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VD通过VDR下调β-catenin磷酸化水平抑制胃癌细胞增殖
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作者 胡倩 杜超 +1 位作者 董辉 张秉强 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2019年第7期1356-1364,共9页
为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉... 为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉素筛选建立shVDR稳定株,应用CCK8及细胞集落形成实验,流式细胞学实验, Western blot实验检测VD/VDR在两种胃癌细胞恶性表型增殖及细胞周期中的作用;最后再次应用Western blot实验检测VD/VDR对胃癌细胞中β-catenin磷酸化表达水平的影响。结果表明两种胃癌细胞均表达VDR;在配体骨化三醇(1α,25(OH)2D3)存在的情况下,胃癌细胞的增殖和集落形成受到明显抑制,同时抑制β-catenin的磷酸化水平,但对细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1无明显作用。下调VDR的表达水平后, VD对β-catenin磷酸化表达水平无明显影响。证实VDR通过下调β-catenin的磷酸化水平,发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。 展开更多
关键词 维生素D受体 维生素D Β-CATENIN 胃癌细胞 集落形成 shRNA
大黄素联合survivin短发夹RNA对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响 预览
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作者 祖聪 秦光远 郑新宇 《中华乳腺病杂志(电子版)》 CAS CSCD 2019年第3期137-144,共8页
目的探讨大黄素与survivin短发夹RNA(shRNA)联合应用对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响。方法先用MTT法检测不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)大黄素对人乳腺癌细胞株MCF-7生长抑制的影响,为后续联合用药实验筛选出适宜浓度(40μmol/L... 目的探讨大黄素与survivin短发夹RNA(shRNA)联合应用对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响。方法先用MTT法检测不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)大黄素对人乳腺癌细胞株MCF-7生长抑制的影响,为后续联合用药实验筛选出适宜浓度(40μmol/L)的大黄素。然后,将人乳腺癌细胞株MCF-7分为以下5组:空白对照组,细胞未做任何处理;阴性对照组,即NC shRNA组,加入空载质粒;大黄素处理组,用40μmol/L大黄素处理细胞;survivin shRNA处理组,转染survivin shRNA质粒;联合处理组,用40μmol/L大黄素与survivin shRNA联合处理细胞。利用MTT法、流式细胞术分别检测各组细胞的增殖(用吸光度值表示)和凋亡能力,用real-time PCR及蛋白质印迹法(Western blot法)分别检测细胞中survivin的mRNA和蛋白表达。由于细胞增殖活性检测结果显示空白对照组与阴性对照组差别不显著,故流式细胞术中不再设置阴性对照组。多组细胞间凋亡率及survivin的mRNA和蛋白表达量比较采用单因素方差分析,吸光度值比较采用重复测量的方差分析,组间两两比较采用LSD法。结果 MTT法显示,不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)大黄素作用24、48、72 h后,各组细胞间吸光度值比较,差异有统计学意义(F=1 873.565,P<0.001),并且,40μmol/L大黄素对细胞增殖的抑制率为(53.6±1.2)%(>50.0%),因此选择该浓度进行后续实验。用不同方法处理细胞24、48、72 h后,空白对照组、阴性对照组、大黄素处理组、survivin shRNA处理组及联合处理组细胞的吸光度值比较,差异有统计学意义(F=1 686.953,P<0.001),不同时间点间细胞吸光度值的差异也有统计学意义(F=288.790,P<0.001),分组与时间点存在交互作用(F=67.916,P<0.001)。流式细胞检测结果显示:空白对照组、大黄素处理组、survivin shRNA处理组和联合处理组细胞凋亡率分别为(0.57±0.10)%、(5.96±0.56)%、(9.00±0.73)%和(18.33±0.98)%,4组比较,差异有统计学意� 展开更多
关键词 乳腺肿瘤 大黄素 SURVIVIN SHRNA 细胞增殖
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GNB2L1对恶性黑素瘤细胞增殖和迁移的影响 预览
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作者 郑舒丹 程诗萌 +3 位作者 董亚兵 李孟森 刘天一 朱宁文 《中国美容医学》 CAS 2019年第6期59-63,共5页
