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hsc70-4基因促进家蚕核型多角体病毒复制增殖
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作者 陈鹏 包希艳 +4 位作者 董战旗 康涛涛 朱艳 潘敏慧 鲁成 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1275-1284,共10页
【目的】热休克应答(heat shock response, HSR)是机体细胞应对环境压力的一种重要防御策略,鉴定热休克蛋白在杆状病毒侵染宿主过程中的功能,并揭示其作用的分子机制,为探明宿主与病毒相互作用的分子基础提供理论依据。【方法】通过分... 【目的】热休克应答(heat shock response, HSR)是机体细胞应对环境压力的一种重要防御策略,鉴定热休克蛋白在杆状病毒侵染宿主过程中的功能,并揭示其作用的分子机制,为探明宿主与病毒相互作用的分子基础提供理论依据。【方法】通过分子克隆技术对Bmhsc70-4基因进行克隆,并利用BioEdit及GeneDoc对其进行多序列比对分析;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对Bmhsc70-4基因进行过表达和敲除;利用荧光定量PCR技术检测相应基因的表达量;通过对Caspase-9和Caspase-3/7活性的检测确定Bmhsc70-4基因对细胞凋亡的影响;通过免疫荧光验证BmHSC70-4和BmlAP的共定位情况,并进一步通过免疫共沉淀验证它们的相互作用。【结果】Bmhsc70-4基因开放阅读框为1950 bp,编码649个氨基酸,在昆虫间具有较高的保守性;BmNPV能够诱导Bmhsc70-4基因上调表达,过表达Bmhsc70-4基因能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmhsc70-4基因能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmhsc70-4基因的表达利于BmNPV的增殖;Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能;荧光共定位显示BmHSC70-4和BmlAP共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;BmNPV侵染过程中Bmhsc70-4基因能够促进B加ap基因的表达。【结论】Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能,在BmNPV侵染家蚕细胞过程中,能够与BmlAP相互作用,并促进BmNPV复制增殖。 展开更多
关键词 家蚕 BMNPV 热休克应答 细胞凋亡 Bmhsc70-4 Bmiap
家蚕ADP/ATP转运酶(BmANT)抑制BmNPV增殖作用机制研究
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作者 董战旗 蒋亚明 +1 位作者 陈鹏 潘敏慧 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1474-1483,共10页
[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家... [目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家蚕热休克蛋白60(heat shock protein 60,BmHSP60)具有直接的相互作用。因此,鉴定Bmant基因在BmNPV感染过程中的功能特征,有助于解析杆状病毒劫持宿主细胞因子促进自身增殖复制机制,完善杆状病毒和宿主相互作用网络。[方法]通过结构域预测BmANT蛋白的结构特征,荧光定量PCR分析Bmant基因在BmNPV感染后的变化特征;并过表达BmANT检测其对病毒DNA复制和病毒蛋白表达变化影响;进一步在转录水平分析Bmant和Bmhsp60基因的调控关系;最后通过流式细胞术等技术鉴定Bmant和Bmhsp60基因共同调控BmNPV增殖复制的机制。[结果] SMART软件预测显示BmANT包含3个线粒体载体结构域,BmNPV感染24 h后Bmant基因持续下调表达。过表达Bmant基因能够显著抑制BmNPV DNA的复制和VP39蛋白表达。荧光定量PCR分析显示Bmant和Bmhsp60基因具有相互拮抗作用,能够相互抑制转录。Bmant和Bmhsp60共同过表达分析显示,BmANT和BmHSP60共同作用BmNPV能够抑制病毒的增殖复制。[结论]结果表明,BmANT是一个线粒体载体蛋白,具有显著的抗病毒作用,能够下调Bmhsp60基因表达,并抑制BmNPV增殖复制。 展开更多
关键词 家蚕 家蚕核型多角体病毒 BmANT BmHSP60 抗病毒
家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响 预览
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作者 陈鹏 包希艳 +4 位作者 康涛涛 董战旗 朱艳 潘敏慧 鲁成 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期558-567,共10页
【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibi... 【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP)的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。【方法】利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。【结果】通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmp 展开更多
