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核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因的克隆及表达分析 预览
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作者 王企 陈利娜 +4 位作者 夏小丛 敬丹 李好先 骆翔 曹尚银 《江西农业学报》 CAS 2019年第4期13-20,共8页
为了了解核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因在核桃雌雄异熟开花机制中的作用,以核桃雌先型品种‘极早丰’与雄先型品种‘新早丰’在3个时期(2月6日、3月21日及4月7日)的雌、雄花芽为试验材料,结合荧光定量PCR(qRT-PCR)、RT-PCR扩增、生... 为了了解核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因在核桃雌雄异熟开花机制中的作用,以核桃雌先型品种‘极早丰’与雄先型品种‘新早丰’在3个时期(2月6日、3月21日及4月7日)的雌、雄花芽为试验材料,结合荧光定量PCR(qRT-PCR)、RT-PCR扩增、生物信息技术,分析了核桃JrFT基因的结构与表达,预测了JrFT基因的功能。结果表明:核桃JrFT基因在‘极早丰’与‘新早丰’3个时期的雌、雄花芽中均有表达;在不同时期同一花芽JrFT基因的表达量有所差异;在同一时期,JrFT基因在雌花中的表达量明显高于雄花,在‘新早丰’雄花中的表达量高于在‘极早丰’雄花中的表达量。克隆获得了JrFT基因的CDS序列,其长度为525 bp,编码174个氨基酸,含有高度保守的PEBP蛋白结构域。在NCBI数据库进行Blast比对显示:核桃JrFT基因与其他木本植物FT同源基因的相似性较高,可达到80%以上;JrFT蛋白与其他植物FT蛋白的相似性也很高。系统进化分析也同样说明JrFT基因属于PEBP家族基因。因此推测JrFT基因可能在核桃开花进程中具有一定的促进作用。 展开更多
关键词 核桃 FLOWERING LOCUS T(FT)基因 克隆 功能分析 表达载体构建
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马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建
2
作者 卢昊 杨奕琦 +2 位作者 秦玉芝 熊兴耀 周倩 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期3253-3258,共6页
WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。... WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。 展开更多
关键词 WRKY转录因子 基因克隆 表达载体构建 序列分析
马铃薯DREB1转录因子的克隆和植物表达载体构建
3
作者 王芳 李伟 王舰 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期3549-3555,共7页
WRKY是DREB/CBF转录因子在植物非生物胁迫响应中起重要的调节作用、激活下游功能基因表达的一类反式作用因子,能增强植物的逆境适应性。本研究以10%的PEG6000胁迫下青薯9号茎段的cDNA为模板,根据马铃薯StDREB1 CDS序列设计特异引物,采用... WRKY是DREB/CBF转录因子在植物非生物胁迫响应中起重要的调节作用、激活下游功能基因表达的一类反式作用因子,能增强植物的逆境适应性。本研究以10%的PEG6000胁迫下青薯9号茎段的cDNA为模板,根据马铃薯StDREB1 CDS序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆了DREB1转录因子,并进行植物表达载体构建。结果表明,DREB1转录因子全长约783 bp,编码框为657 bp,编码218个氨基酸,蛋白质大小为27.6 kD,理论等电点为4.68。利用SWISS-MODEL在线工具和ProtScal对DREB蛋白二级结构和三级结构进行预测及分析,结果表明,DREB1蛋白二级可能为mixed型,平均疏水性为-0.868,是亲水性蛋白,属于非跨膜蛋白、非分泌型蛋白。以2gcc.1.A为模板进行DREB1转录因子的三级结构预测,其AP2结构域非常保守。经NCBI中氨基酸同源序列分析表明,DREB转录因子的核苷酸序列与番茄(Solanum pennellii)的氨基酸序列同源性最高达到88%。通过SacⅠ和XbaⅠ酶切,将StDREB1连接在pBI221-GFP载体上,构建了CaMV35S启动子驱动的DREB1转录因子的植物表达载体StpBI-GFP-DREB1。DREB1转录因子的克隆,为下一步从分子水平上验证其抗旱的生物学功能及提示马铃薯非生物胁迫抗逆机制提供科学依据,为提高马铃薯抗旱分子机制提供新材料。 展开更多
关键词 DREB转录因子 基因克隆 表达载体构建 序列分析
人源CBX7全长及部分片段的表达纯化及单体结构研究 预览
4
作者 吕缜一 陆昌瑞 《生物化工》 2018年第1期1-4,共4页
本实验通过构建人源色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7,CBX7)全长及部分片段的大肠杆菌pp SUMO表达载体,经过Ni柱亲和纯化、离子交换纯化以及分子筛纯化等方法,获得较纯的CBX7(Full-Length)蛋白及达到蛋白质结晶条件的C... 本实验通过构建人源色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7,CBX7)全长及部分片段的大肠杆菌pp SUMO表达载体,经过Ni柱亲和纯化、离子交换纯化以及分子筛纯化等方法,获得较纯的CBX7(Full-Length)蛋白及达到蛋白质结晶条件的CBX7(13-65aa)蛋白。证实了人源CBX7中间区域存在大量疏水基团,该区域对CBX7蛋白的稳定性有一定影响。人源CBX7蛋白质的纯化及疏水区域的发现为后续相关结构及功能的研究提供了途径。 展开更多