目的:探讨支架蛋白重组人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白beta多肽2样蛋白1(guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1,GNB2L1)对小鼠恶性黑素瘤B16F10细胞增殖和迁移的影响。方法:用靶向GNB2Ll的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh... 目的:探讨支架蛋白重组人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白beta多肽2样蛋白1(guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1,GNB2L1)对小鼠恶性黑素瘤B16F10细胞增殖和迁移的影响。方法:用靶向GNB2Ll的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒液和空载体慢病毒液感染恶性黑素瘤B16F10细胞,分别获得稳定感染细胞株B16F10-GNB2L1-shRNA(阳性实验组)和B16F10-NC(阴性对照组),未感染病毒液的细胞株B16F10设为空白对照组。Western blot检测GNB2Ll以及上皮间质转化标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达水平;CCK-8检测细胞的增殖能力;划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:与B16F10和B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA中GNB2Ll蛋白表达水平明显下调;GNB2L1敲降可明显抑制B16F10细胞的增殖和划痕迁移能力;Western blot特异性抗体检测发现GNB2L1敲降的细胞中N-cadherin的蛋白表达水平明显降低,而E-cadherin的蛋白表达水平明显升高。结论:下调GNB2Ll蛋白表达可有效抑制恶性黑素瘤B16F10细胞的增殖和迁移能力。 展开更多
关键词 GNB2Ll 恶性黑素瘤 SHRNA 上皮间质转化 增殖 迁移
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靶向沉默TrkB基因对结肠癌细胞SW620失巢凋亡水平的影响 预览
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作者 祁麟 齐春胜 肖波 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第6期561-565,共5页
目的在结肠癌细胞SW620中靶向沉默神经营养因子酪氨酸激酶受体B(TrkB)基因以探讨其对肿瘤细胞的失巢凋亡水平的影响。方法构建TrkB慢病毒干扰载体,使用TrkB-shRNA慢病毒感染SW620细胞,利用实时定量PCR和Westernblot法分别检测TrkB基因在... 目的在结肠癌细胞SW620中靶向沉默神经营养因子酪氨酸激酶受体B(TrkB)基因以探讨其对肿瘤细胞的失巢凋亡水平的影响。方法构建TrkB慢病毒干扰载体,使用TrkB-shRNA慢病毒感染SW620细胞,利用实时定量PCR和Westernblot法分别检测TrkB基因在mRNA和蛋白水平表达量的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测下调TrkB基因表达后贴壁和悬浮生长状态下细胞失巢凋亡率的变化。结果成功构建TrkB-shRNA慢病毒干扰载体,获得SW620-iTrkB稳定感染细胞系。与SW620-iLuc对照组相比,转染SW620-iTrkB细胞中TrkB基因的mRNA和蛋白相对表达水平均降低(P<0.05)。不同生长状态和不同转染质粒转染均对SW620-iTrkB细胞的失巢凋亡水平有影响,存在交互效应(P<0.05)。与贴壁状态相比,悬浮状态下SW620-iLuc组和SW620-iTrkB组细胞凋亡率均明显上升(P<0.05);在悬浮状态下,SW620-iTrkB组细胞凋亡率明显高于SW620-iLuc组(P<0.05)。结论慢病毒载体介导的TrkB-shRNA能在结肠癌细胞SW620中产生特异性的基因沉默效应,显著增加细胞的失巢凋亡水平。 展开更多
关键词 受体蛋白质酪氨酸激酶类 失巢凋亡 基因沉默 肿瘤转移 SHRNA
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敲减CDKL5对人胶质母细胞瘤细胞生长和细胞周期的影响 预览
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作者 张惊宇 丁婧 +4 位作者 郑永慧 初婷婷 赵琳琳 杨滨瑞 高腾 《中风与神经疾病杂志》 CAS 2019年第12期1083-1085,共3页
目的探讨敲减周期蛋白依赖型激酶样5(cyclin-dependent kinase-like 5,CDKL5)对人胶质母细胞瘤细胞生长和细胞周期的影响,为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。方法本研究使用人胶质母细胞瘤细胞U87,使用慢病毒感染的方法敲减CDKL5基因。利... 目的探讨敲减周期蛋白依赖型激酶样5(cyclin-dependent kinase-like 5,CDKL5)对人胶质母细胞瘤细胞生长和细胞周期的影响,为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。方法本研究使用人胶质母细胞瘤细胞U87,使用慢病毒感染的方法敲减CDKL5基因。利用Western blot显示CDKL5的细胞定位以及特异性的小发卡RNA敲减效率。使用血细胞计数法绘制4 d U87的细胞生长曲线,同时利用MTT检测细胞活性。使用流式细胞仪技术检测细胞周期。结果在U87人胶质母细胞瘤细胞中,CDKL5在细胞核和细胞质当中都有表达,我们发现使用shRNA敲减CDKL5后,胞质中的CDKL5显著减少,细胞形态也发生明显改变。敲减CDKL5同时抑制人胶质母细胞瘤细胞的体外增,引起细胞周期停滞。结论敲减CDKL5可以显著抑制人胶质母细胞瘤细胞增殖,引起细胞周期停滞,为人胶质母细胞瘤的治疗提供了一个新的理论方法。 展开更多
关键词 CDKL5 人胶质母细胞瘤细胞 SHRNA 细胞生长 细胞周期
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猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响 预览
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作者 佘春 张艳 +3 位作者 张彩玉 尹桂军 石德顺 李湘萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期782-791,共10页