关键词 家蚕 凋亡抑制蛋白 互作蛋白 家蚕核型多角体病毒 BmPP5
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抗BmNPV新品种“华康2号”的引进与推广 预览
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作者 李有江 《蚕桑通报》 2019年第1期46-49,共4页
“华康2号”是中国农业科学院蚕业研究所培育的对家蚕血液型脓病(BmNPV)具有高度抵抗性的蚕品种。2013年获贵州省农作物品种审定委员会审定通过(黔审蚕2013002号)。桐乡市于2014年春蚕期引进了“华康2号”,2014~2015年进行了蚕种试繁和... “华康2号”是中国农业科学院蚕业研究所培育的对家蚕血液型脓病(BmNPV)具有高度抵抗性的蚕品种。2013年获贵州省农作物品种审定委员会审定通过(黔审蚕2013002号)。桐乡市于2014年春蚕期引进了“华康2号”,2014~2015年进行了蚕种试繁和农村生产试验,并在生产实践中不断改良提升优良性状,探索良种良法,积累推广经验,从2016年开始逐步实现了大面积推广应用。 展开更多
关键词 农作物品种审定委员会 BMNPV 中国农业科学院 生产试验 血液型脓病 蚕业研究所 大面积推广 优良性状
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云南家蚕核型多角体病毒分离株的毒力测定及系统进化分析 预览
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作者 唐芬芬 张永红 +2 位作者 邵榆岚 朱峰 白兴荣 《昆虫学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1160-1169,共10页
【目的】由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori导致的核型多角体病(血液型脓病)在云南蚕区普遍发生,危害严重,给云南蚕业带来严重的经济损失。本研究旨在测定云南不同蚕区BmNPV分离株的毒... 【目的】由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori导致的核型多角体病(血液型脓病)在云南蚕区普遍发生,危害严重,给云南蚕业带来严重的经济损失。本研究旨在测定云南不同蚕区BmNPV分离株的毒力及了解BmNPV在云南的病害流行趋势,为监测和控制云南家蚕血液型脓病打下基础。【方法】通过BmNPV对家蚕5龄幼虫致死率和对家蚕BmN细胞毒力的测定评价了云南蚕区19个BmNPV分离株的致病力;对19个云南BmNPV分离株的bro-d基因进行克隆、测序及系统进化分析。【结果】BmNPV对家蚕5龄幼虫的致死率测定表明,云南不同地区BmNPV毒株对家蚕的口服感染力差异较大;细胞毒力测定结果显示不同BmNPV分离株的出芽型病毒粒子(budded virus,BV)滴度差异较大。进化分析表明,所获取来自云南的19个BmNPV分离株主要分为两个亚群,亚群I在云南省的东部、中部和西部地区均有分布,而亚群II主要集中分布于云南省北部地区。从地理分布图可以看出,亚群I所在地区多为亚热带,温度偏高;而亚群II所处的云南北部地区多为典型高原季风气候,温度相对偏低。【结论】云南蚕区存在丰富的BmNPV株系,各分离株对家蚕的毒力差异较大;云南BmNPV分离株的进化关系在一定程度上与地理气候密切相关。 展开更多
关键词 家蚕 蚕区 BMNPV 生物测定 bro-d 云南
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陕西省安康市蚕种场蚕种质量保证体系的建设情况及效果 预览
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作者 张保华 李宗平 +2 位作者 王庆国 吴波 杨云艳 《中国蚕业》 2018年第3期57-61,共5页
为了进一步提高蚕种质量,陕西省安康市蚕种场于2002年制定并实施了《安康市蚕种场蚕种质量保证体系》,内容包括各级蚕种质量标准及各项技术操作规范。介绍了陕西省安康市蚕种场采取的各项监管措施:加强技术管理,强化质量监管,依靠经营... 为了进一步提高蚕种质量,陕西省安康市蚕种场于2002年制定并实施了《安康市蚕种场蚕种质量保证体系》,内容包括各级蚕种质量标准及各项技术操作规范。介绍了陕西省安康市蚕种场采取的各项监管措施:加强技术管理,强化质量监管,依靠经营管理促进质量提高,以人为本提质增效,加强基础设施的改造和科技创新等。总结了陕西省安康市蚕种场提高蚕种质量所取得的良好成效:超毒淘汰率明显降低,良卵率、实用孵化率等质量指标稳步提升,用户反响好、市场份额高,在全国蚕种质量抽查中,蚕种综合质量成绩优异。 展开更多
关键词 蚕种质量 生物学性状 经济性状 微粒子病 实用孵化率 良卵率 BMNPV
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华康2号亲本品系人工饲料摄食性选育效果初报 预览
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作者 赵国栋 钱荷英 +2 位作者 刘明珠 李刚 徐安英 《中国蚕业》 2018年第1期28-31,共4页
