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MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立 预览
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作者 罗剑 张敏 +3 位作者 周琳婷 李贝贝 刘旭平 谭文松 《微生物学免疫学进展》 2019年第4期1-6,共6页
目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein ... 目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。 展开更多
关键词 犬肾(MDCK)细胞 宿主细胞蛋白 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 流感疫苗
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适用于生产H5N1流感疫苗的MDCK亚克隆细胞的筛选及检定
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作者 黄晓媛 张家友 +6 位作者 刘洋 赵巍 施金荣 乐欣如 喻刚 韩锡鑫 杨晓明 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期81-87,共7页
目的筛选对H5N1流感病毒高度敏感、低致瘤性的MDCK细胞亚株,并对该细胞株进行全面的检定及分析。方法通过极限稀释法获得细胞亚株,再对各细胞亚株进行血凝滴度、受体丰度和致瘤性检测,筛选出安全性好、敏感性高的细胞亚株,然后对所筛选... 目的筛选对H5N1流感病毒高度敏感、低致瘤性的MDCK细胞亚株,并对该细胞株进行全面的检定及分析。方法通过极限稀释法获得细胞亚株,再对各细胞亚株进行血凝滴度、受体丰度和致瘤性检测,筛选出安全性好、敏感性高的细胞亚株,然后对所筛选细胞亚株进行全面的检定。结果通过细胞克隆试验,共得到108株单细胞亚克隆株,经两轮血凝滴度初筛后得到3株细胞,再经致瘤性及受体丰度比较后选定一株亚克隆株G1作为备选细胞株。核型分析显示该亚细胞株染色体数目众数为78,未发现细菌、真菌、支原体及外源因子污染。裸鼠细胞致瘤性试验显示在观察期末接种部位病理解剖与阴性对照组无显著性差异,细胞未显示明显致瘤性。以细胞裂解物和细胞DNA接种裸鼠,均未致裸鼠产生结节,病理解剖显示与对照组无显著性差异,细胞未显示致癌性。结论筛选出的MDCK-G1亚细胞株符合安全性和敏感性的要求,具有用于大流行流感疫苗生产的潜在可能性。 展开更多
关键词 MDCK细胞 H5N1流感病毒 致瘤性和致癌性
不同培养基中MDCK细胞生长及代谢动力学研究
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作者 赵彩红 王家敏 +4 位作者 李自良 王美皓 臧荣鑫 马忠仁 乔自林 《生物技术》 CAS 2019年第5期485-491,共7页
[目的]为筛选适应于MDCK细胞大规模培养的最佳培养基并揭示其代谢动力学规律。[方法]选取商业化的培养基DMEM(试验组A)、EMEM(试验组B)、MEM(试验组C)、M199(试验组D)、DMEM/F12(试验组E)及DMEM:EMEM复合培养基(试验组F)用于MDCK细胞传... [目的]为筛选适应于MDCK细胞大规模培养的最佳培养基并揭示其代谢动力学规律。[方法]选取商业化的培养基DMEM(试验组A)、EMEM(试验组B)、MEM(试验组C)、M199(试验组D)、DMEM/F12(试验组E)及DMEM:EMEM复合培养基(试验组F)用于MDCK细胞传代培养,研究不同培养基对MDCK细胞生长特性的影响,分析MDCK细胞生长过程中葡萄糖(Gluc)、乳酸(Lac)、谷氨酰胺(Gln)和氨(NH4+)的代谢情况,并进一步进行细胞工厂的培养验证。[结果]结果表明MDCK细胞均能在试验组A、B、E、F四种培养基中生长,其最大增殖浓度E> A> F> B,差异显著(P <0. 05);倍增时间B> F> A> E,差异显著(P <0. 05);细胞比生长速率E> A> F> B,差异不显著(P> 0. 05)。不同培养基培养MDCK细胞对数生长期平均葡萄糖比消耗速率、谷氨酰胺比消耗速率及氨比生成速率差异均不显著(P> 0. 05),乳酸比生成速率差异显著(P <0. 05)。在试验组A和E培养基中细胞能实现高密度增殖,再将其进行细胞工厂扩大培养验证,发现两种培养基在培养48 h时均能达到单层致密,且细胞密度均达到8. 0×10~8/cells以上,差异不显著(P> 0. 05)。[结论]综合研究结果及规模化生产成本因素,采用DMEM培养基(试验组A)培养MDCK细胞,其最大增殖浓度达到6. 4×10~5/m L,倍增时间为22. 835 h,比生长速率为0. 558,可进行大规模培养,为工业化生产提供依据。 展开更多
