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γ-氨基丁酸Rho2受体在神经母细胞瘤细胞中的稳定表达及其在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用 预览
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作者 李敏 楚人杰 +2 位作者 张姣 韩思乐 李超堃 《新乡医学院学报》 CAS 2019年第1期13-18,共6页
目的构建人γ-氨基丁酸(GABA)Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用。方法采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至pIRES2-eGFP质粒,构建重组质... 目的构建人γ-氨基丁酸(GABA)Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用。方法采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至pIRES2-eGFP质粒,构建重组质粒pIRES2-eGFP-Rho2,利用X-fect试剂盒将其转染至SH-SY5Y细胞中,使用遗传霉素进行筛选,建立稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株。使用流式细胞术检测稳定转染过表达pIRES2-eGFP-Rho2的细胞,利用免疫荧光法鉴定稳定转染的SH-SY5Y细胞中pIRES2-eGFP-Rho2的表达。将野生型SH-SY5Y细胞分为A1、B1、C1组,稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞分为A2、B2、C2组,每组设3个平行孔,其中A1、A2组细胞使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)孵育,B1、B2组细胞使用含有谷氨酸盐的DMEM孵育,C1、C2组细胞使用含有谷氨酸盐和GABA的DMEM孵育,将各组细胞置于细胞培养箱中培养24h,应用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组细胞的存活率。结果重组真核表达载体构建正确,获得了稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的细胞株。A1、B1、C1组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=5.542,P<0.05);其中B1、C1组细胞存活率显著低于A1组(P<0.05),C1组细胞存活率显著高于B1组(P<0.05)。A2、B2、C2组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=6.588,P<0.05);其中B2、C2组细胞存活率显著低于A2组(P<0.05),C2组细胞存活率显著高于B2组(P<0.01)。A2组细胞存活率与A1组比较差异无统计学意义(P>0.05),B2组细胞存活率显著低于B1组(P<0.05),C2组细胞存活率显著低于C1组(P<0.05)。结论成功构建pIRES2-eGFP-Rho2真核表达载体,建立了稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株,为体外研究GABRR2的功能提供了实验基础,并证明使用GABA可缓解谷氨酸盐对细胞的损伤,为缺血性脑损伤的分子生物学治疗提供了靶点。 展开更多
关键词 真核表达载体 Γ-氨基丁酸 神经母细胞瘤 SH-SY5Y细胞 细胞克隆 基因表达
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松江鲈白介素15(TfIL-15)的结构特征与重组表达 预览
2
作者 刘莹莹 于珊珊 +2 位作者 柴迎梅 林啸鹏 祝茜 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第4期95-103,共9页
为研究白介素15(Interleukin-15, IL-15)在松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)先天免疫中的功能,本研究利用RACE技术克隆得到松江鲈IL-15基因(命名为TfIL-15)的全长cDNA序列,其长度为1140bp,包括5'-非编码区(5'-UTR) 165bp... 为研究白介素15(Interleukin-15, IL-15)在松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)先天免疫中的功能,本研究利用RACE技术克隆得到松江鲈IL-15基因(命名为TfIL-15)的全长cDNA序列,其长度为1140bp,包括5'-非编码区(5'-UTR) 165bp、开放阅读框(ORF) 522bp和3'UTR 453bp。在5'UTR区域,存在4个读码框外的AUG翻译起始位点。基因ORF编码173个氨基酸(aa),其中,前59aa为信号肽序列。成熟肽全长为114aa,预测分子量为12.975kDa,理论等电点为5.15。同源比对发现,鱼类IL-15变异程度较高,TfIL-15与其他鱼类IL-15同源性在23%~61%之间。多序列比对和三维结构构建结果显示,TfIL-15具有典型4个α螺旋二级结构,形成二硫键的4个半胱氨酸高度保守。qRT-PCR分析表明,TfIL-15广泛表达于松江鲈各组织中。腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)后,TfIL-15 mRNA在血液、皮肤、肝脏和脾脏中均上调表达。在皮肤和血液中,刺激后2h表达量迅速上调至最高峰,分别为对照组的74倍和41倍。脾脏和肝脏在刺激后12h分别达到对照组的3倍和18倍。肝脏中,刺激后96h,表达量再次上调至对照组的86倍。上述结果表明,TfIL-15可能参与了松江鲈抵抗外界刺激的先天免疫过程。另外,通过构建TfIL-15成熟肽的原核表达载体,成功获得重组蛋白,为进一步研究TfIL-15蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 松江鲈 白介素15(IL-15) 克隆 基因表达 重组蛋白表达
