期刊文献+
共找到1,360篇文章
< 1 2 68 >
每页显示 20 50 100
基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应 认领
1
作者 张首 王震 +5 位作者 蔺玉萍 戎倩倩 王丽贤 齐显尼 刘浩 王钦宏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1384-1400,共17页
【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA doublestrandbreak,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤... 【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA doublestrandbreak,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化。【方法】起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期。检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况。利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况。利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况。【结果】起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留。此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低。CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9。两种编辑均诱导酵母DNA损伤响应关键基因RNR3及HUG1转录水平显著上调,并且CRISPR/Cpf1介导的上调幅度大于CRISPR/Cas9,但两者均低于MMS的处理。【结论】本研究解析了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑在细胞水平和转录水平上对DNA损伤作用及修复响应,初步揭示了酿酒酵母应对不同类型的DSB损伤时响应程度的差异,为提高基因组编辑工具的编辑能力和评估基因编辑安全性提供了重要依据。 展开更多
关键词 酿酒酵母 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cpf1 甲基磺酸甲酯 细胞周期 DNA损伤响应
基于CRISPR/Cas9技术的MAVS和NFκB1基因敲除MDCK细胞系的构建及初步鉴定 认领
2
作者 田棣 刘祎 +4 位作者 陈海丽 杨春忆 王蔚 易志刚 张万菊 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2020年第2期197-201,共5页
目的构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling,MAVS)和核因子κB1(nuclear factor kappa B1,NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK),对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus,Flu)... 目的构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling,MAVS)和核因子κB1(nuclear factor kappa B1,NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK),对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus,Flu)的增殖特性进行初步鉴定。方法采用CRISPR/Cas9技术,将MDCK细胞的MAVS和NFκB1基因敲除,获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination,HA)滴度和TCID50滴度,与野生MDCK细胞进行比较。结果获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK-MAVS-和MDCK-NFκB1-,与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后,2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异,TCID50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍,其差异有统计学意义(P=0.0316)。结论本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK-MAVS-和MDCK-NFκB1-能够提高Flu的感染力,为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 犬肾细胞系 线粒体抗病毒信号 核因子 基因敲除
基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛 认领