试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序... 试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1404bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。 展开更多
关键词 SMYD3基因 SHRNA 猪成纤维细胞 细胞增殖
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PIWIL1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 预览
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作者 张淑君 单梦圆 +2 位作者 翟羽佳 李闯 季丙元 《济宁医学院学报》 2019年第2期117-121,共5页
目的 PIWIL1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞增殖活性的影响,为乳腺癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对PIWIL1 mRNA 序列设计合成siRNA并筛选最佳siRNA,构建pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/PIWIL1RNAi和pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/Non R... 目的 PIWIL1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞增殖活性的影响,为乳腺癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对PIWIL1 mRNA 序列设计合成siRNA并筛选最佳siRNA,构建pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/PIWIL1RNAi和pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/Non RNAi重组质粒;将重组质粒导入乳腺癌MCF-7细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株;实验分为脂质体对照组、阴性质粒转染对照组(阴性对照组)及PIWIL1-shRNA重组质粒转染组(PIWIL1-shRNA组),实时荧光定量PCR 法检测PIWIL1 Mrna 表达水平的变化,Western blot检测细胞中PIWIL1蛋白表达,CCK-8检测干扰质粒对MCF-7细胞增殖活性的影响。结果荧光显微镜检测显示稳定表达重组质粒pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi的乳腺癌MCF-7细胞株筛选成功,其PIWIL1 Mrna抑制率(74%)明显高于阴性对照组(5.4%),PIWIL1-shRNA组细胞PIWIL1蛋白表达水平显著低于脂质体对照组和阴性对照组细胞, MCF-7细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论重组质粒pGCsilencer TM H1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi可抑制乳腺癌细胞中PIWIL1基因的表达,进而降低细胞活性。 展开更多
关键词 SHRNA PIWIL1 乳腺癌 MCF-7细胞株
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小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定 预览
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作者 陈风雷 胡佳慧 +3 位作者 戴安娜 刘婉洋 屈玉杏 许显玉 《动物医学进展》 北大核心 2019年第11期28-35,共8页
针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别... 针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10^7 TU/mL~10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%~90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 展开更多
关键词 内质网氧化还原酶1α 慢病毒载体 SHRNA
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慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
shRNA干扰Nod样受体蛋白在新生大鼠脑缺血再灌注模型中的作用及机制 预览
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作者 穆清 杨丹丹 +1 位作者 杨盛 张志良 《成都医学院学报》 CAS 2019年第5期562-568,共7页
