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糖基化修饰对重组CTLA4-Ig稳定性影响的研究
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作者 朱磊 单改仙 王兰 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期70-77,共8页
目的:探讨糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响。方法:应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理... 目的:探讨糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响。方法:应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理。通过分子排阻色谱(SEC)测定不同酶切时间处理后样品纯度变化;应用差示扫描荧光(DSF)测定样品整体热力学参数的变化;应用差示扫描量热(DSC)测定样品各结构域热力学参数变化;在45℃条件下加热,分别于0、1、3、5、7、9、11和12周取样,通过SEC测定样品纯度的变化。结果:在N-糖苷酶F、内切糖苷酶F2和唾液酸酶分别处理过程中,CTLA4-Ig的聚体含量逐渐增加,而O-糖苷酶酶切过程中,聚体虽无明显变化,但碎片含量逐渐增加;经DSF测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后解链温度(Tm)均明显下降,而唾液酸酶和O-糖苷酶处理后Tm无明显变化;经DSC测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后Tm1下降,Tm2不变,Tm3上升,而唾液酸酶处理后Tm1和Tm3都略微有所上升,Tm2基本不变,O-糖苷酶处理后Tm值均变化;加速试验过程中,N-糖苷酶F和唾液酸酶处理样品的聚体上升,内切糖苷酶F2处理样品的的聚体不变;O-糖苷酶处理样品的的聚体不变,而碎片偏高。结论:通过多种分析手段研究发现,糖基化修饰与CTLA4-Ig的稳定性密切相关。 展开更多
关键词 细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白 融合蛋白 单抗类药物 糖基化修饰 稳定性 N-糖基化 O-糖基化
粪肠球菌源EndoE的重组表达及酶学性质研究
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作者 韩小韦 黄云娜 +3 位作者 牛毅男 李学俊 徐全乐 陈鹏 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1118-1125,共8页
内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase, ENGase, EC3.2.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖。本研究基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因en... 内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase, ENGase, EC3.2.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖。本研究基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因endoE (endoglycosidase E),并以同源重组方式构建表达载体pET-28a-endoE,实现了EndoE在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Star (DE3)中的高效表达,并对EndoE去糖化的催化特性等进行了较为系统的分析。研究结果显示,重组EndoE在大肠杆菌中以可溶形式表达,经钴离子螯合层析与阴离子交换层析可获得高纯度的目标蛋白,产量为45.6 mg/L。去糖基化活性分析表明,重组EndoE能去除天然及变性核糖核苷酸酶B (ribonuclease B, RNase B)、鸡卵白蛋白(ovalbumin, Ova)和免疫球蛋白G (immune globulin G, IgG) N-连接的糖基侧链。基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱证实了EndoE对RNase B N-连接糖链的水解活性。EndoE在20~50 ℃和pH 4.0~6.0的范围内均具有良好的水解活性,并对100 mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)、1 mol/L NaCl和2% Triton X-100具有耐受性。EndoE较已报道的粪肠球菌来源的ENGase具有更为广泛的底物作用范围,是蛋白质糖基化分析中有潜在应用价值的工具酶。 展开更多
关键词 内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGase) N-糖基化 重组表达 酶学性质
用中国仓鼠卵巢细胞构建内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶筛选系统 预览