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葡萄转录因子VpSBP12的克隆及功能分析
3
作者 侯鸿敏 王亚萍 林延翔 《北方园艺》 CAS 北大核心 2019年第3期35-43,共9页
以华东葡萄‘白河-35-1’为试材,依据葡萄全基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr),利用同源序列比对结果设计引物,克隆获得VpSBP12基因的DNA和cDNA序列,并分析其序列特征和表达特性,以期阐明其在葡萄抗盐胁迫中的作用,为葡萄抗逆... 以华东葡萄‘白河-35-1’为试材,依据葡萄全基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr),利用同源序列比对结果设计引物,克隆获得VpSBP12基因的DNA和cDNA序列,并分析其序列特征和表达特性,以期阐明其在葡萄抗盐胁迫中的作用,为葡萄抗逆育种提供参考依据。结果表明:VpSBP12基因DNA全长2 907bp,其中含有3个外显子和2个内含子;该基因的完整开放阅读框序列全长1 137bp,编码379个氨基酸,其中包括一个含有双向核定位信号的高度保守SBP结构域。经过亚细胞定位和转录活性分析表明,该基因可以定位到核里,且具有转录激活活性。构建过量表达载体将VpSBP12转化拟南芥后发现,转基因株系在盐胁迫培养基上的萌发率及根长显著高于野生对照。表明VpSBP12基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫的能力。 展开更多
关键词 SBP基因 盐胁迫 基因克隆 过量表达
三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征 预览 被引量:1
4
作者 赵姣姣 陶震 +3 位作者 周素明 金珊 王国良 周岐存 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期298-304,共7页
为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用,研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor)cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋... 为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用,研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor)cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示,Pt-Rel cDNA长3254 bp,ORF长2949 bp,编码983个氨基酸,Pt-Dor cDNA长2348 bp,ORF长1911 bp,编码637个氨基酸;蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD(Rel homology domain)及IPT(Immunoglobulin-like fold,Plexins,TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性;在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支,而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达,且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明,不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似,假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达,而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 NF-ΚB 基因克隆 表达分析
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发菜1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)的基因克隆及其对干旱胁迫的响应
5
作者 李晓旭 丁苗苗 +6 位作者 王猛 严奉坤 张筝 梁文裕 徐婷婷 王俊 王玲霞 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2019年第19期6305-6313,共9页
由glgB基因编码的1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)是催化调控α(1-6)糖苷键分支合成的关键酶。本研究从发菜中克隆获得1,4-α-葡聚糖分支酶glgB基因全长2 292 bp(GeenBank登录号:KX679395),编码763个氨基酸。原核表达得到88.6 kD的glgB基因外... 由glgB基因编码的1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)是催化调控α(1-6)糖苷键分支合成的关键酶。本研究从发菜中克隆获得1,4-α-葡聚糖分支酶glgB基因全长2 292 bp(GeenBank登录号:KX679395),编码763个氨基酸。原核表达得到88.6 kD的glgB基因外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析表明外源蛋白为GBE。发菜glgB与点形念珠藻的glgB序列相似性为94%,氨基酸序列相似性为97%;GBE在第747位的甘氨酸疏水性最强,第168位的组氨酸亲水性最强;Thr有15个磷酸化位点,Tyr有12个磷酸化位点、Ser有27个磷酸化位点;GBE二级结构及三级结构由α螺旋、β折叠、随机卷曲和β转角构成。发菜glgB在干旱胁迫下转录水平的表达量逐渐增加,GBE含量增加,糖原合成酶活性和糖原含量均先增加后降低。研究结果为认识glgB基因信息和发菜响应干旱胁迫的糖原代谢和调控机制提供了依据。 展开更多