目的探究shRNA(short hairpin RNA)干扰Nod样受体蛋白(NLRP3)对新生大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)的心肌损伤和免疫反应的作用及机制。方法构建新生大鼠MCAO,实验分4组:假手术组、模型组(MCAO组)、MCAO+阴性对照组和MCAO+sh-NLRP3组,每组1... 目的探究shRNA(short hairpin RNA)干扰Nod样受体蛋白(NLRP3)对新生大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)的心肌损伤和免疫反应的作用及机制。方法构建新生大鼠MCAO,实验分4组:假手术组、模型组(MCAO组)、MCAO+阴性对照组和MCAO+sh-NLRP3组,每组10只。采用RT-PCR和蛋白质印迹技术(Western blot)检测NLRP3表达;HE染色观察心肌组织病理学改变;免疫组化检测Ki67表达;Western blot 检测Ki67和PCNA表达;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡率;Western blot检测心肌细胞Caspase-3、Caspase-9 表达;Elisa检测Mb、 CK-MB 和cTnⅠ含量及心肌炎标记分子IL-1β、iNOS、IL-6表达;Western blot检测TGF-β1、NF-κB p65和TNF-α表达。结果 sh-NLRP3 能抑制模型大鼠NLRP3在基因和蛋白水平上的表达( P <0.01),改善心肌坏死,上调心肌组织中Ki67和PCNA表达( P < 0.01),降低心肌细胞凋亡率( P <0.01)和Caspase-3、Caspase-9 的蛋白表达( P <0.01),降低大鼠血清中Mb、cTnⅠ和CK-MB的含量( P <0.01),同时下调TGF-β1、P-P65/P65和TNF-α的蛋白表达。结论 sh-NLRP3对MCAO新生大鼠的心肌损伤和免疫反应起保护作用,其机制与抑制 TGF-β1/NF-κB p65/TNF-α炎症通路活化相关。 展开更多
关键词 SHRNA Nod样受体蛋白 脑缺血再灌注模型
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PTEN shRNA慢病毒载体构建及转染人子宫腺肌病细胞的稳定细胞株筛选
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作者 郭宇丹 曾玉燕 +1 位作者 姜心禅 李坤寅 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期990-995,共6页
目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(ade... 目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(adenomyosis,AM)细胞后筛选最优稳转株。方法设计合成3条特异性针对人PTEN基因的shRNA序列,构建到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中,测序鉴定载体构建情况,进而包装病毒并检测滴度。筛选出最优感染复数(multiplicity of infection,MOI)、嘌呤霉素杀灭浓度后,用慢病毒液转染AM细胞,以嘌呤霉素药筛建立PTEN敲低的稳定细胞株,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后细胞内PTEN mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测PTEN蛋白表达水平,以检验转染效率并筛选出干扰效率最佳的shRNA序列。结果成功构建了3个PTEN shRNA慢病毒载体,包装后以MOI为50转染AM细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达明显,嘌呤霉素持续药筛建立了PTEN敲低的稳定细胞株,以PTEN shRNA3慢病毒载体的干扰效率最佳(92.98%)。结论成功构建了PTEN shRNA慢病毒载体,并在体外有效转染了AM细胞,建立了PTEN敲低的稳定细胞株。 展开更多
关键词 子宫腺肌病 慢病毒 PTEN SHRNA 稳定细胞株
家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证 预览
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作者 夏欢 邹声雷 +3 位作者 李超程 安洪勇 刘明达 贾斌 《现代畜牧兽医》 2019年第5期14-19,共6页
研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试... 研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。 展开更多
关键词 Zfx基因 SHRNA PLL 3.7慢病毒骨架载体
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shRNA干扰GINS2基因对甲状腺癌细胞增殖的影响 预览
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作者 朴民采 何赛飞 +2 位作者 宋雅楠 张苗 赵滨 《肿瘤药学》 CAS 2019年第1期45-50,共6页
目的 探讨GINS2在甲状腺癌中的表达及其对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过基因干扰技术抑制甲状腺癌K1和SW579细胞中的GINS2的表达。采用Real-time PCR、Western blot检测细胞中GINS2 mRNA和蛋白的表达水平。采用MTT法和流式... 目的 探讨GINS2在甲状腺癌中的表达及其对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过基因干扰技术抑制甲状腺癌K1和SW579细胞中的GINS2的表达。采用Real-time PCR、Western blot检测细胞中GINS2 mRNA和蛋白的表达水平。采用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果 干扰GINS2后,K1和SW579细胞GINS2mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);实验组K1和SW579细胞的增殖受到显著抑制(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.01)。K1细胞的细胞周期发生显著改变,但SW579细胞的细胞周期未发生显著改变。结论 GINS2在甲状腺癌细胞中高表达,下调GINS2表达可抑制甲状腺癌细胞增殖并促进其凋亡。GINS2可能是甲状腺癌诊断或预后的潜在生物标志物及治疗靶点。 展开更多
关键词 甲状腺癌 GINS2 RNA干扰 SHRNA
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山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响 预览