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作者 薛威 喜多岛敏彦 高晓冬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期49-54,共6页
糖苷水解酶85家族的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶具有糖基转移酶活性,利用该类酶,可以合成特定结构N-糖链修饰的糖基化复合物。为构建糖基转移酶筛选系统,将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的跨膜定位区域与绿色荧光蛋白融合表达,成功把带有天冬... 糖苷水解酶85家族的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶具有糖基转移酶活性,利用该类酶,可以合成特定结构N-糖链修饰的糖基化复合物。为构建糖基转移酶筛选系统,将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的跨膜定位区域与绿色荧光蛋白融合表达,成功把带有天冬酰胺连接糖基化位点的单体增强绿色荧光蛋白定位到中国仓鼠卵巢细胞的高尔基体中。流式细胞仪分析显示,融合了定位区域后,绿色荧光蛋白仍可以发出荧光,且在引入糖基化位点后,细胞荧光强度约降低10倍。经衣霉素处理,细胞糖基化被抑制,同时荧光强度减弱。此细胞株荧光强度对于糖基化水平的依赖性表明其在糖基转移酶的进化筛选方面的应用潜力。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 N-糖基化 内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶
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氨浓度升高对CHO细胞维持期抗体融合蛋白的表达及N-糖基化的影响 预览
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作者 陈欣宁 赵亮 +2 位作者 范里 刘旭平 谭文松 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期93-102,共10页
为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关... 为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系。结果显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响。但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化。当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低。因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降。 展开更多
关键词 CHO细胞培养 抗体融合蛋白 N-糖基化 唾液酸
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蛋白N-糖基化分析方法研究进展 预览 被引量:1
5
作者 张小倩 张腾腾 +2 位作者 闫攀 杨毕超 安凤霞 《生物技术进展》 2019年第3期246-252,共7页
糖基化是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一,N-糖基化作为糖蛋白中最主要的糖基化类型,在许多生命活动中起重要作用,对糖蛋白N-糖链的定性及定量研究具有重要意义。常规N-糖基化分析策略多是将其从肽链上酶切游离后再分析,但N-糖... 糖基化是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一,N-糖基化作为糖蛋白中最主要的糖基化类型,在许多生命活动中起重要作用,对糖蛋白N-糖链的定性及定量研究具有重要意义。常规N-糖基化分析策略多是将其从肽链上酶切游离后再分析,但N-糖链为多羟基醛类化合物,经典反相色谱与紫外检测方式对其分离分析较困难。针对这种情况,科学家多是通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团,增加检测灵敏度。对近年来科学家分离分析游离N-糖链的方法做了归纳与总结,其中毛细管电泳、高效液相色谱以及质谱联用技术在N-糖链的分离分析上有着巨大优势,对糖蛋白上N-糖的定性定量、结构表征具有重要意义。与此同时应进一步发展稳定可靠的N-糖释放、富集方法,并结合现代高效的分析手段,以及有针对性的N-糖解析措施,以期为N-糖基化高通量、高准确性的分析提供依据。 展开更多
关键词 N-糖基化 高效液相色谱法 毛细管电泳法 质谱
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不同证型慢性非萎缩性胃炎患者唾液淀粉酶的活性、蛋白含量、比活力及其N-糖基化程度
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作者 林传权 王东旭 +5 位作者 梁雪丹 杨龙 王丽辉 李茹柳 邱向红 陈蔚文 《中国中西医结合杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期937-942,共6页