3
作者 王楠 朱惠 +5 位作者 朱文娇 张昌润 沈也雷 董梅 宋怀东 乔洁 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第1期14-18,共5页
目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不... 目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 LHX9 斑马鱼 基因编辑
白念珠菌SUMO结合酶UBC9基因缺失株的构建及其在形态调控中的作用研究 认领
4
作者 单爱狄 冯金荣 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第7期800-804,共5页
目的构建白念珠菌UBC9基因缺失株,探索UBC9基因缺失对细胞形态转换和生物被膜形成的影响。方法采用瞬时CRISPR/Cas9基因敲除系统,分别于体外扩增Cas9基因、sgRNA以及修复DNA,通过醋酸锂法转化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD-His选择培养... 目的构建白念珠菌UBC9基因缺失株,探索UBC9基因缺失对细胞形态转换和生物被膜形成的影响。方法采用瞬时CRISPR/Cas9基因敲除系统,分别于体外扩增Cas9基因、sgRNA以及修复DNA,通过醋酸锂法转化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD-His选择培养基筛选转化子,通过菌落PCR验证基因型,构建UBC9双等位基因缺失株。分别检测UBC9缺失株在液体培养基中的细胞形态、固体YPD平板上的菌落形态和浸入生长情况以及生物被膜形成能力。结果PCR检测发现UBC9双等位基因缺失株中能扩出约2.8 kb的单一条带,UBC9基因缺失导致液体培养基中细胞伸长主要以菌丝态形式存在,固体培养基上菌落表面粗糙且深入到培养基内呈典型的浸入生长,并且生物被膜形成能力显著增高(A值为10.31,约为野生型的10.3倍)。结论利用CRISPR/Cas9系统快速构建了白念珠菌UBC9纯合子缺失株,且证明UBC9参与细胞的形态调控和生物被膜形成。 展开更多
关键词 白念珠菌 CRISPR/Cas9 生物被膜 UBC9基因
利用CRISPR/Cas9技术敲除XPO1基因对胰腺癌细胞株生物学功能的影响 认领
5
作者 黄娴娴 李苑华 +2 位作者 黄凤婷 张世能 庄燕妍 《岭南现代临床外科》 2020年第3期280-284,290,共6页
目的利用CRISPR/Cas9技术构建XPO1基因敲除的胰腺癌细胞株MIA-Paca2,初步探讨XPO1敲除对细胞生物学功能的影响。方法构建sgRNA-XPO1质粒,包装成慢病毒感染MIA-Paca2细胞,用合适浓度的嘌呤霉素筛选获得XPO1敲除的稳转株,DNA测序及蛋白质... 目的利用CRISPR/Cas9技术构建XPO1基因敲除的胰腺癌细胞株MIA-Paca2,初步探讨XPO1敲除对细胞生物学功能的影响。方法构建sgRNA-XPO1质粒,包装成慢病毒感染MIA-Paca2细胞,用合适浓度的嘌呤霉素筛选获得XPO1敲除的稳转株,DNA测序及蛋白质印迹法检测XPO1敲除效率;流式细胞分析及CCK8实验分别检测细胞凋亡、细胞周期及其对吉西他滨的半数抑制浓度(IC_(50))。结果 DNA测序显示编码XPO1蛋白的基因序列发生移码突变,蛋白质印迹法、流式细胞技术及CCK8结果显示XPO1基因敲除后的MIA-Paca2细胞株XPO1蛋白表达量明显降低,细胞凋亡增多,G2/M期细胞比例增加,对吉西他滨IC50降低。结论利用CRISPR/Cas9成功构建XPO1基因敲除的MIA-Paca2细胞株,XPO1基因敲除可促进细胞凋亡,引起细胞周期G2/M期阻滞,增强吉西他滨化疗敏感性。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 XPO1 基因敲除 胰腺癌
在线阅读 下载PDF
花粉管通道和农杆菌介导的花生AhFatB基因编辑 认领
6
作者 潘雷雷 纪红昌 +8 位作者 黄建斌 淮东欣 雷永 隋炯明 唐艳艳 朱虹 姜德锋 王晶珊 乔利仙 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第4期64-70,共7页
为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术在花生中的应用,利用花粉管注射浸花法和农杆菌介导法转化花生,通过在侵染液中添加合适浓度的AS、MES以及MgCl2·6H2O促进了转化事件的发生,并通过注射液每日现用现配最大程度地保持农杆菌的活力,提... 为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术在花生中的应用,利用花粉管注射浸花法和农杆菌介导法转化花生,通过在侵染液中添加合适浓度的AS、MES以及MgCl2·6H2O促进了转化事件的发生,并通过注射液每日现用现配最大程度地保持农杆菌的活力,提高了转化效率。本试验首次将该转化法用于基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑,根据花生FatB基因序列设计编辑靶位点,成功构建CRISPR/Cas9基因编辑载体PX458-Cas9-FatB并成功转化农杆菌菌株GV3101;利用1 mL无菌注射器将当日离心配置的新鲜农杆菌侵染液注射到花生龙骨瓣中至花瓣浸透,每日8:00以前完成注射,连续注射15日,待注射花朵下针后用尼龙绳进行捆绑标记;待荚果成熟后,收获捆绑标记的花生荚果,正常晾晒干燥后剥取花生籽粒,提取籽粒基因组DNA,进行PCR扩增,筛选转化阳性籽粒。结果显示,在被检测的274粒籽粒中,有108粒扩增出了相应目的条带,转基因阳性率为39.42%;经测序验证,108粒阳性籽粒中有1粒在靶位点外发生了基因编辑,在部分阳性籽粒的自交后代中,发现了靶位点发生编辑的籽粒。因此,本研究初步证实利用注射浸花以及农杆菌介导法对基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑是有效的,但编辑效率有待于进一步提高。 展开更多
