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辽宁省空调冷却水中非嗜肺军团菌基因分型与毒力初探
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作者 魏彤竹 于淼 +2 位作者 张眉眉 耿英芝 马景宏 《预防医学论坛》 2018年第12期908-911,915共5页
目的了解辽宁省集中空调冷却水中检出的非嗜肺军团菌基因分型,并对其携带的毒力基因情况进行调查。方法采用16SrDNA和mip基因作为引物对2013~2017年辽宁省各大公共场所空调冷却水中分离到的9株非嗜肺军团菌基因分型鉴定,同时对它们分泌... 目的了解辽宁省集中空调冷却水中检出的非嗜肺军团菌基因分型,并对其携带的毒力基因情况进行调查。方法采用16SrDNA和mip基因作为引物对2013~2017年辽宁省各大公共场所空调冷却水中分离到的9株非嗜肺军团菌基因分型鉴定,同时对它们分泌的系统毒力岛基因组进行了检测。结果检出4株茴芹军团菌(L.anisa),2株吉斯特军团菌(L.geestiana),1株沃斯利军团菌(L.worsleiensis),2株红光军团菌(L.rubrilucens);9株非嗜肺军团菌中有8株携PAI毒力基因。结论辽宁省公共环境集中空调冷却系统中存在非嗜肺军团菌,以茴芹军团菌居多,且多数分离菌株携带毒力基因,是可致病性病源菌。 展开更多
关键词 空调冷却水 非嗜肺军团菌 毒力岛基因 16SrDNA MIP基因 毒力
嗜肺军团菌核酸等温扩增快速检测技术研究 被引量:2
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作者 张兵 徐昌平 +2 位作者 程东庆 冯燕 卢亦愚 《中国卫生检验杂志》 CAS 2018年第7期782-784,788共4页
目的建立一种嗜肺军团菌的核酸等温扩增试纸条及pH显色快速检测方法,从而实现对空调冷却水样中嗜肺军团菌的快速现场检测。方法基于嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,建立环介导等温扩增体系,并结合反应产物横向流动试纸条和pH显色检测... 目的建立一种嗜肺军团菌的核酸等温扩增试纸条及pH显色快速检测方法,从而实现对空调冷却水样中嗜肺军团菌的快速现场检测。方法基于嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,建立环介导等温扩增体系,并结合反应产物横向流动试纸条和pH显色检测技术,进而验证方法的灵敏性、特异性,并对浙江省不同地区的中央空调冷却水水样进行检测。结果环介导的等温扩增试纸条及pH显色检测方法灵敏度可高达3 cfu/μl,特异性好,且检测时间仅需40 min左右。检测的灵敏度与荧光定量PCR的方法基本一致,对外环境空调冷却水的检测阳性率与荧光定量也相符。结论建立的嗜肺军团菌试纸条与pH显色快速检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 MIP基因 环介导的等温扩增技术 横向流动试纸条 pH显色
嗜肺军团菌荧光定量PCR法的建立和初步应用
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作者 叶艳华 江晓 +3 位作者 金萍 何敏 丁洁 张洪英 《中国卫生检验杂志》 CAS 2018年第8期901-903,共3页
目的建立嗜肺军团菌特异、快速检测方法,探讨南京地区公共场所环境水样嗜肺军团菌污染状况。方法根据嗜肺军团菌的mip基因保守序列设计引物和探针,通过对嗜肺军团菌标准株ATCC33152、嗜肺军团菌南京分离株及大肠埃希菌ATCC25922、鼠... 目的建立嗜肺军团菌特异、快速检测方法,探讨南京地区公共场所环境水样嗜肺军团菌污染状况。方法根据嗜肺军团菌的mip基因保守序列设计引物和探针,通过对嗜肺军团菌标准株ATCC33152、嗜肺军团菌南京分离株及大肠埃希菌ATCC25922、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、福氏2a志贺菌ATCC12022进行检测,验证该方法的特异性。并应用该法对南京地区某商场、宾馆、办公楼、医院共计13家的中央空调系统的冷却水、淋浴水和景观水共计88份环境水样进行了PCR检测及军团菌的分离培养。结果该法对嗜肺军团菌有特异性扩增曲线,而对其他细菌无阳性扩增曲线。88份水样中荧光定量PCR方法检测出28份阳性,阳性率为31.8%;传统培养方法分离出17株军团菌,分离率为19.3%。结论本文建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,可用于环境水中军团菌污染状况调查。南京地区中央空调冷却水中检出率最高,存在发生军团菌病的可能,应引起足够重视。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 荧光定量PCR MIP基因
鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 胡春生 符玺宗 +6 位作者 周鹏 柏琴琴 曾心靛 周朴帆 刘子卿 张程 陈丽丽 《实用预防医学》 CAS 2017年第3期280-283,共4页
目的 克隆鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强蛋白(Microphage infectivity potentiator,Mip)基因,构建原核重组质粒,诱导表达重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。方法 提取鹦鹉热衣原体6BC基因组DNA... 目的 克隆鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强蛋白(Microphage infectivity potentiator,Mip)基因,构建原核重组质粒,诱导表达重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。方法 提取鹦鹉热衣原体6BC基因组DNA,PCR扩增Mip基因,克隆至pET-30a(+),构建原核表达载体pET-30a(+)-Cps Mip。PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导pET-30a(+)-Cps Mip在E.coli BL21中表达目的蛋白。融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗Mip抗体的效价。结果 PCR扩增得到大小约为768 bp左右的Mip目的片段;经PCR、酶切及测序鉴定,证明构建的原核重组质粒中插入的片段为Cps Mip基因,测序结果经BLAST分析,与Genbank上登录序列完全一致。经IPTG诱导,重组工程菌表达一相对分子量(Mr)约为34 kD的目的蛋白;ELISA 检测免疫小鼠血清效价为1:128 000。结论 成功构建了鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体,并表达了相应可溶性蛋白,制备了高效价的鼠抗Mip多克隆抗体。 展开更多
关键词 鹦鹉热衣原体 MIP基因 免疫原性 多克隆抗体
嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达
5