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作者 凌英会 朱露 +5 位作者 吴昊 陈青 权青 刘勇 李文雍 张运海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1690-1698,共9页
研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果,... 研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P<0.05);过表达FST显著(P<0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P<0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 FST基因 卵巢卵泡颗粒细胞 慢病毒载体 SHRNA 过表达载体 细胞增殖
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重组乳酸乳球菌不同途径发送shRNA抗肿瘤的研究
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作者 得丽扎尔·热合曼 刘丹 +1 位作者 孙素荣 李轶杰 《生物技术》 CAS 2019年第5期478-484,共7页
[目的]比较重组乳酸乳球菌不同途径发送HPV16E7 shRNA的抗肿瘤效果。[方法]通过实时定量PCR技术筛选出抑制Si Ha细胞中E7基因表达的shRNA片段并构建至乳酸乳球菌质粒p MG36e-RFP中。PCR鉴定获得重组乳酸乳球菌正确后分别通过滴鼻、静脉... [目的]比较重组乳酸乳球菌不同途径发送HPV16E7 shRNA的抗肿瘤效果。[方法]通过实时定量PCR技术筛选出抑制Si Ha细胞中E7基因表达的shRNA片段并构建至乳酸乳球菌质粒p MG36e-RFP中。PCR鉴定获得重组乳酸乳球菌正确后分别通过滴鼻、静脉注射和瘤内注射途径发送到C57BL/6小鼠体内后,检测荷瘤小鼠的生存周期及体内肿瘤的生长大小。[结果]成功构建针对HPV16E7的shRNA干扰表达的重组乳酸乳球菌,肿瘤注射后32 d,鼻腔发送途径组小鼠肿瘤大小约为6. 49±1. 60 cm3,静脉注射组肿瘤大小为4. 49±1. 16 cm3,瘤内注射组肿瘤大小为1. 89±0. 52 cm3,至肿瘤注射60d时,瘤内注射组有3只存活。[结论]瘤内和静脉注射表达shRNA重组乳酸乳球菌均能抑制小鼠体内肿瘤的生长,其中瘤内途径优于静脉注射。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 人乳头瘤病毒 RNA干涉技术 SHRNA 抗肿瘤
晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2基因的RNA干扰慢病毒载体的构建及其对巨噬细胞中炎性因子分泌的影响
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作者 伍婷 徐方明 +3 位作者 苏丛 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 2019年第10期605-609,共5页
目的构建针对晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2(late endosomal/lysosomal adaptor,mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 2,lamtor2)基... 目的构建针对晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2(late endosomal/lysosomal adaptor,mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 2,lamtor2)基因的小发夹RNA慢病毒载体,探讨RNA干扰lamtor2基因表达后对肺炎克雷伯菌感染引起的巨噬细胞中炎性因子分泌的调控作用.方法针对小鼠lamtor2基因设计2对小发夹RNA(shlamtor2),重组构建慢病毒载体pLKO.1-puro shlamtor2,并感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞.设2个实验组,pLKO.1-puro shlamtor2-1感染组(sh1组)和pLKO.1-puro shlamtor2-2感染组(sh2组),以空载pLKO.1质粒感染RAW264.7细胞为对照组.通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中lamtor2基因表达.肺炎克雷伯菌感染sh2组细胞,采用实时定量PCR方法检测细菌感染后细胞内白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达水平的变化.2组间比较采用t检验.结果重组慢病毒颗粒pLKO.1-shlamtor2感染RAW 264.7细胞后,对照组lamtor2基因mRNA相对表达量为1.000±0.000,sh1组为0.596±0.125,sh2组为0.120±0.080,sh2组的lamtor2表达量低于sh1组,差异有统计学意义(t=3.399,P=0.015),且sh1组和sh2组的表达量均低于对照组,差异均有统计学意义(t=3.333、9.734,均P<0.05).以肺炎克雷伯菌感染的野生RAW 264.7细胞作为对照,sh2组细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β(t=15.20)、IL-6(t=43.30)和TNF-α(t=12.67)表达水平均高于对照组(均P<0.01).结论针对lamtor2基因的小发夹RNA可通过RNA干扰机制稳定下调巨噬细胞中lamtor2基因的表达,基因下调对感染了肺炎克雷伯菌的巨噬细胞内的炎性因子的分泌有明显的促进作用. 展开更多
关键词 巨噬细胞 克雷伯菌 肺炎 基因沉默 shRNA
构建干扰多梳状蛋白2的人胶质瘤U251细胞系 预览