关键词 花生 CRISPR/Cas9 注射浸花法 FatB 基因编辑
在线阅读 免费下载
CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响 认领
7
作者 刘磊 李娜 +3 位作者 姜雪雍 孙健 吕雨泽 葛菁萍 《中国农学通报》 2020年第29期69-77,共9页
旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋... 旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S.cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。 展开更多
关键词 酿酒酵母 CRISPR/Cas9 2 3-丁二醇 载体构建 代谢工程
在线阅读 下载PDF
基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统 认领
8
作者 郭燕华 安邦 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期109-117,共9页
[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶... [背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9 橡胶树胶孢炭疽菌 基因敲除
IKBKB基因c.1183T>C点突变小鼠的建立及基本表型分析 认领
9
作者 冯苠璇 周丽娜 +2 位作者 秦涛 赵晓东 贾彦军 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2020年第3期469-477,共9页
该研究主要为探究IKBKB基因c.1183T>C位点突变对人免疫器官淋巴细胞的影响。采用CRISPR/Cas9技术构建相应点突变模式小鼠,并提取小鼠(C57BL/6J)基因组DNA进行PCR及一代测序、鉴定及扩繁,使用密度梯度离心法提取小鼠脾脏及胸腺淋巴细... 该研究主要为探究IKBKB基因c.1183T>C位点突变对人免疫器官淋巴细胞的影响。采用CRISPR/Cas9技术构建相应点突变模式小鼠,并提取小鼠(C57BL/6J)基因组DNA进行PCR及一代测序、鉴定及扩繁,使用密度梯度离心法提取小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞,采用Real-time PCR及Western blot检测淋巴细胞中IKKs家族各亚基(IKKα、IKKβ和IKKγ) mRNA及蛋白的表达,并使用分子运行模式(molecular operating environment,MOE)软件分析蛋白PDB结构及建立3D模型。小鼠基因测序结果表明成功构建点突变稳定基因型小鼠;与野生型小鼠相比,纯合突变小鼠IKBKB mRNA表达无明显变化,而IKKβ蛋白表达明显降低;蛋白结构分析结果提示,突变后的IKKβ蛋白空间构型明显改变。研究初步表明,IKBKB Y397H突变导致小鼠脾脏及胸腺的淋巴细胞中IKKβ蛋白明显下降,可能是由于突变导致蛋白结构发生改变而使其稳定性降低,这为进一步探究该位点突变对免疫细胞稳态调节及其致病机制提供了新思路及实验基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 IKBKB基因 小鼠模型 蛋白预测 淋巴细胞
CRISPR/Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展 认领
10
作者 宋绍征 陆睿 +4 位作者 张婷 何正义 吴赵曼秋 成勇 周鸣鸣 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期62-68,共7页
CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,... CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对羊进行遗传修饰,将加速品种改良,提高动物生产性能,获得更加优质的农副产品。主要对CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述、作用机理及在羊乳"人源化"改造、提高肉品质、改善毛纤维质量等方面的应用研究进展及发展前景作简要阐述,以期为相关科研人员提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 基因组 遗传 山羊 绵羊
在线阅读 免费下载
异色瓢虫nAChRα6基因的敲除及其对杀虫剂敏感性的影响 认领
11