作者 何金蕾 彭冉 +6 位作者 张俊荣 余泽英 李娜丽莎 龚艳菊 陈莹 陈达丽 陈建平 《四川大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-6,共6页
目的 选取嗜肺军团菌mip和flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法 运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性... 目的 选取嗜肺军团菌mip和flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法 运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 优势抗原表位 MIP基因 flaA基因 融合表达
军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 预览 被引量:1
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作者 牛莉娅 程欣 +4 位作者 郭玉梅 王颖童 阮杰 亢继文 孙殿兴 《环境卫生学杂志》 北大核心 2014年第1期76-80,共5页
目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)D... 目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。 展开更多
关键词 军团菌 荧光定量PCR TAQMAN探针 23S RRNA基因 MIP基因
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温州市部分公共场所集中空调冷却水军团菌污染状况 被引量:3
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作者 章乐怡 洪程基 +2 位作者 李毅 郑文力 马雪莲 《环境与职业医学》 CAS 北大核心 2013年第4期274-277,共4页
[目的]了解温州市公共场所集中空调冷却水中军团菌污染状况。[方法]分别于2010年、2011年共抽取温州市区30家公共场所[包括医院、宾馆(酒店)、超市(商场)]集中空调系统的冷却水126份。采用分离病原培养法及荧光定量聚合酶链反应(PC... [目的]了解温州市公共场所集中空调冷却水中军团菌污染状况。[方法]分别于2010年、2011年共抽取温州市区30家公共场所[包括医院、宾馆(酒店)、超市(商场)]集中空调系统的冷却水126份。采用分离病原培养法及荧光定量聚合酶链反应(PCR)法进行军团菌检测。[结果]公共场所冷却塔水的军团菌检出率,2010年为62.50%,2011年为33.93%。共分离56株军团菌菌株,33株为嗜肺军团菌Lp1~15型,以Lp6、Lp1型为优势血清型,其中Lp6型占19.64%(11/56),Lp1型占17.86%(10/56),而且主要分布于医院检出的菌株中。荧光定量PCR法检测结果显示,56株军团菌16S rRNA均为阳性;且有35株mip基因检测阳性,阳性率为62.50%。[结论]温州市公共场所集中空调冷却水存在军团菌污染,以嗜肺军团菌LP6、LP1型为优势菌型。 展开更多
关键词 军团菌 空调冷却水 MIP基因
嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 预览 被引量:3
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作者 杜昕颖 苏晓 +7 位作者 王玉飞 龚春丽 庄妤冰 苑锡铜 陈泽良 袁静 宋宏彬 黄留玉 《生物技术通讯》 CAS 2013年第6期843-846,共4页
目的:建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法:根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测... 目的:建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法:根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果:建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6pg/μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU/mL。结论:建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 荧光定量PCR TAQMAN探针 MIP基因
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嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达 预览 被引量:1
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作者 惠英华 曹秀琴 杨志伟 《宁夏医科大学学报》 2011年第2期 105-107,111,F0002,共5页
目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamH... 目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 MIP基因 GFP-mip 蛋白表达
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应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌 被引量:1
10
作者 莫自耀 秦建强 +4 位作者 赵红波 关文达 秦笙 王玉涛 杨子峰 《中华生物医学工程杂志》 2011年第1期61-65,共5页
目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因... 目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求. 展开更多
关键词 聚合酶链反应 荧光 军团菌 16 S RRNA基因 MIP基因
肿瘤相关基因MIP在HeLa细胞中的亚细胞定位及其变化
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作者 叶晓霞 霍克克 陈东 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期175-179,共5页