关键词 MDCK细胞 培养基 细胞工厂 生长特性 代谢动力学
2016年1~4月乌兰察布市流感病毒分离鉴定结果分析
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作者 李瑞丽 《河南预防医学杂志》 2019年第3期228-230,共3页
目的分析2016年乌兰察布市流感病原学分离鉴定结果,进一步加强本市流感监测工作,探索流感病毒的流行与变异情况,为本市未来的流感防控工作提供准确的理论依据。方法 2016年1月~4月哨点医院送检的流感样病例(ILI)患者咽拭子标本,接种MDC... 目的分析2016年乌兰察布市流感病原学分离鉴定结果,进一步加强本市流感监测工作,探索流感病毒的流行与变异情况,为本市未来的流感防控工作提供准确的理论依据。方法 2016年1月~4月哨点医院送检的流感样病例(ILI)患者咽拭子标本,接种MDCK细胞分离培养,采用血凝抑制方法(HAI),鉴定流感病毒的型别和亚型。结果共检测ILI咽拭子标本294份,分离出32株流感病毒,阳性率为10.88%,其中A型H3N2亚型2株,新甲H1N1型4株,B型Yamagata系6株,B型Victoria系20株。结论 2016年1月~4月乌兰察布市流感病毒不同毒株型交替出现,优势毒株为B型Victoria系。这也是乌兰察布市首次利用细胞培养技术成功分离出流感病毒毒株,为本市传染病防控工作提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 流感样病例 MDCK细胞 病毒分离
利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究
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作者 邵玉乐 许曼 +6 位作者 王辉 曾为俊 鲁国涛 赵丽丽 陈洪岩 刘建华 孟庆文 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1128-1135,共8页
TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检... TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。 展开更多
关键词 TLR3 MDCK CRISPR/Cas9 新城疫病毒
新复苏MDCK细胞培养甲型H3N2流感病毒方法的优化
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作者 宋倩 胡平航 +1 位作者 赵文荣 严威敏 《医学动物防制》 2019年第6期578-580,共3页
目的优化甲型H3N2流感病毒在新复苏的犬肾细胞(MDCK)上的培养条件,提高该病毒在新复苏细胞上培养的分离效果。方法选取6例复核鉴定过的甲型H3N2病毒株,以吸附法分别接种于新复苏的MDCK细胞上培养,检测收获病毒液HA滴度,通过比较不同的... 目的优化甲型H3N2流感病毒在新复苏的犬肾细胞(MDCK)上的培养条件,提高该病毒在新复苏细胞上培养的分离效果。方法选取6例复核鉴定过的甲型H3N2病毒株,以吸附法分别接种于新复苏的MDCK细胞上培养,检测收获病毒液HA滴度,通过比较不同的细胞胞龄、细胞代次、病毒接种吸附时间对甲型H3N2流感病毒易感性的影响,确定最佳培养条件。结果不同胞龄MDCK细胞接种H3N2病毒后,胞龄为3 d、4 d的细胞所收获的病毒液HA滴度均明显高于其他组,差异有统计学意义(F=1. 279,P=0. 027);对复苏后第2代、第3代、第4代细胞进行接种后,H3N2病毒HA均明显高于第一代细胞,差异有统计学意义(F=0. 765,P=0. 008);病毒接种吸附时间(1~2 h)对甲型H3N2病毒HA滴度没有明显影响,差异无统计学意义(F=2. 743,P=0. 178)。结论甲型H3N2病毒接种于新复苏MDCK细胞最佳培养条件为:选用复苏后传代培养至第二代及以后、胞龄3~4 d的MDCK细胞进行接种,接种吸附时间1~2 h之内,可获得HA滴度较高的甲型H3N2流感病毒液。 展开更多
关键词 甲型H3N2 MDCK细胞 HA滴度
犬细小病毒通过促进ROS产生/线粒体损伤诱导宿主细胞的凋亡 预览
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作者 王岩 张建楼 +4 位作者 赵轶男 王晓敏 王猛 李笑然 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期99-103,114共6页