为培育适应人工饲料育的BmNPV抗性品种,促进人工饲料省力化养蚕,2017年以蚁蚕24h疏毛率为主要选育指标,用桑叶粉含量30%的家蚕实用性颗粒人工饲料进行了华康2号4个亲本品系秋丰N(中系)、白玉NA系(日系)、白玉NB系(日系)和白... 为培育适应人工饲料育的BmNPV抗性品种,促进人工饲料省力化养蚕,2017年以蚁蚕24h疏毛率为主要选育指标,用桑叶粉含量30%的家蚕实用性颗粒人工饲料进行了华康2号4个亲本品系秋丰N(中系)、白玉NA系(日系)、白玉NB系(日系)和白玉NC系(日系)的4代摄食性选育,调查了华康2号亲本品系对人工饲料的摄食性和选育效果。试验结果表明:通过累代人工饲料选育,明显提高了华康2号中系亲本和日系亲本对颗粒人工饲料的摄食性,而颗粒人工饲料对华康2号中系亲本和日系亲本的茧质成绩和眠蚕体质量影响不大。 展开更多
关键词 家蚕 华康2号 人工饲料 摄食性 24h疏毛率 BMNPV 选育
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家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析 预览
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作者 王菲 李显扬 +1 位作者 化晓婷 夏庆友 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第4期789-799,共11页
【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV... 【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式(BmRelish-FL)是否转变成其活性形式(BmRelishact);利用荧光定量PCR检测过表达BmRelishact的细胞在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV(BmNPV-EGFP)感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelishact的细胞相比较,以确定Bm Relish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelishact的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelishact的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelishact的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelishact;过表达BmRelishact的细胞被Bm NPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelishact的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelishact的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵� 展开更多
关键词 家蚕 家蚕核型多角体病毒 BmRelish 细胞因子 抗病毒免疫
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家蚕新品种华康2号在安康农村试养初报 预览 被引量:1
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作者 秦超 陈正余 +2 位作者 邱茂慈 陈子培 孔祥江 《北方蚕业》 2017年第2期32-35,共4页
安康市2016年秋季在汉滨区、石泉县、平利县、旬阳县11家养蚕户进行了家蚕新品种华康2号农村养蚕试验,与当地大面积推广的家蚕品种菁松×皓月、明丰×春玉、春华×秋实相比较,华康2号抗病性强,好养、高产,综合性状优良,但... 安康市2016年秋季在汉滨区、石泉县、平利县、旬阳县11家养蚕户进行了家蚕新品种华康2号农村养蚕试验,与当地大面积推广的家蚕品种菁松×皓月、明丰×春玉、春华×秋实相比较,华康2号抗病性强,好养、高产,综合性状优良,但丝质成绩不如菁松×皓月品种。 展开更多
关键词 华康2号 核型多角体病毒(BmNPV)病 性状调查
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抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究 预览
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作者 李龙 孙慧 +3 位作者 刘泽玉 徐安英 钱荷英 武国华 《安徽农业科学》 CAS 2017年第20期111-116,共6页
[目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法.[方法]选取对 BmNPV 具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象,对它们进行添食 BmNPV 病毒处理.提取家蚕的血淋巴,运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测.[结果... [目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法.[方法]选取对 BmNPV 具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象,对它们进行添食 BmNPV 病毒处理.提取家蚕的血淋巴,运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测.[结果]筛选出优化的体积排阻色谱分离条件:YarraTM SEC-2000分离柱,30 mmol/L Tris-醋酸为流动相(pH 7.4),流速0.5 mL/min.建立了分离与检测家蚕血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS联用技术.BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分.[结论]制备了葡聚糖G100凝胶柱分离并收集可能与BmNPV 抗性相关的家蚕血液分离液,为家蚕金属蛋白的分离提供更简便有效的方法. 展开更多