作者 刘帅 王兴亮 +2 位作者 施雨 石旺鹏 吴益东 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期478-487,共10页
为探索天敌昆虫异色瓢虫Harmonia axyridis基因功能研究的新技术及遗传改良的新途径,以其烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基(nAChRα6)作为靶标基因,利用CRISPR/Cas9技术在异色瓢虫CAU-S品系中对其进行敲除,并测定多杀菌素、吡虫啉与阿维菌素... 为探索天敌昆虫异色瓢虫Harmonia axyridis基因功能研究的新技术及遗传改良的新途径,以其烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基(nAChRα6)作为靶标基因,利用CRISPR/Cas9技术在异色瓢虫CAU-S品系中对其进行敲除,并测定多杀菌素、吡虫啉与阿维菌素对敲除纯合品系Haα6KO和野生型品系CAU-S的毒力,分析该基因的敲除是否影响异色瓢虫对这3种杀虫剂的敏感性。结果显示,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑及分子标记辅助筛选,成功获得异色瓢虫nAChRα6基因5号外显子缺失8 bp的敲除纯合品系Haα6KO。相对于野生型品系CAU-S,多杀菌素、吡虫啉与阿维菌素对敲除纯合品系Haα6KO的毒力指数分别为1.12、0.91和1.04,且3种杀虫剂对这2个品系的LC50的95%置信限无显著差异,表明异色瓢虫nAChRα6可能不是上述3种杀虫剂的作用靶标。本研究成功建立的CRISPR/Cas9介导的异色瓢虫基因编辑体系,可用于其基因功能研究及遗传改良。 展开更多
关键词 异色瓢虫 CRISPR/Cas9 烟碱型乙酰胆碱受体 基因敲除 多杀菌素
基因编辑技术在农业育种中的应用 认领
12
作者 王维佳 李萌鑫 《安徽农业科学》 CAS 2020年第3期18-25,共8页
介绍当下流行的基因编辑技术的发展现状以及在农业领域的具体应用,对于种子性状改良与市场价值进行文献梳理,试图说明基因编辑在农业育种上的发展趋势,除了TALEN(transcription activator-like effector nucleases)和ZFN(zinc finger nu... 介绍当下流行的基因编辑技术的发展现状以及在农业领域的具体应用,对于种子性状改良与市场价值进行文献梳理,试图说明基因编辑在农业育种上的发展趋势,除了TALEN(transcription activator-like effector nucleases)和ZFN(zinc finger nuclease)这两类常用的基因编辑工具外,CRISPR-Cas9(CRISPR-associated protein 9)是目前最为流行的工具,目前已经通过CRISPR/Cas9改变多项农作物性状,如花色调控、延长橱架寿命、抗杀草剂、提升抗逆境能力、增加抗病性等。由于利用CRISPR/Cas9创造的作物通过孟德尔遗传分离后,不含其他生物的外源基因,因此不受基因改造法规的限制,成为科学界研究与开发的最新利器。我国一向高度重视并取得一系列成果,但是对于最新基因编辑技术的文献梳理相对较少,该研究主要贡献是结合最新资料阐述基因编辑技术在农业育种领域的应用,为我国发展基因编辑技术提供文献参考。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 农业育种
在线阅读 下载PDF
CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展 认领
13
作者 刘灵康 郑喜邦 《中国家禽》 北大核心 2020年第3期75-81,共7页
利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。... 利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。 展开更多
关键词 转基因鸡 原始生殖细胞 CRISPR/Cas9 基因敲入 输卵管特异性表达
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定 认领
14
作者 滕蔓 郑鹿平 +3 位作者 刘金玲 柴书军 张改平 罗俊 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期675-684,共10页
近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是M... 近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek’s disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病病毒(MDV) MEQ基因 CRISPR/Cas9 基因编辑
PTPMT1稳定敲减细胞株的建立及其表型分析 认领
15
作者 沈金花 陈春发 《中南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2020年第4期349-354,共6页