目的分析不同证型慢性非萎缩性胃炎患者唾液淀粉酶(sAA)的活性、蛋白含量、比活力及其N-糖基化程度。方法68例慢性非萎缩性胃炎患者按中医辨证分为脾气虚弱组(24例)、脾虚湿热组(33例)、肝胃不和组(11例),另设健康对照组(36名),采集各... 目的分析不同证型慢性非萎缩性胃炎患者唾液淀粉酶(sAA)的活性、蛋白含量、比活力及其N-糖基化程度。方法68例慢性非萎缩性胃炎患者按中医辨证分为脾气虚弱组(24例)、脾虚湿热组(33例)、肝胃不和组(11例),另设健康对照组(36名),采集各组酸刺激前后的唾液,检测sAA活性、蛋白含量、比活力及其N-糖基化程度,并分析sAA活性、蛋白含量的酸刺激前后比值。结果与本组酸刺激前比较,酸刺激后健康对照组sAA活性及蛋白含量均升高,sAA比活力均明显下降(P<0.05)。与健康对照组比较,酸刺激后脾气虚弱组、脾虚湿热组sAA活性比值、蛋白含量比值<1及糖基化缺失的例数均增高(P<0.05),酸刺激前脾虚湿热组sAA比活力高于健康对照组(P<0.05)。酸刺激后,健康对照组、脾虚湿热组、脾气虚弱组的sAA比活力均较酸刺激前明显下降(P<0.05),但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。肝胃不和组的各项分析指标与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢性胃炎脾气虚弱证及脾虚湿热证sAA的活性、蛋白含量及N-糖基化程度发生异常改变,脾运化功能的强弱可在唾液蛋白质分泌中有较为客观的反映。 展开更多
关键词 慢性非萎缩性胃炎 脾气虚弱 脾虚湿热 肝胃不和 唾液淀粉酶活性 N-糖基化
N-糖基化对一种新型重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)稳定性的影响 被引量:1
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作者 罗长财 缪静 +2 位作者 李国莹 杜瑶 余晓斌 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期11-19,共9页
【背景】对来源于嗜热枯草芽孢杆菌(TBS2)的一种新型重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)基因序列进行分析,该基因中含有3个N-糖基化位点(N8、N26与N255),经毕赤酵母表达时可进行N-糖基化修饰。【目的】确定N-糖基化对ReTMan26稳定性的... 【背景】对来源于嗜热枯草芽孢杆菌(TBS2)的一种新型重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)基因序列进行分析,该基因中含有3个N-糖基化位点(N8、N26与N255),经毕赤酵母表达时可进行N-糖基化修饰。【目的】确定N-糖基化对ReTMan26稳定性的影响。【方法】通过构建ReTMan26蛋白质三维结构模型,初步分析N-糖基化对该酶稳定性的影响。在此基础上,利用天然蛋白去糖基化试剂盒除去ReTMan26的N-多糖链,获得去除N-糖基化的耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26-DG),并对纯化后的ReTMan26及ReTMan26-DG进行相应的稳定性对比检测。【结果】ReTMan26与ReTMan26-DG的最适反应pH均为6.0,但在pH1.5-9.0范围内,ReTMan26的稳定性比ReTMan26-DG有小幅提高。ReTMan26的最适反应温度为60°C,比ReTMan26-DG高5°C;ReTMan26经100°C处理10 min,剩余酶活为58.6%,而ReTMan26-DG经93°C处理10 min,剩余酶活为58.2%,100°C处理10min则完全失活。经胃蛋白酶及胰蛋白酶在37°C处理2h后,ReTMan26的剩余酶活分别为70.5%及91.2%,比ReTMan26-DG分别提高了23.7%及25.6%。【结论】N-糖基化可提高ReTMan26的pH稳定性、耐热稳定性及抗蛋白酶消化性能。 展开更多
关键词 N-糖基化 重组耐高温β-甘露聚糖酶 纯化 稳定性
毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能
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作者 李新新 柏映国 +4 位作者 华晨 马锐 石鹏君 罗会颖 姚斌 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期37-47,共11页
【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比... 【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75℃,但二者的T_m值和70℃下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。 展开更多
关键词 嗜热蓝状菌 Β-葡萄糖苷酶 N-糖基化 热稳定性 催化效率
CE-LIF方法对重组人促红细胞生成素中N-寡糖的快速分析
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作者 李响 于雷 +2 位作者 史新昌 周勇 饶春明 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1852-1857,共6页
