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酶的定向进化及其应用进展 预览
1
作者 许勇 《安徽农业科学》 CAS 2018年第23期12-14,共3页
酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略,主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前,突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组;高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表... 酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略,主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前,突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组;高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表面展示、核糖体展示和差示荧光扫描等相关技术及其应用情况。 展开更多
关键词 定向进化 易错PCR DNA改组 高通量筛选
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人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定 预览
2
作者 李晶琴 孔庆利 安云庆 《首都医科大学学报》 北大核心 2017年第6期903-910,共8页
目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中... 目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 人杀菌 渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组
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蛋白质定向进化技术概述 预览 被引量:1
3
作者 王松明 顾招兵 +4 位作者 朱雅新 冷静 冯励 李清 杨舒黎 《中国饲料》 北大核心 2017年第14期15-19,23共6页
定向进化技术是近二十年发展起来的蛋白质改造技术,其可通过对基因的突变和重组来构建突变库,然后通过高通量的筛选鉴定性能改善的突变体,此技术是改善酶性能最有效的途径之一。本文就定向进化技术的几种常用方法和定向进化后的文库筛... 定向进化技术是近二十年发展起来的蛋白质改造技术,其可通过对基因的突变和重组来构建突变库,然后通过高通量的筛选鉴定性能改善的突变体,此技术是改善酶性能最有效的途径之一。本文就定向进化技术的几种常用方法和定向进化后的文库筛选、应用及展望进行了概述。 展开更多
关键词 定向进化 易错PCR DNA改组 定向筛选
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DNA改组技术提高低温脂肪酶Lip98热稳定性
4
作者 苏宏飞 麦志茂 张偲 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期293-299,共7页
[目的]提高来源于海洋微生物的低温脂肪酶Lip98的热稳定性。[方法]采用DNA改组技术进行低温脂肪酶的基因改造,连接到表达载体p ET-28a中构建小突变文库。经过活性筛选产酶重组菌株。在96孔板中进行两轮热稳定筛选突变株。[结果]经过2轮... [目的]提高来源于海洋微生物的低温脂肪酶Lip98的热稳定性。[方法]采用DNA改组技术进行低温脂肪酶的基因改造,连接到表达载体p ET-28a中构建小突变文库。经过活性筛选产酶重组菌株。在96孔板中进行两轮热稳定筛选突变株。[结果]经过2轮筛选,获得了两个突变株P92A和I199F。其突变位点分别是274位的C变成了G和595位的A变成了T。突变株50℃下的半衰期从24 min分别延长到38 min、85 min。[结论]DNA改组有效提高Lip98的热稳定性,半衰期提高到1.5~3.5倍,为酶的分子改造提供理论依据。 展开更多
关键词 低温脂肪酶 热稳定性 DNA改组
基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用 预览 被引量:4
5
作者 刘媛 林曼曼 +5 位作者 张霄 徐重新 焦凌霞 仲建锋 武爱华 刘贤金 《浙江大学学报:农业与生命科学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-7,共7页
从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技... 从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技术可以解决库来源抗体亲和力不高、实际应用难的问题,也可以帮助天然抗体突破其亲和力极限。抗体基因体外突变技术可以模拟自体高频突变过程,是抗体亲和力体外成熟的重要手段,常见的抗体基因体外突变技术可以分为易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA改组、突变株、定点突变和链替换等方法。易错PCR可以在抗体基因全长或部分区域随机引入突变,但随着突变率的增加,阳性克隆数量呈指数性递减。DNA改组包括抗体片段随机化切割和重组步骤,可以加快抗体的体外进化速度。突变株法易于构建超大容量的抗体库,但有害突变和突变率难以控制。定点突变的区域通常选择与抗原直接接触的互补决定区(complementary determination region,CDR)或自体突变热点进行操作。链替换通常保留母体抗体的一条重链或轻链,而对另一条链进行随机化组合。这些基因突变方法在提高抗体亲和力中获得了不同程度的应用,但也存在效率不高,且方法选择较为盲目等问题。可是,采用抗体X射线晶体衍射和计算机模拟等方法,却可以帮助预测抗体结合部位,为突变位点的理性设计和方法选择提供有效信息,因而成为亲和力体外成熟技术未来发展的趋势之一。 展开更多
关键词 抗体 亲和力成熟 易错PCR DNA改组 突变株 定点突变 链替换
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通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc 预览 被引量:2