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作者 王菲 高永英 +4 位作者 武艳玮 徐丽珲 马杰 刘焕 曹相玫 《宁夏医科大学学报》 2019年第6期556-560,共5页
目的建立稳定干扰多梳状蛋白2(polycomb like 2,PCL2)的人胶质瘤U251细胞系。方法针对PCL2基因的shRNA克隆至miR30前体骨架shRNA表达载体,用PCR鉴定载体构建成功后转入HEK293细胞,得到重组腺病毒Ad5-E1-AmU6-PCL2 shRNA-E3-CMV-eGFP;将... 目的建立稳定干扰多梳状蛋白2(polycomb like 2,PCL2)的人胶质瘤U251细胞系。方法针对PCL2基因的shRNA克隆至miR30前体骨架shRNA表达载体,用PCR鉴定载体构建成功后转入HEK293细胞,得到重组腺病毒Ad5-E1-AmU6-PCL2 shRNA-E3-CMV-eGFP;将重组腺病毒转染至U251细胞中,分组为空白对照组、空载体组和PCL2 shRNA组,滴度梯度设置为MOI(20∶1,50∶1,100∶1),使用荧光显微镜观察腺病毒感染效率;用Western blot检测U251细胞内shRNA PCL2表达载体的基因沉默效率。结果使用小RNA干扰技术,成功构建了表达PCL2 shRNA的重组腺病毒;荧光显微镜观察发现MOI(50∶1)时,U251细胞感染效率最高,细胞生长状态良好。Western blot结果显示PCL2 shRNA重组腺病毒组的PCL2蛋白水平较空白对照组和空载体组明显降低,以100∶1时的PCL2表达量最低,干扰效果最显著。结论成功构建的PCL2 shRNA重组腺病毒能够在体外有效感染U251细胞,降低U251细胞中PCL2的蛋白表达并筛选出稳定沉默的细胞系。 展开更多
关键词 多梳状蛋白2 U251细胞 SHRNA microRNA-30 胶质瘤
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SARA低表达对Activin A/Smads环路活性的影响 预览
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作者 石晓花 王姣琦 +6 位作者 刘洪雨 董玥 纪秋野 崔杨 何金婷 莽靖 徐忠信 《中国实验诊断学》 2019年第7期1207-1210,共4页
目的探讨下调Smad锚捉蛋白(SARA)表达对Activin A/Smads环路活性的影响。方法利用RNA干扰技术,设计靶向大鼠SARA基因的短发卡RNA(shRNA),瞬时转染激活素A(ActA)高表达的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞。转染48h后倒置荧光显微镜观察转染效率,... 目的探讨下调Smad锚捉蛋白(SARA)表达对Activin A/Smads环路活性的影响。方法利用RNA干扰技术,设计靶向大鼠SARA基因的短发卡RNA(shRNA),瞬时转染激活素A(ActA)高表达的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞。转染48h后倒置荧光显微镜观察转染效率,实时定量PCR、Western blot检测SARA基因的表达情况。对阳性转染组及阴性转染组细胞换液3h后,Western blot检测Smad3总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果靶向SARA基因的SARA-shRNA及对照NC-shRNA质粒的转染效率均超过70%。转染48h后,SARA基因转录及蛋白水平的表达显著降低。细胞换液3h后,与NC-shRNA组比较SARA-shRNA组Smad3总蛋白及磷酸化蛋白下调44%和57%。结论 SARA基因低表达下调ActA/Smads环路活性。 展开更多
关键词 SARA ActA/Smads SMAD3 shRNA
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shRNA稳定干扰Raptor基因表达的小鼠胸腺上皮细胞系的建立 预览
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作者 闵玉娇 吴皓杰 +2 位作者 王荟 潘子辉 邵启祥 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第2期108-112,共5页
目的:建立Raptor 基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系( mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1)。方法:根据Sigma 公司数据库Raptor 基因的短发夹RNA( short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3'和5'端添加pLKO. 1-puro 慢病毒... 目的:建立Raptor 基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系( mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1)。方法:根据Sigma 公司数据库Raptor 基因的短发夹RNA( short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3'和5'端添加pLKO. 1-puro 慢病毒载体酶切位点序列,合成shRNA 序列,插入载体。将pLKO. 1-puro-shRNA-Raptor 慢病毒载体与包装质粒混合,共同转染293T 细胞,收集病毒颗粒感染mTEC1,再用嘌呤霉素对其进行筛选,最后用免疫印迹法检测Raptor,mTOR,磷酸mTOR( p-mTOR)以及mTOR下游分子核糖体S6 激酶( ribosomal S6 kinase,p70S6k),磷酸化p70S6k( p-p70S6k)的表达水平。同时采用细胞计数和TUNEL 法分别检测细胞增殖与凋亡。结果:合成的Raptor 基因shRNA 序列成功插入至经Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切的pLKO. 1-puro 载体,经测序表明序列正确;免疫印迹结果显示,pLKO. 1-puro-shRNA-Raptor 感染mTEC1 后,Raptor、mTOR及其下游p-p70S6k 蛋白表达明显降低,但细胞增殖及凋亡无明显变化。结论:成功构建Raptor shRNA 慢病毒表达载体,建立稳定的Raptor 基因敲降的小鼠mTEC1。 展开更多