目的:建立毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)的方法对重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的N-寡糖进行快速分析。方法:以N-糖苷酶酶切rhEPO样品,采用磁珠辅助法收集酶切下来的N-寡糖,以APTS对酶切下来的N... 目的:建立毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)的方法对重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的N-寡糖进行快速分析。方法:以N-糖苷酶酶切rhEPO样品,采用磁珠辅助法收集酶切下来的N-寡糖,以APTS对酶切下来的N-寡糖进行荧光标记,利用CE-LIF实现分离检测,通过GU数据库进行糖型鉴定。CE-LIF条件:采用未涂层熔融石英毛细管(有效长度20 cm,总长度30 cm,内径50μm),电迁移进样,电压设为-2 kV,进样时间2 s;毛细管分离温度设为25℃,毛细管分离电压为-30 kV,分离时间5.5 min;LIF检测器的激发波长及发射波长分别为488 nm和520 nm。结果:新建方法在60 min内完成样品前处理,5 min内完成分离分析检测;FA2BG2S2、FA2(3)G1S1和A2B3个峰的迁移时间的RSD均小于0.2%,校正峰面积百分比RSD均小于2.6%(n=5)。结论:本研究建立的CE-LIF快速糖分析法高效快速,重复性好,可对糖型进行实时鉴定,适用于rhEPO制品的N-寡糖分析。 展开更多
关键词 促红细胞生成素 N-糖基化 重组蛋白 毛细管电泳-激光诱导荧光检测 GU数据库
N-糖基化对黑曲霉AnLPMO15g与纤维素酶协同作用的影响 预览
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作者 马立娟 佟文哲 +3 位作者 杜丽平 崔馨予 马清 肖冬光 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1148-1155,共8页
裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)辅助活性9家族蛋白(AA9)可有效促进纤维素酶降解纤维素。为研究N-糖基化对来源于黑曲霉的AA9蛋白AnLPMO15g与纤维素酶协同性的影响,采用定点突变的方法,将An LPMO15g中3个N-糖基化修饰位点(151、334、385)上... 裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)辅助活性9家族蛋白(AA9)可有效促进纤维素酶降解纤维素。为研究N-糖基化对来源于黑曲霉的AA9蛋白AnLPMO15g与纤维素酶协同性的影响,采用定点突变的方法,将An LPMO15g中3个N-糖基化修饰位点(151、334、385)上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果表明,作用于微晶纤维素时,突变体N-151产生的还原糖量比AnLPMO15g提高了10.34%,突变体N-385产生的还原糖量降低了12.73%,突变体N-334变化不显著;作用于稻草粉时,3个突变体产生的还原糖量均高于An LPMO15g,提高幅度为7%~19%。当与纤维素酶共同作用于微晶纤维素时,只有突变体N-334产生的还原糖量较AnLPMO15g显著提高了38.89%;共同作用于稻草粉时,突变体N-334和N-385产生的还原糖量略高于AnLPMO15g。由此可见,N-糖基化修饰对AnLPMO15g及其与纤维素酶协同降解作用均有不同程度的影响,其中N-151和N-385位点的糖基化修饰对提高An LPMO15g与纤维素酶协同降解活性尤为重要。 展开更多
关键词 N-糖基化 纤维素酶 定点突变 协同性
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黄病毒E蛋白N-糖基化研究进展 预览
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作者 潘昱婷 贾仁勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期864-867,共4页
糖基化是蛋白质一种重要的翻译后修饰调控机制。在真核细胞中,糖基化的合成主要包括:N糖基化、O糖基化及糖基磷脂酰肌醇锚3种途径。新生肽链合成时或合成后,糖链与肽链中特定序列(Asn-X-Thr/Ser,其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰... 糖基化是蛋白质一种重要的翻译后修饰调控机制。在真核细胞中,糖基化的合成主要包括:N糖基化、O糖基化及糖基磷脂酰肌醇锚3种途径。新生肽链合成时或合成后,糖链与肽链中特定序列(Asn-X-Thr/Ser,其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰胺(N)相连接,所以将该糖基化类型称为N连接糖链,又称N糖基化[1]。在真核细胞中,N糖基化的合成在内质网和高尔基体中完成,糖蛋白中N连接聚糖在内质网中将预先生成的寡糖转运至新生肽链的天冬酰胺残基中,再将其转移至高尔基体内进一步修饰,并在高尔基体糖苷酶和糖基转移酶的作用下. 展开更多
关键词 N-糖基化 E蛋白 糖基磷脂酰肌醇 翻译后修饰 病毒 新生肽链 真核细胞 天冬酰胺
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植物N-糖链检测技术研究进展 预览 被引量:1