为探讨犬细小病毒(CPV)引起宿主细胞凋亡的分子机制,用CPV感染MDCK细胞,感染后通过台盼蓝染色法检测不同时间的细胞存活率,用Annexin V-FITC/PI法检测磷脂酰丝氨酸外翻情况,用试剂盒检测Caspase-3活性,分析CPV诱导细胞的凋亡。并通过流... 为探讨犬细小病毒(CPV)引起宿主细胞凋亡的分子机制,用CPV感染MDCK细胞,感染后通过台盼蓝染色法检测不同时间的细胞存活率,用Annexin V-FITC/PI法检测磷脂酰丝氨酸外翻情况,用试剂盒检测Caspase-3活性,分析CPV诱导细胞的凋亡。并通过流式细胞术检测细胞线粒体的损伤和ROS的产生探讨其分子机制。结果显示,随着病毒感染时间的不断延长,CPV可明显降低MDCK细胞存活率,促进磷脂酰丝氨酸外翻,增强Caspase-3活性,表明CPV可引起细胞凋亡。同时还发现CPV可明显提高细胞内ROS的水平,引起线粒体的损伤,这可能是CPV诱导细胞凋亡的重要分子基础。由此可见,CPV诱导MDCK细胞凋亡与CPV增加细胞ROS的产生和线粒体的损伤有关。 展开更多
关键词 犬细小病毒 细胞凋亡 MDCK ROS 线粒体损伤
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重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化 预览
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作者 李莉 杜鑫 +7 位作者 张丽娜 杨柳 高晓庆 唐东雪 赵海源 蒋晓梅 张天舒 李金祥 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第17期3415-3426,共12页
【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂... 【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10^-4,最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL^-1,根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10^8.5 TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10^8.5 EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10^-2 ,最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL^-1。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。 展开更多
关键词 重组禽流感病毒 MDCK细胞 悬浮MDCK细胞 病毒含量
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蒙药玉簪花中支托皂苷元及其三个皂苷的体外细胞毒活性研究 预览
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作者 武毛毛 李晓娟 +4 位作者 薛培凤 石松利 李春燕 解红霞 张金花 《现代中药研究与实践》 CAS 2018年第2期16-18,共3页
目的对玉簪花中分离得到的4个单体化合物进行体外细胞毒作用研究。方法采用MTT实验考察四个化合物对狗肾细胞MDCK的细胞毒性和对人慢性髓源性白血病细胞K562、小鼠淋巴瘤细胞YAC-1、人肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖抑制作用。结果玉簪花... 目的对玉簪花中分离得到的4个单体化合物进行体外细胞毒作用研究。方法采用MTT实验考察四个化合物对狗肾细胞MDCK的细胞毒性和对人慢性髓源性白血病细胞K562、小鼠淋巴瘤细胞YAC-1、人肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖抑制作用。结果玉簪花中四个单体化合物对四个细胞株均表现出不同程度的生长抑制作用。化合物1和化合物2对MDCK细胞株的IC50值分别为287.38μg/ml,5.12μg/ml。化合物1对三个肿瘤细胞株K562、YAC-1、SMMC-7721的IC_(50)值分别为0.17μg/ml、5.38μg/ml、2.84μg/ml,化合物2对K562、YAC-1、SMMC-7721亦呈现明显的增殖抑制作用。结论化合物1对癌细胞具有良好的选择性,化合物2对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用,但对正常细胞毒性很强。化合物1和2可作为玉簪花药材的质量标志物。 展开更多
关键词 玉簪花 MDCK细胞 K562细胞 YAC-1细胞 SMMC-7721细胞
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麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒作用及机制研究