关键词 家蚕 抗性 体积排阻色谱 电感耦合等离子体质谱
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分子连锁分析探讨家蚕高抗BmNPV品系的抗性遗传基础 预览 被引量:1
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作者 高瑞 李春林 +5 位作者 童晓玲 曹明亚 石美宁 徐安英 鲁成 代方银 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期195-204,共10页
【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所引发的血液型脓病是一种传染性强的蚕病,极大地影响蚕业生产。本研究旨在定位对BmNPV高抗的家蚕品系中控制其抗性的基因,进而解析其抗性遗传机制,为培育抗性素... 【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所引发的血液型脓病是一种传染性强的蚕病,极大地影响蚕业生产。本研究旨在定位对BmNPV高抗的家蚕品系中控制其抗性的基因,进而解析其抗性遗传机制,为培育抗性素材和品系提供理论支持。【方法】以BmNPV高抗家蚕品系99R和较感品系Dazao-N为亲本,配制连锁分析(BC1F)和定位分析(BC1M)回交群体。首先对两个亲本品系进行浓度梯度添毒,统计感病死亡的家蚕头数,运用SPSS 17.0软件,计算其半致死剂量(LD50),在此基础上确定BC1分离群体的攻毒剂量,并通过单头定量攻毒,选取感病个体作为连锁定位分析材料;利用筛选得到的覆盖家蚕全套常染色体的多态性标记进行分型,并通过T检验计算各标记与抗性的连锁显著性水平(P值),筛选出与抗性相连锁的标记。在这些标记所在的染色体上加密标记,检测各标记在定位分析群体中的基因型,定位抗性基因。【结果】LD50(99R)=2.92×10^6个多角体/头,LD(50)(Dazao-N)=9.78×10^5个多角体/头,基于双亲的半致死剂量,选择介于两者之间且略高于其均值的剂量——2×10^6个多角体/头作为BC1分离群体的攻毒剂量;先后于2014年秋季和2015年春季处理并检测连锁分析群体,前后两次所进行的连锁分析结果有较大差异,其中第一次找到Chr22上的多态性标记S2205与99R抗性连锁,而第二次的连锁分析显示标记S2205与抗性不连锁,也没有找到其他的连锁关系。通过与前人对BmNPV抗性的连锁定位分析结果进行对比,发现连锁定位分析结果的不可重复性是一个普遍的问题。AY380833是GenBank中已公布的在家蚕高抗品系NB和871C中与其抗性位点紧密连锁的分子标记,本研究调查发现其与99R和871C的抗性位点均不连锁。【结论】分子连锁分析结果证明,家蚕对BmNPV的抗性在不同抗性品系中遗传基础 展开更多
关键词 家蚕 BMNPV 抗性 分子标记 连锁分析
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基于细胞转基因平台创制抗BmNPV的细胞素材
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作者 雷雪蛟 田甜 +3 位作者 曹明亚 李海清 董战旗 潘敏慧 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期751-760,共10页
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是影响蚕业生产最为严重的病原之一,每年对我国蚕业生产方面造成很大的经济损失。通过RNA干扰技术(RNAi)干扰BmNPV的增殖关键基因可以有效地抑制病毒的增殖复制。本研究... 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是影响蚕业生产最为严重的病原之一,每年对我国蚕业生产方面造成很大的经济损失。通过RNA干扰技术(RNAi)干扰BmNPV的增殖关键基因可以有效地抑制病毒的增殖复制。本研究以BmNPV侵染关键基因gp64和lef-1为靶标基因,并利用病毒诱导型启动子LEF3P和39KP共构建了4种RNAi干扰表达载体,分别命名为:piggyBacA3-EGFP-39KP-gp64、piggyBacA3-EGFP-39KP-lef-1、piggyBacA3-EGFP-LEF3P-gp64、piggyBacA3-EGFP-LEF3P-lef-1。经瞬时转染和筛选稳定表达的家蚕细胞系抗病毒检测结果表明,通过RNAi技术能够有效的抑制病毒增殖复制,并确定了39KP启动效果优于LEF3P启动子,干扰gp64基因的抗病毒效果优于lef-1基因。这些研究结果为后期转基因品系培育和家蚕抗病毒研究提供了基础。 展开更多
关键词 RNA干扰 BMNPV 转基因 GP64 lef-1 39KP
杆状病毒LEF-11蛋白自身相互作用关键区域的鉴定 预览 被引量:3
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作者 蒋亚明 董战旗 +5 位作者 陈婷婷 胡楠 董非凡 黄亮 唐良彤 潘敏慧 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第20期4028-4035,共8页