关键词 CBX7蛋白 融合蛋白的构建 蛋白质表达 蛋白质纯化 ppSUMO表达载体
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玉米细胞分裂素Zmrr3的克隆及RNAi载体的构建 预览
5
作者 齐璐璐 马庆 《农业灾害研究》 2018年第3期3-5,共3页
应用聚合酶链式反应技术从鲁原92自交系玉米基因组中扩增了Zmrr3基因的第5外显子特异性片段,并以测序过的目的片段构建了RNAi的载体p CAMBIA303+RNAi+2F,该载体还有潮霉素、卡那霉素、GUS等筛选基因。可以用于细胞分裂素调控叶序变化... 应用聚合酶链式反应技术从鲁原92自交系玉米基因组中扩增了Zmrr3基因的第5外显子特异性片段,并以测序过的目的片段构建了RNAi的载体p CAMBIA303+RNAi+2F,该载体还有潮霉素、卡那霉素、GUS等筛选基因。可以用于细胞分裂素调控叶序变化的分子机制研究。 展开更多
关键词 细胞分裂素 小干涉RNA 表达载体的构建 玉米
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马铃薯R2R3-MYB转录因子的克隆及植物表达载体的构建
6
作者 杨奕琦 徐佳妮 +2 位作者 秦玉芝 熊兴耀 周倩 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2018年第18期5947-5952,共6页
MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003D... MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243的表达量显著上调。为了探讨R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243在马铃薯晚疫病抗病过程中发挥的作用。本研究通过PCR扩增了加湘1号中的该基因,并通过XcmⅠ酶切、连接将其装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-JX-R2R3,并转化到农杆菌GV3101中。该研究为R2R3-MYB转录因子的基因转化及后续的功能分析提供了理论指导。 展开更多
关键词 R2R3-MYB转录因子 基因克隆 表达载体构建
真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a的构建及功能验证 预览
7
作者 李栋 张康 +2 位作者 马晓芸 袁维秀 刘晓燕 《中国现代医学杂志》 北大核心 2017年第11期8-13,共6页
目的 构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(c DNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒p EGFPN1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况。方法 设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pc DNA3.1-ASIC2a... 目的 构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(c DNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒p EGFPN1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况。方法 设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pc DNA3.1-ASIC2a为模板扩增出含有限制性内切酶(XhoⅠ与Eco RⅠ)酶切位点的ASIC2a基因片段与载体p EGFP-N1酶切后连接形成重组质粒p EGFP-N1-ASIC2a,并瞬时转染至HEK293细胞中,利用细胞膜片钳方法观察其表达电流的情况。为进一步明确其亚细胞定位,将质粒EGFPN1-ASIC2a、p Ds Red-Monomer-Mem和p Ds Red2-ER共同转染至HEK293细胞中。结果 PCR扩增得到正确的ASIC2a基因片段,酶切鉴定和测序证实获得重组质粒p EGFP-N1-ASIC2a,并将其瞬转至HEK293细胞后,成功记录到ASIC2a同聚体电流。然后利用共转染的方法观察到,p EGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293细胞内质网表达,细胞膜表达较少。结论 重组绿色荧光蛋白真核表达载体p EGFP-N1-ASIC2a构建成功,且在HEK293细胞中主要表达于内质网,为下一步研究ASIC2a的功能,特别是为ASIC2a在缺血性神经元损伤中的作用及其机制的研究奠定基础。 展开更多
关键词 ASIC2a 载体构建 真核表达载体 绿色荧光蛋白
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长穗偃麦草EeHKT1;4基因的克隆与植物表达载体构建 预览 被引量:1
8
作者 张琳 郭强 +3 位作者 李杉杉 毛培春 田小霞 孟林 《草原与草坪》 CAS CSCD 2017年第4期1-7,共7页
采用RT-PCR方法从长穗偃麦草(Elytrigia elongata)中克隆得到高亲和K+转运蛋白基因,命名为EeHKT1;4,全长cDNA序列为1 977bp,开放阅读框1 722bp,编码573个氨基酸,与一粒小麦(Triticum monococcum)TmHKT1;4-A2的氨基酸同源性为94%。... 采用RT-PCR方法从长穗偃麦草(Elytrigia elongata)中克隆得到高亲和K+转运蛋白基因,命名为EeHKT1;4,全长cDNA序列为1 977bp,开放阅读框1 722bp,编码573个氨基酸,与一粒小麦(Triticum monococcum)TmHKT1;4-A2的氨基酸同源性为94%。系统进化树分析结果显示,EeHKT1;4与单子叶植物HKT1;4亲缘关系较近。利用In-Fusion技术,成功构建了pBI121-35SEeHKT1;4-Nos植物表达载体,为长穗偃麦草EeHKT1;4的耐盐功能鉴定奠定基础。 展开更多