目的探讨肿瘤相关基因MIP的亚细胞定位情况,以及MIP与其相互作用蛋白FASP1、Malt共转染HeLa细胞后亚细胞定位的变化和共定位情况。方法利用在线蛋白质结构和亚细胞定位分析软件,对MIP可能的蛋白结构和亚细胞定位进行分析预测;结合分... 目的探讨肿瘤相关基因MIP的亚细胞定位情况,以及MIP与其相互作用蛋白FASP1、Malt共转染HeLa细胞后亚细胞定位的变化和共定位情况。方法利用在线蛋白质结构和亚细胞定位分析软件,对MIP可能的蛋白结构和亚细胞定位进行分析预测;结合分析结果,采用荧光蛋白融合表达和激光扫描共焦显微技术,观察比较MIP融合于绿色荧光蛋白(GFP)的N端或c端时在HeLa细胞中的亚细胞定位情况。pDsRed—FASPl、pDsRed—MafF分别单独转染,或者与MIP—GFP共同转染HeLa细胞,观察红色、绿色荧光蛋白的分布,分析比较各蛋白的亚细胞定位、变化及共定位情况。结果单独转染时,MIP主要呈不均匀点状分布于细胞质;GFP融合于MIP蛋白的N端或者C端,其亚细胞定位略有变化,MIP—GFP的不均匀分布更加典型,在胞质中呈点状聚集。DsRed—FASP1单独转染时弥散分布于细胞质;与MIP—GFP共同转染后,MIP与FASP1在细胞内的分布没有大的改变,两者能够共定位于细胞质。DsRed—MaW单独转染时弥散分布于细胞核;而与MafF—GFP共同转染时,两者的亚细胞定位均发生显著改变,此时两者能够共定位于细胞核内核仁区。结论MIP能够与FASP1、MafF在细胞内不同部位相互作用。MIP在细胞质和细胞核中的定位变化,提示MIP可能作为一个重要的信号分子,在细胞质和细胞核中发挥多重作用。 展开更多
关键词 MIP基因 FASP1 MaW 亚细胞定位 荧光融合蛋白 激光扫描共焦显微镜
深圳市集中空调系统军团菌污染状况分析 被引量:11
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作者 林爱红 张然 +3 位作者 叶宝英 谭丽 唐屹君 李桂妹 《实用预防医学》 CAS 2011年第9期1670-1672,共3页
目的了解深圳市地铁和部分宾馆集中空调系统军团菌污染状况。方法按照《公共场所集中空调通风系统卫生规范》要求,检测未经消毒处理的宾馆水样8份、专业消毒公司处理过的水样78份,未开通运营的地铁空调系统水样53份,用传统细菌分离培养... 目的了解深圳市地铁和部分宾馆集中空调系统军团菌污染状况。方法按照《公共场所集中空调通风系统卫生规范》要求,检测未经消毒处理的宾馆水样8份、专业消毒公司处理过的水样78份,未开通运营的地铁空调系统水样53份,用传统细菌分离培养法分离鉴定,用PCR法加以验证。结果 78份消毒处理过的水样和53份地铁空调系统水样未检出军团菌;8份未经消毒处理的水样中检出1株嗜肺军团菌LP6型,3株LP1型,总阳性率为3.10%。结论深圳市未经消毒处理的宾馆集中空调系统中嗜肺军团菌阳性率较高,专业消毒公司处理后的水样未检出嗜肺军团菌,建议有关部门加强对空调系统的监管,以降低嗜肺军团菌感染的隐患。 展开更多
关键词 集中空调 PCR 嗜肺军团菌 MIP基因
嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立 预览 被引量:12
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作者 张琦 陈晓东 +6 位作者 张宝莹 钱乐 司朝宗 张秀珍 甄世祺 刘凡 陈连生 《江苏预防医学》 CAS 2010年第3期 3-6,共4页
目的:建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法:利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。... 目的:建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法:利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies/μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 荧光定量PCR检测 MIP基因
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Taqman—MGB双重探针PCR技术检测军团菌 预览 被引量:5
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作者 朱水荣 金大智 +3 位作者 张政 王志刚 卢亦愚 徐宝祥 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期 174-178,共5页
目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5’端分别标记FAM和HEX,3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、... 目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5’端分别标记FAM和HEX,3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性(LP12、LP13除外);嗜肺军团菌均为mip阳性,非嗜肺军团菌属除L.micdadei外均为阴性;而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝/反应;重复性实验中,变异系数为0.2%~O.6%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法,可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属,该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估,以及应急临床标本的快速定量检测。 展开更多
关键词 军团菌 双重荧光定量PCR MGB探针 16S RDNA基因 MIP基因
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实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究 被引量:1
15
作者 许海红 梅玲玲 +3 位作者 朱敏 谢鑫友 金红 杨肃文 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期856-861,共6页
目的建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具。方法在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应... 目的建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具。方法在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性。结果当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmoL/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA6.0μl,反应条件为预变95℃20s,变性95℃10s,退火50℃40s,40个循环时,TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23—16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5h。结论TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 TAQMAN-MGB探针 实时荧光PCR MIP基因
嗜肺军团菌荧光定量PCR检测 预览 被引量:16
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作者 朱水荣 张政 +3 位作者 卢亦愚 任红宇 扬仕贵 高晓萍 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期 1111-1113,共3页