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作者 魏文扬 万海同 +2 位作者 虞立 卢亦愚 何昱 《中国中药杂志》 CSCD 北大核心 2018年第3期563-570,共8页
为探讨麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒的作用及可能机制,该研究以感染甲型H1N1流感病毒的狗肾(MDCK)细胞为载体,细胞病变(CPE)法测定甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株(A/PR8/34)对MDCK细胞的半数细胞培养物感染剂量(TCID(50));采用... 为探讨麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒的作用及可能机制,该研究以感染甲型H1N1流感病毒的狗肾(MDCK)细胞为载体,细胞病变(CPE)法测定甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株(A/PR8/34)对MDCK细胞的半数细胞培养物感染剂量(TCID(50));采用阻断流感病毒侵入宿主细胞和抗流感病毒生物合成2种不同方式给药,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒的有效率(ER)、半数抑制浓度(EC(50))和治疗指数(TI);并且通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测技术,分别在给药后24,48 h,考察麻黄汤对感染甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞中病毒载量以及TLR4,TLR7,My D88,TRAF6 mRNA表达的影响。实验结果显示,甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为1×10^-4.32/mL;2种给药方式抗流感病毒的EC50分别为4.92,1.59 g·L^-1,TI分别为12.53,38.78,并且当质量浓度为5.00 g·L^-1时,麻黄汤抗流感病毒的ER分别为50.21%和98.41%,说明麻黄汤可以阻断流感病毒侵入宿主细胞,并可显著抑制流感病毒在细胞内的生物合成;同时,相比于病毒组,给药后24,48 h麻黄汤各剂量组的病毒载量表达均显著降低,高、中剂量组显著下调了细胞中TLR4,TLR7,My D88,TRAF6 mRNA的表达水平,从而表明麻黄汤发挥抗流感病毒的作用机制,可能与其抑制细胞内流感病毒的复制以及TLR4和TLR7信号通路中的相关基因有关。 展开更多
关键词 麻黄汤 MDCK细胞 甲型H1N1流感病毒 病毒载量 TLR4 TLR7
狗肾传代细胞分离培养流感病毒单因素分析
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作者 史晓林 卢千超 +2 位作者 方仙 赵静 李真 《中国卫生检验杂志》 CAS 2018年第7期806-808,共3页
目的对影响狗肾传代细胞(MDCK细胞)分离流感病毒阳性率的相关因素进行单因素分析。方法选择2013年-2016年南阳市哨点医院送检流感样病例(ILI)咽拭子中PCR检测阳性的标本,采用MDCK细胞培养法进行流感病毒的分离培养,并对咽拭子标本... 目的对影响狗肾传代细胞(MDCK细胞)分离流感病毒阳性率的相关因素进行单因素分析。方法选择2013年-2016年南阳市哨点医院送检流感样病例(ILI)咽拭子中PCR检测阳性的标本,采用MDCK细胞培养法进行流感病毒的分离培养,并对咽拭子标本从采样、核酸检测和细胞分离等环节中的一些因素进行卡方检验和分析。结果不同监测年度、新甲型H1N1流感病毒核酸检测Ct值大小对病毒分离结果影响差异有统计学意义(P〈0.05);不同流感病毒型别(或系)的MDCK细胞一代分离培养阳性率差异有统计学意义(P〈0.05)。结论不同的监测年度,病毒分离阳性率也不同;新甲型H1N1流感病毒核酸检测Ct值大小影响其病毒分离阳性率,Ct值越小,病毒分离阳性率越高;不同流感病毒型别MDCK细胞一代病毒分离阳性率不同,季甲型H3流感病毒MDCK细胞分离培养第一代阳性率明显低于B型和新甲型H1N1流感病毒。 展开更多
关键词 流感病毒 MDCK细胞 阳性率 单因素分析
流感疫苗的研究进展 预览
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作者 窦晓霞 王家敏 李倬 《西北民族大学学报:自然科学版》 2018年第1期63-67,共5页