关键词 发菜(Nostoc flagelliforme) 1 4-α-葡聚糖分支酶 克隆 干旱胁迫 差异表达
瘤背石磺钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)基因的克隆及组织表达 预览
6
作者 梁威 杨铁柱 +3 位作者 沈和定 许国绿 顾冰宁 薛宝宝 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2336-2346,共11页
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中CaMKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述CaMKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实... 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中CaMKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述CaMKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆得到CaMKⅣ基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因的cDNA全长1603bp,开放阅读框为1032bp,5′非编码区315bp,3′非编码区256bp,共编码343个氨基酸;预测该基因编码的多肽链原子数量是5490,分子量约为3.87ku,理论等电点6.12,分子式为C1741H2768N452O514S15,N端信号肽由1~29个氨基酸组成。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因与加州海兔、光滑双脐螺CaMKⅣ基因的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,CaMKⅣ基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经节组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测,该基因在瘤背石磺的神经调节中发挥重要作用,或为生物机体感知外界环境变量因素的分子基础。本实验为今后进一步了解瘤背石磺神经结构生理功能的调节以及与CaMKⅣ基因功能研究奠定理论支撑,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供参考。 展开更多
关键词 瘤背石磺 CaMKⅣ 基因克隆 实时荧光定量PCR 组织表达分析
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山羊CXCR1基因的克隆及组织表达谱研究
7
作者 徐涛 王利 魏勇 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第19期19-24,29,177共8页
为了探究山羊C-X-C趋化因子受体1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)基因的特点,试验以金堂黑山羊脾脏cDNA为模板克隆了CXCR1基因,借助生物信息学软件及在线软件分析序列,并采用实时荧光定量PCR方法检测CXCR1基因在金堂黑山羊脾... 为了探究山羊C-X-C趋化因子受体1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)基因的特点,试验以金堂黑山羊脾脏cDNA为模板克隆了CXCR1基因,借助生物信息学软件及在线软件分析序列,并采用实时荧光定量PCR方法检测CXCR1基因在金堂黑山羊脾脏、肺脏、肌肉、心脏和肠的5个组织中的相对表达量。结果表明:克隆得到的CXCR1基因序列全长为1 140 bp,完整CDS编码区长1 107 bp,共编码368个氨基酸;所得氨基酸序列与牛进行比对,两者同源性为96.8%;编码蛋白为带正电荷、具有疏水性的稳定蛋白;有7个跨膜结构和32个磷酸化位点,无信号肽;二级结构中α-螺旋比例最高,为54.35%;获得的三级结构模型与人的CXCR1蛋白(PDB:2lnl.1.A)同源性最高,为81.49%;氨基酸比对结果与系统进化树结果相近,金堂黑山羊与牛的亲缘关系最近;CXCR1基因主要表达于肌肉和心脏。说明CXCR1基因可能在山羊肌肉发育相关的信号通路中发挥作用。 展开更多
关键词 CXCR1基因 PCR扩增 金堂黑山羊 克隆 生物信息学分析 组织表达
鱼类PPARs的克隆表达及其研究进展 预览
8
作者 张祺照 王伟平 《科技资讯》 2019年第2期242-244,共3页
该研究主要从鱼类PPARs的结构与分类、生物学功能、鱼类组织及胚胎发育过程中PPARs的克隆表达及影响进行综述,以期为科研工作者进一步探索鱼类PPARs的基因结构表达,以及在生物学功能产品开发上奠定相关的理论基础。
关键词 PPARs基因 克隆 表达 功能研究
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小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析 预览
9
作者 刘媛媛 郭启平 +2 位作者 党仁美 张珊 闻珊珊 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期886-895,共10页