6
作者 张凯 蔡恒 汪晨 《生物加工过程》 CAS 2015年第5期20-25,共6页
利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据... 利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。 展开更多
关键词 DNA改组 定向进化 赖氨酸脱羧酶 蜂房哈夫尼菌 大肠杆菌
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spy1的DNA改组提高普那霉素的产量 预览 被引量:4
7
作者 金庆超 沈娜 +1 位作者 杨郁 金志华 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期178-182,191共6页
目的 研究普那霉素产生菌株选育的分子育种方法,提高普那霉素的产量.方法 对来自6种始旋链霉菌基因组重排菌株的spy1调控基因,进行DNA改组研究,然后筛选阳性接合子进行发酵,HPLC法测定普那霉素两组分的产量变化.结果 建立了普那霉素生... 目的 研究普那霉素产生菌株选育的分子育种方法,提高普那霉素的产量.方法 对来自6种始旋链霉菌基因组重排菌株的spy1调控基因,进行DNA改组研究,然后筛选阳性接合子进行发酵,HPLC法测定普那霉素两组分的产量变化.结果 建立了普那霉素生物合成调控基因spy1的改组基因库,筛选出71个spy1改组接合子.接合子的普那霉素Ⅰ产量都有了不同程度的提高,最高产量为出发菌株7.5倍,达60mg/L;普那霉素Ⅱ产量则没有显著变化.结论 利用DNA改组技术进行调控基因的分子进化可以有效提高抗生素的产量,为普那霉素分子育种研究中的首次尝试. 展开更多
关键词 始旋链霉菌 普那霉素生物合成 DNA改组 spy1基因
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SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段体外组装和siRNA干扰研究 预览
8
作者 马成川 谭光宏 +1 位作者 阳宇 李灵 《四川大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1307-1311,共5页
为了安全便捷地获取严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus,SARS coronavirus)的RdRp基因,作者合成了26条寡聚核苷酸片段,利用组装PCR(assembly PCR)在体外构建了SARS病毒的RdRp基因片段,... 为了安全便捷地获取严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus,SARS coronavirus)的RdRp基因,作者合成了26条寡聚核苷酸片段,利用组装PCR(assembly PCR)在体外构建了SARS病毒的RdRp基因片段,并建立了基于Vero E6细胞的SARS RdRp基因的稳定表达株.之后设计了4对针对SARS RdRp基因的siRNA,基因干扰表明这4对siRNA均能高效干扰SARS RdRp基因在Vero E6细胞中的表达.至此,本文提供了一种安全便捷地获取病毒基因的方法. 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 RDRP DNA改组
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粉尘螨主要变应原基因Der f2和Der f3基因改组的优化 预览
9
作者 刘志明 姜玉新 李朝品 《热带病与寄生虫学》 2014年第1期3-6,共4页
目的:优化粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法 RT- PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f2和Der f3基因10、15、20、25、30min;酶解相同时间的Der f2和D... 目的:优化粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法 RT- PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f2和Der f3基因10、15、20、25、30min;酶解相同时间的Der f2和Der f3基因两两混合,采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因进行重组,电泳检测重组子。结果以Der f1 F和Der f1 R、Der f2 F和Der f2 R为引物分别在酶切10min、15min、20min、25min均可扩增出清晰条带;以Der f2 F和Der f3 R为引物在酶切10min、15min和30min的模板中亦出现PCR片段。结论通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因间的融合基因,为大规模制备高效,低价的哮喘疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 DNA改组 Derf2 Derf3 融合基因 优化
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瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造 被引量:4
10
作者 陈小玲 陈东 +1 位作者 张穗生 陈英 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期288-292,共5页
为了提高瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产... 为了提高瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。 展开更多
关键词 碳源阻遏 DNA改组 cre1基因 瑞氏木霉
DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用
11
作者 潘素晶 徐增辉 +1 位作者 张悦 钱其军 《科学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期411-418,共8页
DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adeno-associated virus.AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有... DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adeno-associated virus.AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论. 展开更多
关键词 DNA改组 AAV衣壳蛋白
分子定向进化研究进展 预览
12
作者 袁卫生 刘红全 林小园 《湖南农业科学:上半月》 2013年第7期12-15,共4页
分子定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略,由编码基因的随机突变、重组和定向筛选构成。在不了解蛋白的三维结构信息和功能机制的情况下,利用这一技术调整目标蛋白的性质,如专一性、催化活性及亲和力等。近年来在易错PCR... 分子定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略,由编码基因的随机突变、重组和定向筛选构成。在不了解蛋白的三维结构信息和功能机制的情况下,利用这一技术调整目标蛋白的性质,如专一性、催化活性及亲和力等。近年来在易错PCR和DNA shuffling的基础上已经出现了很多新的分子定向进化技术。概述了易错PCR和DNA shuffling的原理及其发展与应用。 展开更多
关键词 定向进化 易错PCR DNA改组 筛选
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酶定向进化方法的研究进展 预览 被引量:1
13
作者 张林 朱小翌 江明锋 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第8期68-71,共4页
酶作为一种生物催化剂,已广泛应用于生活和生产中,但能直接应用于工业生产的天然酶并不多,因此,需要对酶进行人工改造。分子定向进化是在实验室模拟自然进化过程的一种技术,已广泛用于酶的改造中,并取得了较好的成绩。作者将简要介绍酶... 酶作为一种生物催化剂,已广泛应用于生活和生产中,但能直接应用于工业生产的天然酶并不多,因此,需要对酶进行人工改造。分子定向进化是在实验室模拟自然进化过程的一种技术,已广泛用于酶的改造中,并取得了较好的成绩。作者将简要介绍酶定向进化的原理、方法及应用,并展望其发展前景。 展开更多
关键词 定向进化 化学诱变 易错PCR DNA改组 随机引发体外重组
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粉尘螨主要变应原基因Derf1和Derf3改组的研究 预览
14
作者 姜玉新 郭伟 +3 位作者 马玉成 刘志明 陈琪 李朝品 《皖南医学院学报》 CAS 2013年第2期87-91,共5页
目的:探索粉尘螨变应原基因Der f 1和Der f 3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因.方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f 3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f 3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f ... 目的:探索粉尘螨变应原基因Der f 1和Der f 3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因.方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f 3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f 3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f 1和Der f 3基因片段两两混合,采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Der f 1和Der f 3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子.结果:以Der f 2 F和Der f 2 R为引物在酶切10、15、20、25、30 min均可扩增出清晰条带;以Der f 1 F和Der f 1 R、Der f 1 F和Der f 2 R、Der f 2 F和Der f 1 R为引物在酶切10、15、20、25、30 min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带.结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f 1和Der f 3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础. 展开更多
关键词 DNA改组 Derf1 Derf3 融合基因
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定向进化改造猪肾氨基酰化酶Ⅰ底物特异性 预览 被引量:1
15
作者 刘志刚 杨波 胡征 《食品与发酵科技》 CAS 2012年第5期35-39,45共6页
应用定向进化技术提高了猪肾氨基酰化酶I(pACYl)对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的底物特异性和热稳定性。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了pACY。的突变体文库;利用营养选择平板和96孔板耐热双重筛选体系。经过5轮改组和筛选... 应用定向进化技术提高了猪肾氨基酰化酶I(pACYl)对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的底物特异性和热稳定性。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了pACY。的突变体文库;利用营养选择平板和96孔板耐热双重筛选体系。经过5轮改组和筛选,得到突变酶7E15对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的特异性活力分别提高了23倍和9倍.Tm值提高了7℃。突变酶的氨基酸序列中有7个氨基酸残基发生了替换,分别是L176A、R196T、A283G、V304G、K306Q、V369A和L370T。结构模拟结果显示,突变位点L176A、V369A和L370T靠近酶活性中心,影响了底物的结合:而R196T、A283G、V304G和K306Q离酶活性中心较远,可能对酶的热稳定性起到了关键作用。 展开更多