关键词 SHRNA RAPTOR 胸腺上皮细胞
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TrkA regulates the regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts 预览
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作者 Mei-Ge Zheng Wen-Yuan Sui +8 位作者 Zhen-Dan He Yan Liu Yu-Lin Huang Shu-Hua Mu Xin-Zhong Xu Ji-Sen Zhang Jun-Le Qu Jian Zhang Dong Wang 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第10期1765-1771,共7页
We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the r... We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the regeneration and functional recovery of the peripheral nerve.In the present study,we investigated the molecular mechanisms underlying the neuroprotective effects of TrkA in bone marrow stromal stem cells seeded into nerve grafts.Bone marrow stromal stem cells from Sprague-Dawley rats were infected with recombinant lentivirus vector expressing rat TrkA,TrkA-shRNA or the respective control.The cells were then seeded into allogeneic rat acellular nerve allografts for bridging a 1-cm right sciatic nerve defect.Then,8 weeks after surgery,hematoxylin and eosin staining showed that compared with the control groups,the cells and fibers in the TrkA overexpressing group were more densely and uniformly arranged,whereas they were relatively sparse and arranged in a disordered manner in the TrkA-shRNA group.Western blot assay showed that compared with the control groups,the TrkA overexpressing group had higher expression of the myelin marker,myelin basic protein and the axonal marker neurofilament 200.The TrkA overexpressing group also had higher levels of various signaling molecules,including TrkA,pTrkA(Tyr490),extracellular signal-regulated kinases 1/2(Erkl/2),pErk1/2(Thr202/Tyr204),and the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL.In contrast,these proteins were downregulated,while the pro-apoptotic factors Bax and Bad were upregulated,in the TrkA-shRNA group.The levels of the TrkA effectors Akt and pAkt(Ser473)were not different among the groups.These results suggest that TrkA enhances the survival and regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells through upregulation of the Erk/Bcl-2 pathway.All procedures were approved by the Animal Ethical and Welfare Committee of Shenzhen University,China in December 2014(approval No.AEWC-2014-001219). 展开更多
关键词 NERVE REGENERATION bone marrow stromal stem cells TROPOMYOSIN RECEPTOR kinase A RECEPTOR LENTIVIRAL vector shRNA extracellular SIGNAL-REGULATED protein kinases 1/2 Bcl-2 NERVE grafts peripheral NERVE REGENERATION survival neural REGENERATION
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