为进一步研究基因PTPMT1在肺癌细胞中的功能,利用CRISPR/Cas9系统建立了基因PTPMT1敲减的肺腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)细胞株,并对基因敲减细胞株进行了一系列表型研究.结果表明:在A549细胞中基因PTPMT1的减少会导致细胞生长减缓.... 为进一步研究基因PTPMT1在肺癌细胞中的功能,利用CRISPR/Cas9系统建立了基因PTPMT1敲减的肺腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)细胞株,并对基因敲减细胞株进行了一系列表型研究.结果表明:在A549细胞中基因PTPMT1的减少会导致细胞生长减缓.在非同步化的条件下,敲减细胞株和野生型细胞株的细胞周期并无明显变化,但在敲减细胞中细胞周期相关蛋白P27的mRNA水平显著升高. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 线粒体蛋白络氨酸磷酸酶1 细胞增殖
在线阅读 免费下载
CHO细胞中DNMT3A对ATF3基因甲基化的影响 认领
16
作者 张梦筱 王佳贤 +1 位作者 朱建伟 路慧丽 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1150-1157,共8页
转录激活因子3(ATF3)是一种早期应激反应基因,能够影响细胞增殖、分化、转化和凋亡。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一。ATF3能够促进肿瘤细胞的增殖及抗凋亡等作用,理论上可对CHO... 转录激活因子3(ATF3)是一种早期应激反应基因,能够影响细胞增殖、分化、转化和凋亡。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一。ATF3能够促进肿瘤细胞的增殖及抗凋亡等作用,理论上可对CHO细胞发挥调节作用。因此本试验对CHO细胞中ATF3的甲基化水平进行深入研究,通过重亚硫酸盐测序法检测CHO-K1细胞中ATF3的甲基化水平,发现ATF3启动子区域的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)甲基化高达90%。为了进一步研究ATF3甲基化的上游调控机制,构建了敲除DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)的CHO-K1来研究DNMT3A对ATF3甲基化水平的影响。结果表明,敲除DNMT3A后,CHO-K1细胞中的ATF3甲基化水平降低至0,这充分证明了DNMT3A对ATF3的甲基化的调控作用,为CHO细胞的ATF3基因调控研究以及后续CHO细胞株改造提供了理论依据。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 转录激活因子3(ATF3) CRISPR/Cas9 DNMT3A
新孢子虫GRA16和MYR2基因功能的初步研究 认领
17
作者 杜博亚 李新 +6 位作者 王晓岑 常乐 张西臣 宫鹏涛 张楠 杨举 李建华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第5期533-540,共8页
目的制备抗新孢子虫致密颗粒蛋白NcGRA16和原癌基因调控蛋白NcMYR2多克隆抗体,对NcGRA16和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位;构建NcGRA16基因敲除虫株(△NcGRA16)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致... 目的制备抗新孢子虫致密颗粒蛋白NcGRA16和原癌基因调控蛋白NcMYR2多克隆抗体,对NcGRA16和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位;构建NcGRA16基因敲除虫株(△NcGRA16)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。方法原核表达NcGRA16和NcMYR2蛋白,纯化后免疫小鼠,制备抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcGRA16和NcMYR2蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9技术构建△NcGRA16和△NcMYR2虫株,通过噬斑试验、入侵试验、增殖试验、逸出试验和动物试验探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果成功制备抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcGRA16蛋白定位于虫体致密颗粒中,NcMYR2蛋白定位于虫体高尔基体;成功构建△NcGRA16和△NcMYR2虫株,与野生虫株相比△NcGRA16虫株的噬斑面积减小(P<0.05);入侵率降低(P<0.05)。与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcGRA16虫株的小鼠死亡时间延长3~5d;血清中IL-6和INF-γ显著下降(P<0.05);脑、心和脾荷虫量显著降低(P<0.05);脑和心脏病理变化减轻。感染△NcMYR2虫株的小鼠死亡时间延长1~2d;血清中IL-6水平显著下降(P<0.05)。结论NcGRA16为新孢子虫入侵和毒力相关基因,敲除NcMYR2基因对虫体的生长、入侵及毒力等无明显影响,这为揭示新孢子虫致病机制和新孢子虫病防控提供了理论依据。 展开更多