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度... γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1101bp,编码366个氨基酸,而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明,3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50kDa,理论等电点分别为6.67、6.41和7.08,都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明,小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明,小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达,在叶片中表达量最高;ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ-TMT基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 小麦 Γ-生育酚甲基转移酶 基因克隆 表达分析
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番茄SlETR6基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析 预览 被引量:1
10
作者 苏丽艳 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期19-25,共7页
为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的... 为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的组织表达情况及对其在高盐、高温(40℃)、低温(4℃)、干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,SlETR6基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2 265 bp,编码754个氨基酸,蛋白质分子质量为85. 05 ku,等电点为7. 28,与马铃薯St ETR-like蛋白的同源性最高;启动子分析显示,SlETR6基因含有热胁迫、干旱胁迫、低氧胁迫、光响应、乙烯、水杨酸及赤霉素应答等相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,SlETR6在番茄不同组织中均有表达,且在花和转色期果实中有显著高表达。高盐胁迫6 h后,SlETR6基因呈现上调表达,12 h后达到峰值,而后回复正常表达水平;高温胁迫后,SlETR6基因表达量有明显的上升趋势;干旱胁迫早期SlETR6基因应答强烈,在胁迫处理1 h后表达量达到峰值。因此,推测SlETR6基因可能在番茄适应高盐、高温、干旱等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与番茄生长发育过程中的逆境调控。为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。 展开更多
关键词 番茄 SlETR6 基因克隆 非生物胁迫 表达分析
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花生MAPK13基因的克隆及表达分析研究 预览
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作者 梁丹 张朝昕 +8 位作者 王冕 吴正锋 陈娜 潘丽娟 王通 陈明娜 杨珍 禹山林 迟晓元 《花生学报》 北大核心 2019年第2期10-18,共9页
为了挖掘花生抗果腐病相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,从花生果腐病转录组文库中筛选出促丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)基因编码区序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMAPK 13基因°结果表明AhMAPK 13基因序列全长18... 为了挖掘花生抗果腐病相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,从花生果腐病转录组文库中筛选出促丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)基因编码区序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMAPK 13基因°结果表明AhMAPK 13基因序列全长1818 bp,含有/非编码区593 bp,5非编码区122 bp,开放阅读框全长1104 bp,编码1条含有368个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为42. 5kDa,含有MAPK家族典型的11个结构域,属于MAPK基因家族B组成员。亚细胞定位显示AhMAPK13定位于细胞质和细胞核中° RT-qPCR分析发现AhMAPK 13基因在茎中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMAPK 13基因受干旱、低温、NaCl(ABA诱导时表达量上升,说明该基因可能广泛参与植物非生物胁迫响应过程;AhMAPK 13基因受JA、GA、ET、SA诱导时表达量上调,说明该基因可能参与到这些激素介导的抗逆信号转导途径。本研究结果为花生抗果腐病育种研究提供了新的基因资源。 展开更多
关键词 花生 促丝裂原蛋白活化激酶基因13 基因克隆 表达分析 亚细胞定位
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尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析 预览
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作者 邹子鸿 郑琦 +5 位作者 黄瑜 汤菊芬 王蓓 鲁义善 简纪常 蔡佳 《广东海洋大学学报》 CAS 2019年第6期1-8,共8页
【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长... 【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2769 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。 展开更多