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作者 何金霞 贾晓晨 +2 位作者 王文霞 胡建恩 尹恒 《生物技术进展》 2018年第6期500-508,554共10页
N-糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰,在胚胎发育、癌症发生发展及免疫防御等诸多复杂的生命活动中发挥着关键作用。近年来,基于质谱的N-糖链的检测及其定量研究在动物方面取得了显著进展,相比之下,植物N-糖基化及N-糖链检测的相关... N-糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰,在胚胎发育、癌症发生发展及免疫防御等诸多复杂的生命活动中发挥着关键作用。近年来,基于质谱的N-糖链的检测及其定量研究在动物方面取得了显著进展,相比之下,植物N-糖基化及N-糖链检测的相关研究要远远滞后,这也是制约植物糖生物学研究发展的关键瓶颈问题之一。对蛋白质N-糖链的释放、定量策略、可视化检测及其在植物中的应用进展进行了归纳总结,以期为指导后续植物N-糖链及N-糖组的定性定量检测提供参考。 展开更多
关键词 N-糖基化 N-糖链 N-糖组 质谱 植物糖生物学
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N-糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响 预览
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作者 张笑雨 高思宇 +1 位作者 李秀婷 杨然 《食品工业科技》 CSCD 北大核心 2018年第11期137-143,160共8页
为实现木聚糖酶的高效表达,扩大实际生产应用,本实验将木聚糖酶基因xynA在毕赤酵母中进行重组表达,同时采用糖基化抑制剂衣霉素处理毕赤酵母细胞,以此来探讨N-糖基化对木聚糖酶XynA酶学性质的影响。结果表明,SDS—PAGE电泳图谱显... 为实现木聚糖酶的高效表达,扩大实际生产应用,本实验将木聚糖酶基因xynA在毕赤酵母中进行重组表达,同时采用糖基化抑制剂衣霉素处理毕赤酵母细胞,以此来探讨N-糖基化对木聚糖酶XynA酶学性质的影响。结果表明,SDS—PAGE电泳图谱显示木聚糖酶XynA发生了N-糖基化修饰,分子量约为45kDa,酶活为406.6U/mL,最适pH及反应温度分别为5.0和65℃;而添加不同浓度衣霉素处理后的木聚糖酶最适pH不变,最适反应温度下降5℃,随着衣霉素浓度的增加,去糖基化的木聚糖酶酶活力、分泌量及温度稳定性均有所下降,且当衣霉素添加浓度为15μg/mL时,剩余酶活为53.6%。去糖基化的木聚糖酶耐受胃蛋白酶的能力较糖基化的有所增强,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al2+、EDTA相对于糖基化的木聚糖酶表现出了一定的激活作用。以上结果说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰对木聚糖酶XynA的分泌及热稳定性有促进作用。 展开更多
关键词 N-糖基化 木聚糖酶 衣霉素 酶学性质
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N-糖基化蛋白质组样品富集策略的研究进展 预览 被引量:1
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作者 邵文亚 梁玉 +2 位作者 梁振 张丽华 张玉奎 《分析测试学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1212-1216,共5页
蛋白质的糖基化是生物体内重要的蛋白质翻译后修饰之一,但其丰度通常较低,糖基化蛋白质酶解肽段中仅有2%~5%为糖基化肽段,因此,为实现糖基化蛋白质组的深度覆盖分析,对糖基化蛋白质/肽段进行富集是非常必要的。该文对糖基化蛋白质... 蛋白质的糖基化是生物体内重要的蛋白质翻译后修饰之一,但其丰度通常较低,糖基化蛋白质酶解肽段中仅有2%~5%为糖基化肽段,因此,为实现糖基化蛋白质组的深度覆盖分析,对糖基化蛋白质/肽段进行富集是非常必要的。该文对糖基化蛋白质组样品不同富集方法的原理、特点以及最新研究进展进行了综述,同时也对N-糖基化蛋白质组学富集策略的发展前景进行了展望。 展开更多
关键词 糖蛋白质组学 N-糖基化 糖肽 糖蛋白 富集
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酵母来源α-1,2甘露糖转移酶Alg11的异源表达、纯化和活性分析
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作者 李庆猛 李盛陶 +1 位作者 王宁 高晓冬 《中国生物工程杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期26-33,共8页