[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发... [目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。[方法]利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(fluorescent co-location)技术,首先根据Bm NVP lef-11及各个截短片段序列和荧光蛋白序列设计引物,通过PCR技术扩增回收得到所有片段以及荧光标签片段,并且通过限制性内切酶处理回收后,将荧光标签片段分别连接到昆虫细胞表达载体p IZ/V5-His上,构建p IZ-Ds Red和p IZ-EGFP质粒,然后用相同方法构建LEF-11全长和逐步截短的LEF-11红色荧光融合蛋白载体,分别与p IZ-LEF11-GFP共同转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,更换普通培养基48 h后固定细胞并制片,最后在荧光共聚焦显微镜下观察荧光融合蛋白表达及定位情况,鉴定LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域;荧光双分子互补试验相关载体的构建步骤与荧光融合表达载体构建方法一致,转染处理及荧光观察方法也相同。[结果]杆状病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能与LEF-11蛋白全长发生相互作用,分别共定位于细胞质和细胞核;逐步截短过程中,LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能与LEF-11蛋白全长共同定位于细胞质中,但其52—61、2—41未发生共定位;C-端截短片段能够与LEF-11蛋白全长发生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91,但92—112和72—81区域未发现共定位现象;双分子荧光互补试验结果验证LEF-11蛋白N-端片段与LEF-11蛋白全长相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51,而2—41、52—61截短突变体则不能,与N-端片� 展开更多
关键词 家蚕 BMNPV LEF-11 双分子荧光互补 自身相互作用
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短时热激后家蚕对核型多角体病毒的抗性及相关抗菌肽和热激蛋白基因表达水平的变化 预览
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作者 唐芬芬 郑亚强 +1 位作者 白兴荣 陈斌 《昆虫学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期505-512,共8页
【目的】探讨短时热激对家蚕Bombyx mori抵抗核型多角体病毒能力的影响,为深入研究家蚕热激响应的抗病毒免疫机制提供参考。【方法】家蚕5龄幼虫42℃热激15 min后,经口喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NP... 【目的】探讨短时热激对家蚕Bombyx mori抵抗核型多角体病毒能力的影响,为深入研究家蚕热激响应的抗病毒免疫机制提供参考。【方法】家蚕5龄幼虫42℃热激15 min后,经口喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)(5.4×106PIBs/头)后正常饲养,观察热激对家蚕感染病毒的影响;同时,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测热激后7类抗菌肽主基因(Bmcec D,Bmmor,Bmglve2,Bmdefe B,Bmatta1,Bmenbo2和Bmlebo3)以及6种热激蛋白基因(Bmhsp90,Bmhsp70,Bmhsp40,Bmhsp19.9,Bmhsp21.4和Bmhsp25.4)在家蚕5龄幼虫中肠组织中的表达变化;利用MEGA 5.0软件对家蚕所有热激蛋白进行系统进化分析。【结果】与未进行热激处理相比,短时42℃热激能够明显提高感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫的存活率。实时荧光定量RT-PCR结果表明,与未热激处理相比,热激处理后感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫中肠组织中Bmglve2和Bmhsp25.4的表达量显著上升。另外,系统进化分析显示,小分子热激蛋白Bm HSP25.4在进化上特殊,单独与大分子热激蛋白(Bm HSP90,Bm HSP70和Bm HSP40)聚为一类。【结论】短时热激能够提高家蚕对Bm NPV的抗性,热激蛋白基因Bmhsp25.4和抗菌肽基因Bmglve2可能在家蚕热激响应的抗病毒免疫中发挥关联功能。 展开更多
关键词 家蚕 热激 BMNPV 抗菌肽 热激蛋白 mRNA表达水平
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浅谈亚热带地区家蚕核型多角体病毒病的防治方法 预览 被引量:1
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作者 罗平 《中国蚕业》 2017年第3期59-62,67共5页