关键词 尼罗罗非鱼 淋巴毒素α基因 基因克隆 基因表达 非特异性细胞毒性细胞(NCC)
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三角帆蚌dPGAM基因的克隆与表达分析 预览
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作者 应晨怡 谢陈南 +5 位作者 张根芳 周淼 许海方 黄芸洁 陈旭旭 杨受保 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1913-1920,共8页
为探究贝类磷酸甘油酸变位酶(PGAM)基因的功能,以紫色和黄色家系三角帆蚌为试验材料,采用RACE-PCR法克隆得到三角帆蚌1个辅因子依赖型磷酸甘油酸变位酶基因(dPGAM)的cDNA序列,命名为HcdPGAM,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表... 为探究贝类磷酸甘油酸变位酶(PGAM)基因的功能,以紫色和黄色家系三角帆蚌为试验材料,采用RACE-PCR法克隆得到三角帆蚌1个辅因子依赖型磷酸甘油酸变位酶基因(dPGAM)的cDNA序列,命名为HcdPGAM,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,HcdPGAM基因包含1个750 bp的开放阅读框,编码1个含250个氨基酸的假定蛋白,并含有1个保守的组氨酸磷酸酶结构域;HcdPGAM与其他动物PGAM的氨基酸序列均具有较高的相似性(58.8%~82.0%)。实时荧光定量PCR分析显示,HcdPGAM在所检测的紫色蚌和黄色蚌的鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺组织和血淋巴细胞6种组织中均有表达,其中在闭壳肌中的表达量相对较高,且紫色系蚌闭壳肌中的表达水平显著高于黄色系,表明该基因与三角帆蚌的能量代谢与生长发育有关,是贝类分子辅助育种的一种潜在的标记;嗜水气单胞菌诱导可极显著上调HcdPGAM基因的表达水平(24 h和48 h),表明HcdPGAM基因在贝类抗细菌感染的免疫反应相关能量代谢过程中也发挥着重要作用。本研究结果为明确贝类PGAM的功能和筛选三角帆蚌不同颜色家系间的特异性分子标记提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 三角帆蚌 磷酸甘油酸变位酶 克隆 表达
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魁蚶(Scapharca broughtonii)血红蛋白Ⅰ基因克隆及表达特征 预览
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作者 赵庆 吴彪 +4 位作者 刘志鸿 孙秀俊 周丽青 杨爱国 张高伟 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第1期84-91,共8页
魁蚶(Scapharca broughtonii)的血淋巴中因含有血红蛋白而不同于其他多数双壳贝类。为明确魁蚶血红蛋白基因的结构特征、组织发生分布、免疫活性等特点,本研究以魁蚶转录组数据库中的部分序列为基础,通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplica... 魁蚶(Scapharca broughtonii)的血淋巴中因含有血红蛋白而不同于其他多数双壳贝类。为明确魁蚶血红蛋白基因的结构特征、组织发生分布、免疫活性等特点,本研究以魁蚶转录组数据库中的部分序列为基础,通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplication of cDNA ends,RACE)技术,克隆获得了一种魁蚶血红蛋白基因cDNA全长序列(命名为SbHbⅠ),并研究了不同条件下的mRNA表达。序列和结构分析显示,SbHbⅠ基因cDNA全长为867bp,其中包括长度为483bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码160个氨基酸,预测蛋白分子量为17.5kDa,理论等电点为9.68;氨基酸序列具有多个血红素结合位点,序列与所选其他物种的相似度范围为57%~93%,与蚶科相似度较高。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,在魁蚶成体的斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、血淋巴、肝胰腺及受精卵至发育23d的幼虫体内,均能检测到SbHbⅠ基因;该基因在成体魁蚶血淋巴中表达量最高,与其他5个组织中的表达量差异显著(P<0.05);受精卵至23d幼虫期的表达,基本呈现为先下降后上升的趋势,且在12d时急剧上升(P<0.05);在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激和低氧胁迫后,血淋巴中SbHbⅠ基因的表达均呈先上升后下降的趋势,表达量最高值均出现在16h。本研究丰富了贝类血红蛋白相关研究资料。 展开更多
关键词 魁蚶 血红蛋白 基因克隆 表达特征
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A型流感病毒H7N9株PB1和PB2基因的克隆和真核表达 预览
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作者 薛宇佳 杜江龙 +6 位作者 王晨 万雪梅 杨学财 王峰 贾骁晔 冉乾东 曹欣 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第6期1448-1451,共4页