糖基转移酶Alg11作为N-糖基化途径中一个重要蛋白,功能为催化将甘露糖转移到底物DPGn2M3(Dolichyl-pyrophosphate-Glc NAc2Mannose3)上进而生成DPGn2M4和DPGn2M5这两种多萜醇寡糖前体的反应。在本研究中,首先通过对酿酒酵母Alg11的蛋... 糖基转移酶Alg11作为N-糖基化途径中一个重要蛋白,功能为催化将甘露糖转移到底物DPGn2M3(Dolichyl-pyrophosphate-Glc NAc2Mannose3)上进而生成DPGn2M4和DPGn2M5这两种多萜醇寡糖前体的反应。在本研究中,首先通过对酿酒酵母Alg11的蛋白质结构进行分析,设计了去除跨膜域的蛋白Alg11(45-548)并成功在大肠杆菌中表达,进而对诱导时间、诱导剂浓度进行了产量最大化的优化,最终得到了纯化蛋白。以PPGn2(Phytanyl-pyrophosphate-Glc NAc2)为底物,利用体外表达的重组蛋白Alg1ΔTM和Trx-Alg2以酶法合成出Alg11的天然底物类似物PPGn2M3。用纯化的Alg11(45-548)蛋白催化转糖基反应,并通过液质联用(LC-MS)的方法检测产物,证实Alg11(45-548)蛋白具有催化PPGn2M3生成PPGn2M4和PPGn2M5的糖基转移酶活性。产物PPGn2M5通过不同的甘露糖苷酶酶切反应,验证了两个新加上的甘露糖以α-1,2糖苷键的形式连接到底物PPGn2M3上。底物特异性实验表明Alg11(45-548)可以特异性识别底物PPGn2M3,而其他N-糖基化中间体类似物如PPGn2和PPGn2M1无法被识别,且底物中的脂肪链结构也对酶的识别具有重要作用。Alg11的底物特异性保证了多萜醇寡糖前体的有序合成,具有重要的生理意义。 展开更多
关键词 N-糖基化 糖基转移酶Alg11 液质联用(LC-MS) 诱导条件
隐匿性HBV感染患者HBVS基因N-糖基化突变对HBsAg抗原性影响的分析 预览 被引量:6
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作者 刘妍 张凯 +5 位作者 陈容娟 李奇 许智慧 思兰兰 蔺淑梅 徐东平 《解放军医学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第5期386-391,共6页
目的分析隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要亲水区(MHR)N-糖基化突变的抗原性,探讨N-糖基化突变与OBI发生机制的关系及临床意义。方法选取2例OBI患者血清中检出的4种NXT/S形式突变,其中sQ129N为已知经典的N-糖基化突变,其余3种... 目的分析隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要亲水区(MHR)N-糖基化突变的抗原性,探讨N-糖基化突变与OBI发生机制的关系及临床意义。方法选取2例OBI患者血清中检出的4种NXT/S形式突变,其中sQ129N为已知经典的N-糖基化突变,其余3种为本课题组新发现的突变,采用前期构建成功的野生型及突变型S基因重组质粒转染HepG2和Huh7细胞,验证3种新型突变形式,并分析4种突变对HBsAg抗原性的影响及这些突变地6种HBsAg检测试剂的反应性。结果 Western blotting结果证实3种新型突变均为N-糖基化突变。激光共聚焦结果显示,与野生株相比,4种突变株HBsAg/His标签的荧光强度比值分别降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%,双抗体夹心法得出结果类似。用6种HBsAg临床试剂进行的检测结果显示,与野生株相比,3种新型突变株对6种HBsAg试剂的反应性均明显降低(P〈0.05);其中携带双N-糖基化突变(aa113-118 TSTTST→NST+aa131-133 TSM→NST)的HBsAg抗原性降低最为明显,导致测试的6种试剂中4种无法检测到该突变蛋白。结论 HBV S基因MHR区N-糖基化突变抗原性降低是引起患者OBI表现的主要原因之一,目前临床常用的HBsAg检测试剂对突变抗原的检测敏感性仍需要进一步提高。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 S基因 突变 N-糖基化 抗原性
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重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定 预览
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作者 张琪 吴秀菊 +4 位作者 俞婷 王志林 崔百元 朱庆锋 贝锦龙 《华中师范大学学报:自然科学版》 北大核心 2018年第5期678-685,共8页
为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯... 为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础. 展开更多
关键词 植酸酶 N-糖基化 质谱 毕赤酵母
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N-糖基化改造碱性果胶酶的热稳定性 预览
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作者 昂安娜 堵国成 +5 位作者 葛飞 朱龙宝 江志超 马琪森 朱龙龙 陶玉贵 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2018年第5期22-28,共7页