目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因... 目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 MIP基因 TAQMAN探针 荧光定量PCR
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香菇编码线粒体中间肽酶的基因片段的克隆及序列测定 预览 被引量:9
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作者 鲍大鹏 陈明杰 张美彦 《食用菌学报》 2007年第4期 1-8,共8页
在担子菌中,编码线粒体中间肽酶(mitochondrial intermediate peptidase,MIP)的基因普遍与交配型A因子紧密连锁。通过mip基因来定位和分离交配型A因子将是一种有效的研究食用真菌交配型的途径。本研究通过简并PCR法克隆得到一段531bp... 在担子菌中,编码线粒体中间肽酶(mitochondrial intermediate peptidase,MIP)的基因普遍与交配型A因子紧密连锁。通过mip基因来定位和分离交配型A因子将是一种有效的研究食用真菌交配型的途径。本研究通过简并PCR法克隆得到一段531bp的香菇mip基因片段。经序列比对分析,该序列与已知的担子菌的mip基因之间有很高的同源性。 展开更多
关键词 香菇 交配型基因 A因子 MIP基因
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嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达 预览 被引量:1
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作者 王涛 陈建平 +3 位作者 李虹 张雷 陶大昌 杨春蕾 《四川大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期 773-775,共3页
目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-mip,并研究其在细胞中的表达.方法 PCR扩增嗜肺军团菌mip基因,导入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-mip.用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1- mip转染NIH3T3细胞,采用免... 目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-mip,并研究其在细胞中的表达.方法 PCR扩增嗜肺军团菌mip基因,导入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-mip.用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1- mip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-mip的瞬时表达产物和稳定表达产物.结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-mip成功转入NIH3T3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-mip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-mip在细胞内表达出Mip蛋白.空质粒pcDNA3.1(+)转染的NIH3T3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号.结论成功构建mip基因真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中表达出相对分子质量为24×103的Mip蛋白. 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 MIP基因 转染 体外表达
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应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌 预览 被引量:4
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作者 王中民 杨国芬 +2 位作者 王武芳 孔伟 谭崇阳 《实用预防医学》 CAS 2005年第2期 261-263,共3页
目的建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌.方法采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测.结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102 cfu/ml,6株标准军团菌均扩... 目的建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌.方法采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测.结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出650 bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0%.结论该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法. 展开更多
关键词 MIP基因 聚合酶链反应 检测 嗜肺军团菌
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聚合酶链法检测环境水体中嗜肺军团菌 被引量:1
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作者 王中民 杨国芬 +2 位作者 谭崇阳 孔伟 王武芳 《总装备部医学学报》 2005年第3期6-8,2共4页
目的建立检测环境水体中嗜肺军团菌聚合酶链(PCR)法。方法以嗜肺军团菌特异性保守基因Mip为靶基因,采用Godkex软件设计引物,聚合酶链反应测定。结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出996 bp的条带,... 目的建立检测环境水体中嗜肺军团菌聚合酶链(PCR)法。方法以嗜肺军团菌特异性保守基因Mip为靶基因,采用Godkex软件设计引物,聚合酶链反应测定。结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出996 bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0%。结论该方法快速、灵敏、特异,是检测水体中嗜肺军团菌的有效方法。 展开更多
关键词 MIP基因 聚合酶链反应 嗜肺军团菌
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