【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其... 【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-Flag-PB1/PB2真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定PB1/PB2蛋白的表达。【结果】成功克隆了PB1和PB2全长基因,构建了A型H7N9流感病毒PB1和PB2蛋白真核表达载体pRK-Flag-PB1/PB2,并在293T细胞中转染表达,Western blot确定了PB1/PB2蛋白的成功表达。【结论】该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达PB1和PB2蛋白,为后期开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型流感病毒 PB1基因 PB2基因 克隆 真核表达
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橡胶树炭疽菌蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及表达
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作者 赵晓宇 王记圆 +4 位作者 廖小淼 林春花 缪卫国 刘文波 郑服丛 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期3622-3628,共7页
为了解蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)的生长发育和致病性中的功能。本研究利用同源克隆法设计引物,采用PCR和RT-PCR的方法获得炭疽菌(C. siamense)的PKA两个催化亚基PKA-C1与PKA-C2,并基于... 为了解蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)的生长发育和致病性中的功能。本研究利用同源克隆法设计引物,采用PCR和RT-PCR的方法获得炭疽菌(C. siamense)的PKA两个催化亚基PKA-C1与PKA-C2,并基于RSF-Duet载体构建两基因原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达,利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明:催化亚基PKA-C1编码498个氨基酸,包含3个内含子;PKA-C2基因编码381个氨基酸,包含2个内含子;两基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和S_TK_X;聚类分析显示两基因与胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)依赖cAMP蛋白激酶催化亚基序列有高度同源性。SDS-PAGE检测表明目的基因在大肠杆菌中可成功表达,大小符合预期。本研究结果为进一步分析炭疽菌的PKA催化亚基基因功能提供了帮助。 展开更多
关键词 橡胶树 炭疽菌 蛋白激酶A 克隆 原核表达
吉陶单极虫可分泌蛋白酶基因的克隆与生物信息学分析 预览
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作者 张凤丽 杨雅麟 +6 位作者 夏锐 高辰辰 李栋 冉超 张震 张洪玲 周志刚 《生物技术进展》 2019年第4期375-383,共9页
粘孢子虫为鱼类主要的寄生虫,给渔业的生产造成严重的危害。近年来,粘孢子虫的蛋白酶以及抑制剂在入侵和感染宿主中的作用被越来越多的报道。在前期粘孢子虫吉陶单极虫转录组数据的基础上,成功克隆了3个可分泌蛋白酶基因:TK Papain-1、T... 粘孢子虫为鱼类主要的寄生虫,给渔业的生产造成严重的危害。近年来,粘孢子虫的蛋白酶以及抑制剂在入侵和感染宿主中的作用被越来越多的报道。在前期粘孢子虫吉陶单极虫转录组数据的基础上,成功克隆了3个可分泌蛋白酶基因:TK Papain-1、TK Papain-2和TK Pepsin,并且通过异源表达得到了与预测蛋白大小相符的蛋白。通过生物信息学的分析发现,TK Papain-1、TK Papain-2属于Papain (C1A)家族成员,均编码半胱氨酸蛋白酶,分别编码150个和322个氨基酸,蛋白大小为17.06 kDa和36.7 kDa;TK Pepsin编码天冬氨酸蛋白酶,编码491个氨基酸,编码蛋白理论大小为55.41 kDa。3个可分泌蛋白酶均有信号肽序列,为可分泌蛋白;通过进化树的构建,发现与海葵、水螅、纤毛虫同源序列亲缘关系较近。通过多序列比对,找到了可分泌蛋白酶的保守位点。研究结果为进一步深入粘孢子虫蛋白酶性质及感染机制方面的研究提供了基础。 展开更多
关键词 粘孢子虫 蛋白酶 生物信息学分析 克隆 表达
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Molecular characterization, expression and function analysis of eukaryotic translation initiation factor (eIF1A) in Mangifera indica 预览
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作者 LI Li-shu LUO Cong +4 位作者 AN Zhen-yu LIU Zhao-liang DONG Long YU Hai-xia HE Xin-hua 《农业科学学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第11期2505-2513,共9页