流感是一种严重危害人类健康的传染病,目前接种传统的鸡胚灭活疫苗仍是预防流感的主要措施.近几年,生产工艺先进、副作用小的新型流感类病毒颗粒疫苗、重组活载体疫苗、病毒核酸疫苗和广谱疫苗的研究均有突破性进展,尤其基于MDCK细胞和V... 流感是一种严重危害人类健康的传染病,目前接种传统的鸡胚灭活疫苗仍是预防流感的主要措施.近几年,生产工艺先进、副作用小的新型流感类病毒颗粒疫苗、重组活载体疫苗、病毒核酸疫苗和广谱疫苗的研究均有突破性进展,尤其基于MDCK细胞和Vero细胞等哺乳动物细胞培养的流感疫苗在欧美国家已经上市,有替代传统疫苗的趋势. 展开更多
关键词 流感 传统疫苗 新型疫苗 MDCK细胞
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MDCK细胞微载体培养条件优化研究 预览
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作者 马启财 武文莉 +1 位作者 马富龙 潘和平 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2018年第12期90-95,共6页
研究细胞接种量、搅拌转速和微载体浓度对MDCK细胞微载体培养时的影响,以合理优化MDCK细胞微载体培养最大增殖时期的最优条件,对疫苗和病毒分离具有重要意义,以期达到在疫苗和病毒分离领域提高生产效率。采用微载体培养MDCK细胞,在不同... 研究细胞接种量、搅拌转速和微载体浓度对MDCK细胞微载体培养时的影响,以合理优化MDCK细胞微载体培养最大增殖时期的最优条件,对疫苗和病毒分离具有重要意义,以期达到在疫苗和病毒分离领域提高生产效率。采用微载体培养MDCK细胞,在不同搅拌转速、微载体浓度和细胞接种量进行培养,每隔24h取样计数,确定最优的培养条件。结果表明,细胞接种量在20个/球、搅拌转速45r/min和载体浓度在2g/L时,MDCK细胞的增殖较快,细胞密度较大,细胞的密度最大可达15.6×10^6个/mL,适合MDCK细胞增殖生长。 展开更多
关键词 MDCK细胞 细胞量 微载体培养
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犬细小病毒YBYJ株体外诱导MDCK宿主细胞凋亡的研究 预览 被引量:1
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作者 张立媛 张紫璇 +4 位作者 李卓昕 王美琪 刘晋宇 高旭 鲁承 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期630-633,共4页
为研究犬细小病毒(CPV)在体外能否诱导MDCK宿主细胞凋亡,本研究应用前期分离到的CPV YBYJ强毒株接种MDCK细胞,通过倒置显微镜观察CPV导致MDCK宿主细胞病变(CPE)情况,采用细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细... 为研究犬细小病毒(CPV)在体外能否诱导MDCK宿主细胞凋亡,本研究应用前期分离到的CPV YBYJ强毒株接种MDCK细胞,通过倒置显微镜观察CPV导致MDCK宿主细胞病变(CPE)情况,采用细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3活性检测试剂盒检测,观察CPV诱导MDCK宿主细胞凋亡情况。结果显示,CPV YBYJ强毒株可导致MDCK宿主细胞产生明显CPE,并出现明显的DNA Ladder,Annexin V-FITC/PI双染为阳性,Caspase-3活性显著升高,提示CPV在体外能够诱导MDCK宿主细胞凋亡。 展开更多
关键词 犬细小病毒 犬肾细胞 细胞凋亡
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基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发 预览 被引量:1
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作者 代为俊 刘旭平 周燕 《中国兽药杂志》 北大核心 2017年第8期46-51,共6页
为放大流感疫苗生产工艺至1500L反应器规模,通过冷模实验研究了不同体积反应器条件下的混合时间、流体剪切力、体积氧传递系数和二氧化碳传递系数的区别。在1500L反应器中进行培养时,转速为60r/min,深层通气速率控制在22.5L/min... 为放大流感疫苗生产工艺至1500L反应器规模,通过冷模实验研究了不同体积反应器条件下的混合时间、流体剪切力、体积氧传递系数和二氧化碳传递系数的区别。在1500L反应器中进行培养时,转速为60r/min,深层通气速率控制在22.5L/min能够较好的满足供氧需求和提高CO,的移除效果,同时也避免了剪切力对细胞的损伤。在1500L反应器中病毒感染细胞60h后,病毒滴度为2“HAunits/25IxL,单位细胞病毒产量(Svy)为13145.05virions/cell,2L反应器的Svy为13298.70virions/cell。两者仅相差1.16%。 展开更多