关键词 长穗偃麦草 高亲和K+转运蛋白(HKT) In-Fusion技术 载体构建
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[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的转化与筛选 预览
9
作者 邢小龙 常纪苹 +2 位作者 付忠军 胡德升 胡彦民 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期1-4,共4页
为获得转基因抗虫玉米,将[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因导入玉米,并进行鉴定和筛选。在[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的两端分别添加Nco I和Bam H I酶切位点,并进行人工合成。将EβF合成酶基因与植物表达载体p FGC5941连接,经... 为获得转基因抗虫玉米,将[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因导入玉米,并进行鉴定和筛选。在[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的两端分别添加Nco I和Bam H I酶切位点,并进行人工合成。将EβF合成酶基因与植物表达载体p FGC5941连接,经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体p FGC5941-EβF构建成功;载体p FGC5941-EβF转化农杆菌EHA105后用玉米芽尖侵染法将EβF合成酶基因导入玉米自交系郑58中,对转化植株进行除草剂抗性筛选以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鉴定后,共得到18株转基因阳性植株。 展开更多
关键词 [反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因 玉米 表达载体构建 转基因植株
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金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建 被引量:1
10
作者 周兴文 康梅生 +1 位作者 冯晓娟 孙迎坤 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2017年第7期2556-2562,共7页
利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻... 利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。 展开更多
关键词 金花茶 番茄红素ε-环化酶 克隆 表达载体构建
白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达 预览 被引量:2
11
作者 亓倩 于淑惠 +4 位作者 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2016年第2期191-195,共5页
[目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^TMHT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^TM,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]免疫... [目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^TMHT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^TM,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达。[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 白蜡虫 蜡酯合酶 载体构建 Bac-to-Bac表达系统 Sf9细胞系
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枯草芽孢杆菌QM11漆酶基因克隆表达及序列分析 预览
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作者 由庆 徐伟 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期225-228,共4页
为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的漆酶(cotA)基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至... 为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的漆酶(cotA)基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因(Gen Bank:GQ184294.1)碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 漆酶 基因克隆 序列分析 表达载体构建 诱导表达
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麻竹DlSCL6基因amiRNA前体合成及表达载体构建 预览
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作者 陈东亮 孙化雨 +2 位作者 李利超 赵韩生 高志民 《世界竹藤通讯》 2016年第2期1-5,共5页