Eukaryotic translation initiation factor 1A(eIF1A)functions as an important regulatory factor of protein synthesis and plays a crucial role in responses to abiotic stresses in plants.However,little is known about the ... Eukaryotic translation initiation factor 1A(eIF1A)functions as an important regulatory factor of protein synthesis and plays a crucial role in responses to abiotic stresses in plants.However,little is known about the eIF1A gene involved in fruit development and stress response of mango.In this study,the MieIF1A-b gene was isolated from Mangifera indica,and contains a 435-bp open reading frame,which encodes a putative protein of 144 amino acids(GenBank accession number:KP676599).The predicted MieIF1A-b protein had a molecular weight of 16.39 kDa with a pI of 4.6.Sequence homology analysis showed that MieIF1A-b shared high homology with Elaeis guineensis,Manihot esculenta,and Populus trichocarpa,with 96 and 95%identity,respectively.Quantitative reverse transcriptative PCR(qRT-PCR)analyses indicated that MieIF1A-b was expressed in all tested tissues,and had the highest expression level in fruit 80 d after flowering.The expression of MieIF1A-b was obviously regulated by NaCl and H2O2 treatments in leaves.Functional analysis indicated that the overexpression of MieIF1A-b in transgenic Arabidopsis thaliana enhanced the growth,phenotype and salinity tolerance compared with wild-type(WT)plants.The results indicated that MieIF1A-b may be correlated with the control of fruit development and salt adaptation,and it was a candidate gene for abiotic stress in mango. 展开更多
关键词 MANGIFERA INDICA MieIF1A-b GENE GENE CLONE EXPRESSION functional analysis
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家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化
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作者 彭建 刘巍巍 +3 位作者 吴兆颖 杨燕琴 尚小丽 吴建伟 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期182-185,共4页
目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克... 目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。 展开更多
关键词 家蝇 CEC4 克隆 原核表达
苎麻镉响应基因BnG6PDH1的克隆和表达分析 预览
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作者 朱守晶 史文娟 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期262-270,共9页
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖代谢途径的关键限速酶,为探讨G6PDH基因在苎麻耐镉机制中的作用,本研究在苎麻镉胁迫转录组的基础上,采用RACE方法从苎麻(BoehmerianiveaL.)品种中苎一号中克隆到BnG6PDH1基因(GenBank登录号为MG941... 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖代谢途径的关键限速酶,为探讨G6PDH基因在苎麻耐镉机制中的作用,本研究在苎麻镉胁迫转录组的基础上,采用RACE方法从苎麻(BoehmerianiveaL.)品种中苎一号中克隆到BnG6PDH1基因(GenBank登录号为MG941010)的全长cDNA序列,该基因开放读码框为1554bp,编码517个氨基酸,蛋白质分子量为59250,等电点为5.92。BnG6PDH1编码的氨基酸与川桑(XP_010111634.1)、枣(XP_015878928.1)、甜樱桃(XP_021825040.1)、苹果(XP_008362117.1)和梅(XP_008231184.1)的胞质型G6PDH蛋白的相似性较高,相似度分别为92%、91%、89%、88%和88%。组织表达特异性分析结果表明,BnG6PDH1在苎麻叶中的表达量最高,其次为茎,根部的表达量最低。镉胁迫诱导表达分析结果表明,BnG6PDH1的显著表达受镉的诱导,表达量随着镉质量浓度的增加而增加。以上结果表明,BnMYB1是一个镉应答基因,可能在植物对镉胁迫的适应中发挥重要作用。 展开更多
关键词 苎麻 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 镉响应基因BnG6PDH1 基因克隆 表达分析
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