关键词 流感疫苗 MDCK细胞 生物反应器 冷模实验 放大
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H3N2流感病毒体外细胞传代引起的变异
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作者 李晓燕 Yipu Lin +3 位作者 孔梅 邹明 郭丽茹 苏旭 《国际病毒学杂志》 2017年第1期22-26,共5页
目的了解用不同来源MDCK细胞分离H3N2流感病毒时,HA和NA片段氨基酸变异情况。方法选取H3N2流感病毒核酸阳性的咽拭子标本13份,分别在三种不同来源的MDCK细胞中传5代。对标本中病毒及细胞传代的病毒进行HA和NA基因序列测定,分析病毒... 目的了解用不同来源MDCK细胞分离H3N2流感病毒时,HA和NA片段氨基酸变异情况。方法选取H3N2流感病毒核酸阳性的咽拭子标本13份,分别在三种不同来源的MDCK细胞中传5代。对标本中病毒及细胞传代的病毒进行HA和NA基因序列测定,分析病毒传代后HA和NA片段变异情况。结果与咽拭子中的病毒序列相比,MDCK5代病毒和MDCK-parent5代病毒均发生了HA和/或NA的突变。9株MDCK5代病毒HA发生了P221L/P/H突变;8株病毒发生了NA片段的148位或151位的突变。2株MDCK-parent5代病毒HA221位为多态性。13株病毒MDCK-parent传代后均发生了NA多态性,大多发生在151位。在MDCK-SIAT传5代后的病毒HA均无突变,3株有NA突变。结论在对流感病毒进行抗原性分析前对病毒进行细胞传代会发生病毒的适应性突变。H3N2流感病毒在MDCK、MDCK-parent中传代后,会引起HA和/或NA突变;MDCK-SIAT传代,病毒变异明显减少。 展开更多
关键词 流感病毒 变异 MDCK细胞
山银花水提物体外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究 预览 被引量:3
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作者 陈灵 周艳萌 +1 位作者 欧水平 任丽 《中国药房》 北大核心 2017年第16期2194-2197,共4页
目的:考察山银花水提物(SYHW)体外抗甲型H1N1流感病毒(H1N1病毒)的作用。方法:以H1N1病毒感染体外培养的犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞),计算病毒的半数组织培养感染剂量(TCID(50));以不同质量浓度SYHW作用MDCK细胞24 h,考察... 目的:考察山银花水提物(SYHW)体外抗甲型H1N1流感病毒(H1N1病毒)的作用。方法:以H1N1病毒感染体外培养的犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞),计算病毒的半数组织培养感染剂量(TCID(50));以不同质量浓度SYHW作用MDCK细胞24 h,考察其最大无毒浓度。然后将试验分为正常细胞组、病毒对照组和SYHW预防给药组、治疗给药组和直接杀灭给药组(均给予最大无毒浓度的SYHW,并以100 TCID(50)H1N1病毒感染细胞),测定SYHW的抗病毒有效率(ER);将试验分为正常细胞组、病毒对照组和SYHW治疗给药组、直接杀灭给药组(给药及病毒感染方法同上),分别测定细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡率的变化。结果:H1N1病毒的100 TCID(50)为1.26×10~(-7),SYHW对MDCK细胞的最大无毒浓度为50μg/m L(细胞存活率为91.3%)。SYHW预防给药组、SYHW治疗给药组和SYHW直接杀灭给药组的ER分别为0、80.3%、52.7%。与正常细胞组比较,病毒对照组细胞的PI值显著降低(P〈0.05),早期、晚期凋亡率显著升高(P〈0.05);与病毒对照组比较,SYHW直接杀灭给药组细胞的PI值显著升高、早期凋亡率显著降低(P〈0.05),SYHW治疗给药组细胞的早期凋亡率显著降低(P〈0.05)。结论:SYHW具有体外抗H1N1病毒的作用,且以治疗给药和直接杀灭给药抗病毒作用较好。 展开更多
关键词 山银花 水提物 MDCK细胞 甲型H1N1流感病毒 体外
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中药药物性口罩的制备及其
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作者 江波 李利丹 +1 位作者 张淋淋 李玉虎 《上海中医药大学学报》 CAS 2017年第1期82-86,共5页