关键词 氨基酰化酶I 易错PCR DNA改组 底物特异性
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尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2的DNA改组及生物信息学分析 预览 被引量:4
16
作者 马玉成 朱涛 +1 位作者 姜玉新 李朝品 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2012年第6期 634-638,共5页
目的构建尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2嵌合基因文库,并进行生物信息学分析。方法用PCR分别扩增Der f2和Der p2,扩增产物等量混合后用DNaseⅠ酶解;回收50~100 bp的片段,连续3轮无引物PCR,以Der f2基因的特异性引物进行有引物PCR,扩增... 目的构建尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2嵌合基因文库,并进行生物信息学分析。方法用PCR分别扩增Der f2和Der p2,扩增产物等量混合后用DNaseⅠ酶解;回收50~100 bp的片段,连续3轮无引物PCR,以Der f2基因的特异性引物进行有引物PCR,扩增片段连接于pUCm-T载体并转化E.coli DH-5α,随机挑取60个单菌落测序,应用生物信息学进行序列比对分析和抗原表位预测(包括T和B细胞抗原表位)。结果获得的10个重组子其编码蛋白不仅呈现新的Th细胞表位,也减少了B细胞表位。结论成功获得Der f2和Der p2嵌合基因文库,为后期筛选和制备高免疫原性和低变应原性的高效尘螨哮喘疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 变应原 嵌合基因 DNA改组
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酶的定向进化研究及其在工业生物催化中的应用 预览 被引量:6
17
作者 苏龙 庄宇 何冰芳 《生物加工过程》 CAS CSCD 2011年第4期 69-75,共7页
综合概括了各种蛋白质改造与微生物代谢途径改造的非理性定向进化技术的原理、特点,介绍了这些技术在高性能工业生物催化剂改造中的应用。
关键词 定向进化 DNA改组 易错PCR 工业生物催化
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定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力 被引量:6
18
作者 李一男 贾会勇 +2 位作者 闫巧娟 江正强 杨绍青 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期 1797-1804,共8页
应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomycesthermophila儿8耐热β.1,3-1,4.葡聚糖酶(PtLicl6A)在酸性条件下的催化能力。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了B.葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通... 应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomycesthermophila儿8耐热β.1,3-1,4.葡聚糖酶(PtLicl6A)在酸性条件下的催化能力。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了B.葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系。筛选得到的突变酶PtLicl6AMl的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活。突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G。结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用。 展开更多
关键词 嗜热拟青霉 β-1 3.1 4.葡聚糖酶 易错PCR DNA改组
过氧化氢酶基因定向进化文库的构建及其评价
19
作者 田亚茸 王颖慧 +3 位作者 徐美爱 林峻 林娟 叶秀云 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期82-87,共6页
采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系... 采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系提高约10倍,DNA改组的突变率则更高,但是难以避免由于突变率太高造成的目的基因无法正确翻译这一情况。另外,应用邻接法(neighbor-joining,NJ)对随机选择的过氧化氢酶基因突变体序列和野生型序列做核酸和蛋白质序列的NJ进化树,进化关系与突变率分析基本一致。 展开更多
关键词 梅花鹿过氧化氢酶 易错聚合酶链反应 DNA改组 突变 进化树
DNA改组在现代生物工程中的应用 预览 被引量:1
20
作者 李健炜 陈建华 《药学进展》 CAS 2010年第8期 344-350,共7页
概述了DNA改组技术的原理和特点,并对该技术应用于蛋白质、酶和细胞因子的定向进化及代谢工程的研究成果进行了简要介绍。DNA改组技术自20世纪90年代发明以来飞速发展,逐渐成为一种广泛应用的分子定向进化手段。
关键词 DNA改组 分子定向进化 现代生物工程
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