在软件模拟分析的基础上,运用半理性设计转换传统去除N-糖基化的方式,同时在反向转角区引入具有增强芳香族序列(enhanced aromatic sequence,EAS)特征的新N-糖基化,提高了碱性果胶酶(alkaline polygalacturonate lyase,PGL)的热稳定... 在软件模拟分析的基础上,运用半理性设计转换传统去除N-糖基化的方式,同时在反向转角区引入具有增强芳香族序列(enhanced aromatic sequence,EAS)特征的新N-糖基化,提高了碱性果胶酶(alkaline polygalacturonate lyase,PGL)的热稳定性,获得了高品质的PGL工程菌。将355位点的苏氨酸突变成突变能低的色氨酸来去除353位点的N-糖基化,酶的半衰期提高了176%,但与目标值仍相距甚远;再将127和137位点同时引入新N-糖基化,使酶的半衰期达到1.35 h,与目标值接近。在酶的反向转角区引入具有EAS特征的新N-糖基化,对提高酶的热稳定性具有显著促进作用。 展开更多
关键词 碱性果胶酶 N-糖基化 热稳定性 增强芳香族序列(enhanced AROMATIC sequence EAS)
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N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响 预览 被引量:3
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作者 马清 蔡瑞 +3 位作者 姜风超 马立娟 杜丽平 肖冬光 《食品科学》 CSCD 北大核心 2017年第16期86-91,共6页
为研究N-糖基化对里氏木霉β-甘露聚糖酶(β-mannanase,Man1)在毕赤酵母GS115中异源表达的影响,采用定点突变的方法,将Man1上3个N-糖基化修饰位点(N131、N158和N329)上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果发现,N-糖基化位点的... 为研究N-糖基化对里氏木霉β-甘露聚糖酶(β-mannanase,Man1)在毕赤酵母GS115中异源表达的影响,采用定点突变的方法,将Man1上3个N-糖基化修饰位点(N131、N158和N329)上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果发现,N-糖基化位点的突变对Man1的转录水平无明显影响,突变后获得的Man1表观分子质量有轻微下降,与Man1相比,3个突变体N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分别降低了85.43%和79.48%和16.3%;而热稳定性分别提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可见,N-糖基化修饰对于β-甘露聚糖酶的高效表达是必需的,其中N131和N158糖基化位点尤为重要,但是会稍微降低β-甘露聚糖酶的热稳定性。 展开更多
关键词 Β-甘露聚糖酶 N-糖基化 定点突变 酶活力 热稳定性
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N-Linked Glycosylation of the p24 Family Protein p24δ5 Modulates Retrograde Golgi-to-ER Transport of K/HDEL Ligands in Arabidopsis
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作者 Noelia Pastor-Cantizano Maria Jesus Garcia-Murria +3 位作者 Cesar Bernat-Silvestre Maria Jesus Marcote Ismael Mingarro Fernando Aniento 《分子植物:英文版》 SCIE CAS CSCD 2017年第8期1095-1106,共12页
K/HDEL 受体 ERD2 调停可溶的 endoplasmic 蜂窝胃的运输(嗯) 包含 C 终端 K/HDEL 的居民蛋白质经由 COPI 从 Golgi 仪器发信号回到 ER (上衣蛋白质 ? 我) 涂的泡。在 COPI 泡以内 ERD2 排序被 p24 蛋白质便于。在 Arabidopsis, p245 ... K/HDEL 受体 ERD2 调停可溶的 endoplasmic 蜂窝胃的运输(嗯) 包含 C 终端 K/HDEL 的居民蛋白质经由 COPI 从 Golgi 仪器发信号回到 ER (上衣蛋白质 ? 我) 涂的泡。在 COPI 泡以内 ERD2 排序被 p24 蛋白质便于。在 Arabidopsis, p245 被显示了经由它的钠金牌与 ERD2 直接交往 ?(GOLgi 动力学) 领域 ? 并且与 COPI,经由它的细胞质的 C 终端的蛋白质在 Golgi 仪器的酸的 pH 跟踪 ?。在哺乳动物和酵母的 p24 家庭的几个成员被显示了是 glycosylated,但是 Arabidopsis p24 蛋白质是否是 glycosylated 和在 p24 的糖一半的角色功能遗体不清楚。这里,我们证明那 Arabidopsis p245 蛋白质是在它的金领域的 N-glycosylated。而且,我们证明这 translational 以后修正为它有在 ER-Golgi 接口的 p242 的联合运输是重要的,为它和 K/HDEL 受体 ERD2 的相互作用,并且为后退从回到 ER 的 Golgi 仪器的 ERD2 和 K/HDEL ligands 的运输。 展开更多
关键词 N-糖基化 基因家族 P24 蛋白质 拟南芥 内质网 运输 配体
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