目的:制备不同组方的中药药物性口罩,并评价其对流感病毒H1N1的抑制作用。方法:组方1(射干、甘草)与组方2(金银花、甘草)分别乙醇提取,以提取液浸泡纯棉脱脂纱布口罩2h,分别制备1号、2号口罩,烘干备用。用制备药物性口罩的原... 目的:制备不同组方的中药药物性口罩,并评价其对流感病毒H1N1的抑制作用。方法:组方1(射干、甘草)与组方2(金银花、甘草)分别乙醇提取,以提取液浸泡纯棉脱脂纱布口罩2h,分别制备1号、2号口罩,烘干备用。用制备药物性口罩的原液作用于流感病毒感染的犬肾细胞(MDCK),取细胞上清液进行血凝试验,比较各组细胞上清液的血凝效价,Real-time PCR法测定细胞内流感病毒血凝素(HA)基因的mRNA表达;将流感病毒H1N1液分别过滤药物性口罩,收集口罩滤液,检测滤液中流感病毒HA的效价。结果:组方1作用于流感病毒感染的MDCK细胞后,上清液的血凝效价由210降为26,组方2的血凝效价由210下降为25;与模型组比较,药物组细胞内流感病毒HA基因的mRNA表达量均明显减少(P〈0.05)。1号口罩过滤流感病毒H1N1液后,HA的效价由2-12下降为2-5,2号口罩过滤后的效价由2-12下降为2-6。结论:中药组方醇提液可有效抑制流感病毒在MDCK内RNA的复制;中药药物性口罩能够有效破坏流感病毒包膜上的血凝素,可有效阻断流感病毒的传染。 展开更多
关键词 中药药物性口罩 流感病毒 血凝试验 犬肾细胞 RT-PCR
沉默Kif5b赋予MDCK细胞干性 预览
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作者 崔菊 金国祥 +3 位作者 雷霆 王在 黄建东 蔡剑平 《医学研究杂志》 2016年第5期58-62,共5页
目的观察沉默Kif5b对上皮细胞MDCK的影响并探讨Kif5b表达水平与细胞分化程度的相关性。方法设计构建靶向Kif5b基因的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,并转染犬肾上皮细胞株MDCK,检测其对Kif5b表达的抑制作用;采用Western blot法检测E-钙... 目的观察沉默Kif5b对上皮细胞MDCK的影响并探讨Kif5b表达水平与细胞分化程度的相关性。方法设计构建靶向Kif5b基因的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,并转染犬肾上皮细胞株MDCK,检测其对Kif5b表达的抑制作用;采用Western blot法检测E-钙黏蛋白(E—cadherin),N-钙黏蛋白(N—cadherin),波形蛋白(vimentin)在各组细胞中的表达差异;通过细胞诱导液培养检测细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力。结果从形态上看,对照组MDCK细胞间紧密相连,呈鹅卵石状分布,而Kif5b沉默的细胞呈成纤维细胞状;与对照组相比,转染Kif5b—shRNA显著抑制Kif5b的表达,同时E—cadherin的表达下降,N—cadherin和vimentin的表达上升,细胞抵抗胰蛋白酶消化的能力降低;沉默Kif5b的MDCK细胞能被分化为脂肪细胞和成骨细胞;此外,Kif5b在MDCK中的表达量显著高于小鼠间充质干细胞(mesenehymal stem cell)。结论在MDCK细胞中沉默Kif5h诱导MDCK细胞经历上皮细胞-间充质转化(epithelial—mesenchymal transition)过程,去分化为间充质干细胞样细胞,去分化的细胞能够被转分化为特化的脂肪细胞和成骨细胞。Kif5b的表达量与细胞的分化程度呈正相关。 展开更多
关键词 Kinesin-1 MDCK细胞上皮细胞-间充质转化 间充质干细胞
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慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建 被引量:2
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作者 谢宝明 于国伟 +2 位作者 令世鑫 马忠仁 柏家林 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期23-28,69共7页
[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉... [目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×10^7TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。 展开更多
关键词 FRT-LacZ基因 慢病毒载体 MDCK细胞 位点特异性重组
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