Web MicroRNA Designer(WMD3)是一个专门应用于植物人工miRNA设计和前体序列设计的专业网站,其中利用重叠PCR法合成amiRNA前体序列,涉及多个PCR和纯化回收过程,步骤繁琐,周期较长。本研究利用WMD3设计了麻竹转录因子DlSCL6基因的人工m... Web MicroRNA Designer(WMD3)是一个专门应用于植物人工miRNA设计和前体序列设计的专业网站,其中利用重叠PCR法合成amiRNA前体序列,涉及多个PCR和纯化回收过程,步骤繁琐,周期较长。本研究利用WMD3设计了麻竹转录因子DlSCL6基因的人工miRNA序列和其前体序列,采用改进的重叠PCR方法,快速克隆获得了该前体序列,并以改造的pCMABIA1301载体为框架,构建了该前体的植物表达载体,为进一步研究利用amiRNA调控SCL6基因的表达奠定了基础。 展开更多
关键词 麻竹 人工miRNA 重叠PCR 表达载体构建
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Tae-miR9677小串联模拟靶标(STTM)表达载体构建及小麦的遗传转化研究 预览
14
作者 李赵杰 简超 +1 位作者 刘香利 赵惠贤 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期404-408,共5页
小串联模拟靶标(Short tandem target mimic,STTM)技术是一种新开发的miRNA功能研究方法。Tae-miR9677作为一种新发现的在小麦穗部特异性高表达的miRNA,其功能至今未知。为了进一步探索Tae-miR9677的功能,构建了Ubiqutin(UBI)启动... 小串联模拟靶标(Short tandem target mimic,STTM)技术是一种新开发的miRNA功能研究方法。Tae-miR9677作为一种新发现的在小麦穗部特异性高表达的miRNA,其功能至今未知。为了进一步探索Tae-miR9677的功能,构建了Ubiqutin(UBI)启动子启动的Tae-miR9677 STTM过表达载体,并通过基因枪介导法对小麦品种绵阳19幼胚愈伤组织进行转化。结果表明,3 683个愈伤组织经过PPT(Phosphinothricin)筛选,最终分化获得42株再生植株;利用特异性引物进行PCR检测,鉴定出8株T0代阳性植株。 展开更多
关键词 Tae-miR9677 小串联模拟靶标(STTM) 小麦 载体构建 转基因
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PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化 预览 被引量:2
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作者 陶瑶 饶文平 +6 位作者 吴凌敏 谢丽娟 聂亚平 钟思荣 周玮 王建革 刘齐元 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1506-1514,共9页
为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒pUC57-PchsA中扩增了花特异性启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBll21中的组成型启动子CaMV35S,然后将orf25基因插入到PchsA启动子下游,构建由PchsA启动子... 为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒pUC57-PchsA中扩增了花特异性启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBll21中的组成型启动子CaMV35S,然后将orf25基因插入到PchsA启动子下游,构建由PchsA启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体pBll21-PchsA-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 烟草 orf25基因 表达载体构建 遗传转化
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三价砷甲基转移酶基因在UROtsa细胞系的转导及表达研究 被引量:2
16
作者 葛怡琛 曾丽海 +3 位作者 殷霄 陆丰荣 黄金城 任雪峰 《中国职业医学》 CAS 北大核心 2015年第4期385-391,共7页
目的构建人源三价砷甲基转移酶(AS3MT)的基因逆转录病毒表达载体,转导UROtsa细胞,建立稳定表达的细胞系。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从人源HEK293细胞基因库中扩增出AS3MT基因,将AS3MT基因克隆到逆转录病毒表达载体pRet... 目的构建人源三价砷甲基转移酶(AS3MT)的基因逆转录病毒表达载体,转导UROtsa细胞,建立稳定表达的细胞系。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从人源HEK293细胞基因库中扩增出AS3MT基因,将AS3MT基因克隆到逆转录病毒表达载体pRetro X-IRES-Zs Green1中,经病毒包装后,转导UROtsa细胞,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用流式细胞仪筛选阳性克隆,半定量RT-PCR法检测AS3MT mRNA表达水平,免疫印迹法检测AS3MT蛋白表达水平。结果经RT-PCR扩增AS3MT基因、限制性双酶切及基因测序鉴定,证实AS3MT基因正确插入逆转录病毒表达载体。以该载体转染病毒包装细胞Retro Pack PT67后获得的病毒液滴度〉106cfu/m L。将病毒转导UROtsa细胞,转导效率达50.00%。经3次流式细胞分选仪筛选,获得成功转染并稳定表达GFP的URO-Retro X-AS3MT细胞株;半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果均表明所转导的AS3MT基因在UROtsa细胞中成功表达。结论成功构建能高水平稳定表达AS3MT基因的UROtsa细胞系,为研究AS3MT在砷的代谢、毒性和致癌性中的作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 砷甲基转移酶 载体构建 逆转录病毒表达载体 病毒转导 HEK293细胞 UROtsa细胞
