通路中的作用。结果显示,TRAF4基因的cDNA序列为4 483 bp,开放阅读框为1 413 bp,可编码470个氨基酸。基因组序列分析发现,TRAF4基因含7个外显子和6个内含子。氨基酸序列分析发现,TRAF4存在1个环指(RING-finger)结构域、3个TRAF类型的锌指(zinc-finger)结构域、1个甲基多巴和TRAF同源物(meprin and TRAF-homology, MATH)结构域。组织分析表明,TRAF4基因在所检测的11个组织/器官中均有表达,脑中表达最高,脾中表达最低;该基因在受精后不同发育阶段均有表达。人工感染无乳链球菌后,尼罗罗非鱼TRAF4基因在肠、鳃、脾、肾和血液中的表达量均发生不同程度的变化,在鳃和血液中显著升高,在肠和肾中的表达量均低于对照组(0 h组)。亚细胞定位和双荧光素酶报告分析显示,TRAF4在293T细胞中主要定位于细胞质,可增强NF-κB活性。综上所述,TRAF4基因在尼罗罗非鱼的免疫应答中发挥重要作用,本研究为深入探讨TRAF4基因在罗非鱼抗感染免疫中的作用机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子4基因(TRAF4) 尼罗罗非鱼 基因表达 转染
选择性上调pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞增殖及α平滑肌肌动蛋白、纤维酶原激活物抑制剂⁃1和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 预览
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作者 徐媛媛 闻广华 +1 位作者 张冲 杨雁 《安徽医药》 CAS 2019年第12期2351-2355,共5页
目的观察选择性上调pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞(LX⁃2)增殖及α平滑肌肌动蛋白(α⁃SMA)、纤维酶原激活物抑制剂⁃1(PAI⁃1)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen⁃Ⅰ)表达的影响。以进一步探究pSmad 3C/3L在肝纤维化进展中的作用机制。方法采用脂质... 目的观察选择性上调pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞(LX⁃2)增殖及α平滑肌肌动蛋白(α⁃SMA)、纤维酶原激活物抑制剂⁃1(PAI⁃1)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen⁃Ⅰ)表达的影响。以进一步探究pSmad 3C/3L在肝纤维化进展中的作用机制。方法采用脂质体转染的技术(FuGENE®HD)向LX⁃2细胞转染野生型Smad3基因(Smad3 WT)、Smad3连接区磷酸化位点突变的基因(Smad3 EPSM)及Smad3 C末端磷酸化位点突变的基因(Smad33S⁃A)3种质粒,选择性上调LX⁃2细胞中pSmad 3C/3L的表达水平,以蛋白质印迹法(Western Blot)验证转染效率并检测LX⁃2细胞中α⁃SMA、PAI⁃1和Collagen⁃Ⅰ的蛋白表达水平。MTT法检测选择性上调pSmad 3C/3L对LX⁃2细胞增殖能力的影响。结果转化生长因子⁃β1(TGF⁃β1)刺激1 h后,与LX⁃2对照组相比,转染3种质粒组Smad3蛋白表达水平均升高[(0.48±0.02),(0.57±0.03),(0.60±0.02),(0.59±0.03);P<0.05];与Smad3 WT组相比,转染Smad3 EPSM质粒组pSmad3C蛋白表达水平明显升高[(0.33±0.02)比(0.44±0.01),P<0.05],转染Smad33S⁃A质粒组pSmad3L蛋白表达水平明显升高[(0.36±0.01)比(0.42±0.02),P<0.05]。MTT结果显示,转染Smad3 EPSM质粒可抑制LX⁃2细胞增殖,而转染Smad33S⁃A质粒可促进LX⁃2细胞的增殖[吸光度值(0.48±0.03)比(0.93±0.05),P<0.05]。TGF⁃β1刺激12 h后,α⁃SMA、PAI⁃1和Collagen⁃Ⅰ在3种质粒转染组中呈现出差异表达(P<0.05)。结论转染3种质粒成功地选择性上调了LX⁃2细胞中pSmad 3C/3L的表达,选择性高表达pSmad3L可进一步促进TGF⁃β1诱导的细胞增殖反应、促进α⁃SMA、PAI⁃1和Collagen⁃Ⅰ的表达,选择性高表达pSmad3C可抑制细胞增殖反应、降低α⁃SMA、PAI⁃1和Collagen⁃Ⅰ的表达;提示TGF⁃β1诱导的Smad3不同位点磷酸化在LX⁃2细胞增殖和α⁃SMA,PAI⁃1,Collagen⁃Ⅰ蛋白表达的调控中发挥重要作用,为肝纤维化的逆转提供了新思路。 展开更多
关键词 肝硬化 肝星状细胞 质粒 转染 Smad3蛋白质 转化生长因子Β 脂质体 细胞增殖 印迹法 蛋白质
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CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响 预览
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作者 赵俐婷 王乃宁 +1 位作者 贺芳 张燕 《安徽医药》 CAS 2019年第12期2361-2365,共5页
目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,... 目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2⁃MGP⁃gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293⁃T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP mRNA及蛋白表达水平。qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2⁃MGP⁃gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP⁃gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05)。qPCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2⁃MGP⁃gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。 展开更多
关键词 基因敲除技术 骨钙素 破骨细胞 转染 CRISPR/Cas 9 RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)
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