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SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响 预览
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作者 宁越 米雪 +2 位作者 陈星伊 邵建航 昝林森 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1818-1829,共12页
[目的]为了探索秦川牛(Bos taurus)SMAD1 基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为 BMP 信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论... [目的]为了探索秦川牛(Bos taurus)SMAD1 基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为 BMP 信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。[方法]根据 Genbank 牛 SMAD1(NM_001077107.2)已知序列设计并合成靶向沉默 SMAD1 基因的干扰序列 siSMAD1和阴性对照 siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞 cDNA 为模板,利用 PCR 技术克隆获得 SMAD1 基因 CDS 序列,构建腺病毒过表达穿梭载体 pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到 HEK 293 细胞中,通过 Cre-loxp 重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为 AD-bSMAD1,重组质粒 pDC316-EGFP 标记为 AD-NC,用做对照组病毒,利用 LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列 siSMAD1和过表达腺病毒 AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量 PCR 检测 SMAD1 基因和成肌标志基因 MyoD、Myf5、MyoG的 mRNA 水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。[结果]成功获得了 1 条能有效沉默 SMAD1 基因 siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1 基因分别下调了 75.4%(诱导 1d,P<0.01)、66.7%(诱导 3d,P<0.01)、60.0%(诱导 6d,P<0.01)、54.7%(诱导 9d,P<0.01)。此外,还成功构建了秦川牛 SMAD1 基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10^10pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞 0、1、3、6、9d 后,与对照组相比,SMAD1 基因的表达水平分别上调了 2.10 倍(诱导 1d)、3.19 倍(诱导 3d)、105.3 倍(诱导 3d),P<0.01)和 144 倍(诱导 9d,P<0.01);结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1 基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基� 展开更多
关键词 SMAD1基因 RNAI 腺病毒载体 原代成肌细胞 肌管形成 秦川牛
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绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析 预览
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作者 田志龙 汤继顺 +4 位作者 孙庆 王玉琴 张效生 张金龙 储明星 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期755-766,共12页
【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD ... 【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式,并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系,以揭示其影响产羔数的机制,为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先,采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑,小脑,下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肾上腺,甲状腺,大肠,小肠,胰腺,瘤胃,肾脂19种组织的表达模式,然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY?SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊(n=380)、湖羊(n=101)、苏尼特羊(n=21)、草原型藏羊(n=161)、策勒黑羊(n=52)、滩羊(n=22)6个绵羊品种中进行基因型检测,计算其群体遗传学指标,利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示,SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达,在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体(P<0.01),小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体(P<0.05);基因分型结果表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A和g.12487190G>T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著(P<0.05);而g.12508874T>C和g.12487467A>G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著(P>0.05);群体遗传学分析表明,g.12485895A>G、g.12487558G>A、g.12508874T>C、g.12487467A>G、g.12487190G>T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特 展开更多
关键词 绵羊 SMAD1基因 组织表达 SNP分型 产羔数
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牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建 被引量:1
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作者 牛家强 索朗斯珠 +6 位作者 徐业芬 王玉恒 商鹏 强巴央宗 郭敏 席广银 赵良栋 《中国农业大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期52-59,共8页
为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3... 为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。 展开更多
关键词 牦牛 bta-miR-1434-5p Smad1基因 组织表达谱 载体构建
Smad1基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢中的表达规律研究
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作者 李兰兰 栾兆进 +3 位作者 刘开东 王国义 柳楠 贺建宁 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2017年第11期93-96,294共5页
为了探索Smad1mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中... 为了探索Smad1mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中该基因蛋白的表达,并进行图像分析。结果表明:发情期Smad1基因表达量最高,极显著高于其他三个时期(P〈0.01);发情前期Smad1基因表达量显著高于乏情期和发情间期(P〈0.05)。在绵羊不同发情时期Smad1蛋白主要表达于乏情期原始卵泡、次级卵泡的颗粒细胞、发情问期次级卵泡的卵泡膜细胞,在发情前期与发情期卵泡中未见表达。卵巢中Smad1基因可能促进黄体溶解,对卵泡发育、卵子的成熟以及释放起作用,与绵羊发情的启动有一定关系。 展开更多
关键词 敖汉细毛羊 卵巢 Smad1基因 实时荧光定量PCR 免疫组化
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