重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定 预览 被引量:1
17
作者 田宇 杜娟 李尚伟 《山地农业生物学报》 2015年第3期48-54,共7页
干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I... 干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1*。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。 展开更多
关键词 RNA干扰 稻纵卷叶螟 海藻糖酶基因 表达载体构建
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大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化 预览
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作者 李丹 吴楠 +6 位作者 郑成忠 张琳 马建 曲静 张卓 付永平 王丕武 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2015年第8期71-78,共8页
[目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pC... [目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆“吉农28”中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100 bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1 mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】 成功构建了过表达载体pCAMBIA3301CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。 展开更多
关键词 大豆查尔酮还原酶1基因 克隆 表达载体构建 农杆菌介导
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高山离子芥磷脂酶 Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建 预览 被引量:3
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作者 杨宁 强治全 +2 位作者 陈霞 丁芳霞 王程亮 《西北师范大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2014年第3期94-98,共5页
磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA ,反转录合成cDNA , PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥... 磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA ,反转录合成cDNA , PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1600 bp , blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥 PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化 PCR产物,克隆至pTG19-T 载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至 pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础. 展开更多
关键词 高山离子芥 PLDα基因 编码区序列 表达载体构建
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抗虫基因 Cry1C*重组表达载体的构建与鉴定 预览 被引量:1
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作者 张丽萍 查仁明 李尚伟 《贵州农业科学》 CAS 北大核心 2014年第6期6-9,共4页
为水稻害虫生物防治提供菌株,从GenBank中选定Cry 1C 类抗虫基因,将其优化改造后命名为 Cry 1C *,Cry 1C *经 BamH I 和 Spe I 双酶切后与植物表达载体 pTCK303连接,构建 pTCK303-Cry 1C *重组表达载体,将其转化到农杆菌 LBA440... 为水稻害虫生物防治提供菌株,从GenBank中选定Cry 1C 类抗虫基因,将其优化改造后命名为 Cry 1C *,Cry 1C *经 BamH I 和 Spe I 双酶切后与植物表达载体 pTCK303连接,构建 pTCK303-Cry 1C *重组表达载体,将其转化到农杆菌 LBA4404中,同时进行 PCR、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR、双酶切及测序产物与预期扩增片段(2342 bp)相符,重组表达载体 pTCK303-Cry 1C *构建成功;农杆菌LBA4404中含有重组质粒,成功构建了 Cry 1C *农杆菌基因工程菌株。 展开更多
关键词 水稻 抗虫基因 Cry1C* 表达载体构建
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