关键词 新孢子虫 CRISPR-cas9 NcGRA16 NcMYR2
蒙古牛无角POLLED位点的定点编辑 认领
18
作者 谷明娟 高丽 +4 位作者 周新宇 吴迪 魏著英 李光鹏 白春玲 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期242-250,共9页
在养殖业中,牛角作为个体间争斗和伤人工具而成为养牛业的隐患之一。POLLED位点是目前发现控制牛(Bovidae)无角性状的主要位点,但在实际生产中,存在该位点的牛并不多见。为研制无角基因编辑牛,本研究利用CRISPR/Cas9技术,将POLLED位点P2... 在养殖业中,牛角作为个体间争斗和伤人工具而成为养牛业的隐患之一。POLLED位点是目前发现控制牛(Bovidae)无角性状的主要位点,但在实际生产中,存在该位点的牛并不多见。为研制无角基因编辑牛,本研究利用CRISPR/Cas9技术,将POLLED位点P202ID基因型定点整合到有角蒙古牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞基因组中,建立P202ID基因型蒙古牛成纤维细胞系。首先以牛POLLED位点为靶点,设计合成4对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到CRISPR/Cas9系统表达载体。Surveyor酶切结果显示,由sgRNA1~4构建的载体切割效率依次是24%、26%、55%和17%,其中p Cas-Guide-EF1α-GFPsgRNA3活性最高。利用电转染法将活性最高的切割载体与含有P202ID序列的打靶载体共转染到蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过流式细胞仪分选阳性单细胞,进一步培养使其形成单克隆细胞;然后利用PCR及DNA测序技术,鉴定得到4株定点整合入细胞基因组的阳性单克隆细胞,可作为后续体细胞核移植的供体细胞。本研究可为培育无角体细胞克隆牛提供实验材料和技术支撑,为研究牛角的发生发育机制提供基础材料。 展开更多
关键词 蒙古牛 POLLED位点 无角牛 P202ID基因型 CRISPR/Cas9
甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立 认领
19
作者 王飞 钟雄辉 +3 位作者 陈登辉 李海龙 康俊根 颉建明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期69-78,共10页
为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研... 为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl2+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×106个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台。最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台。 展开更多
关键词 甘蓝 原生质体 瞬时转化 正交设计 CRISPR/Cas9
在线阅读 免费下载
利用CRISPR/Cas9技术建立PTEN敲除的人子宫内膜腺癌细胞模型及其功能研究 认领
20
作者 李宇恒 邓诚思 +4 位作者 关爱伟 宋晓宇 冯艳玲 关奕 曹流 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期582-585,共4页
目的利用CRISPR/Cas9技术构建靶向PTEN的基因编辑质粒,构建PTEN稳定敲除的人子宫内膜腺癌细胞株KLE,并初步探讨PTEN敲除对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响。方法设计靶向人PTEN基因的sgRNA序列,构建puro-cas9-PTENsgRNA质粒,测序验证;... 目的利用CRISPR/Cas9技术构建靶向PTEN的基因编辑质粒,构建PTEN稳定敲除的人子宫内膜腺癌细胞株KLE,并初步探讨PTEN敲除对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响。方法设计靶向人PTEN基因的sgRNA序列,构建puro-cas9-PTENsgRNA质粒,测序验证;将重组质粒转染人子宫内膜腺癌细胞KLE,嘌呤霉素筛选获得PTEN稳定敲除细胞株;用T7E1酶切实验检测切割效率,Western blotting检测PTEN的蛋白表达水平,并检测细胞自噬相关因子LC3、P62的表达水平,检测细胞活性,探讨PTEN敲除对子宫内膜癌细胞自噬的调控作用。结果 CRISPR/Cas9系统对KLE细胞基因组中的PTEN进行了切割,并在同源重组时发生了碱基错配,PTEN被成功敲除;PTEN敲除降低了细胞自噬相关因子LC3Ⅰ型向Ⅱ型转化,增加了P62的累积。PTEN敲除的细胞活性增强。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在人子宫内膜腺癌细胞中成功敲除PTEN,抑制了人子宫内膜腺癌细胞的自噬水平,为后续研究提供了细胞模型。 展开更多
关键词 PTEN CRISPR/Cas9 细胞自噬
在线阅读 下载PDF
上一页 1 2 68 下一页 到第
使用帮助 返回顶部 意见反馈