从家蚕品种选用、消毒防病新经验、新药物、饲养新技术等方面,对亚热带地区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)病的防治方法做了简要论述。在亚热带地区,为了控制BmNPV病的危害,可在不同气候条件下选用不同的抗性品种(如选用华康2号或桂蚕N2... 从家蚕品种选用、消毒防病新经验、新药物、饲养新技术等方面,对亚热带地区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)病的防治方法做了简要论述。在亚热带地区,为了控制BmNPV病的危害,可在不同气候条件下选用不同的抗性品种(如选用华康2号或桂蚕N2等抗BmNPV病家蚕品种)的同时,加强消毒防控措施及重视对其它病害的防控。另外,配套应用负压式水帘空调控温控湿机饲养小蚕,应用正压式水帘空调控温控湿机饲养大蚕等新的饲养技术,改善家蚕的饲养环境,精心饲养,提高家蚕体质,可以减少家蚕的发病率,降低BmNPV病的危害。 展开更多
关键词 亚热带地区 高温多湿 家蚕 BMNPV 核型多角体病毒病 抗逆性
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对家蚕抗核型多角体病毒的研究策略及研究进展 被引量:1
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作者 董战旗 潘敏慧 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期139-146,共8页
由家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)引发的家蚕血液型脓病是生产上危害最为严重的蚕病之一。国内外学者从研究家蚕的抗病遗传规律、选育对病毒具有抵抗力的家蚕品种,一直到应用现代分子生物学技术研究病毒的基因组、转录组和蛋白组,研究病... 由家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)引发的家蚕血液型脓病是生产上危害最为严重的蚕病之一。国内外学者从研究家蚕的抗病遗传规律、选育对病毒具有抵抗力的家蚕品种,一直到应用现代分子生物学技术研究病毒的基因组、转录组和蛋白组,研究病毒的侵染规律及与蚕体的互作,基于RNAi和CRISPR/Cas9技术培育转基因抗病毒素材等,已经取得了诸多进展。本文系统总结近10年来有关家蚕抗Bm NPV研究在上述各个方面取得的重要成果,并对未来家蚕抗病毒机制研究和抗病毒分子育种趋势以及亟需解决的科学与技术问题进行探讨,以期为不断深入的家蚕抗病毒研究提供参考。 展开更多
关键词 家蚕 家蚕核型多角体病毒 抗性分子机制 抗性育种素材
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株对家蚕的亚致死作用测试 被引量:1
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作者 唐芬芬 郑亚强 +2 位作者 李从容 白兴荣 陈斌 《蚕业科学》 CSCD 北大核心 2017年第6期952-956,共5页
病毒对宿主昆虫的亚致死作用是指感染病毒后未死亡的昆虫,其生长发育、生殖等生命活动能力发生了明显变化。为了探明生产上发生家蚕血液型脓病时是否存在病原物家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的亚致死作用,以家蚕品种菁松×皓... 病毒对宿主昆虫的亚致死作用是指感染病毒后未死亡的昆虫,其生长发育、生殖等生命活动能力发生了明显变化。为了探明生产上发生家蚕血液型脓病时是否存在病原物家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的亚致死作用,以家蚕品种菁松×皓月的蚁蚕为材料,测试以低于致死中浓度(LC_(50))的Bm NPV-T3多角体悬液添食处理对存活家蚕的亚致死作用。测定Bm NPV-T3对蚁蚕的LC_(50)值为1.41×10~5m L~(-1)。以浓度为10~5~10~3m L~(-1)的Bm NPV-T3多角体悬液给蚁蚕添食后,存活幼虫的体质量显著降低;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的发育历期明显延长,而对蛹期发育历期的影响不显著;10~5m L~(-1)和10~4m L~(-1)多角体悬液添毒试验组的存活幼虫发育至成虫,其产卵量显著低于对照组;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的蛹体质量、全茧量、茧层量、茧层率均受到一定影响,其中对雌蚕的茧层量影响显著。依据上述试验结果初步认为,以低于致死中浓度的Bm NPV悬液给蚁蚕添毒后,对蚕体的生长发育和产茧、产卵性状都具有一定的影响,Bm NPV对家蚕存在亚致死作用。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 亚致死 家蚕 生长 生殖 产茧量
家蚕抗核型多角体病毒病新品种对BmNPV抗性的鉴定 预览 被引量:1
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作者 钱荷英 李刚 +3 位作者 赵国栋 刘明珠 孙平江 徐安英 《中国蚕业》 2017年第4期15-22,共8页
为了明确新选育的抗病品种对家蚕核型多角体病毒(Bomby mori nuclear polyhydrosis vinls,BmNPV)的抵抗性能,分别以菁松、皓月、932、芙蓉、7532、湘晖及其杂交种菁松x皓月(正反交)、932·芙蓉×7532·湘晖(正反交... 为了明确新选育的抗病品种对家蚕核型多角体病毒(Bomby mori nuclear polyhydrosis vinls,BmNPV)的抵抗性能,分别以菁松、皓月、932、芙蓉、7532、湘晖及其杂交种菁松x皓月(正反交)、932·芙蓉×7532·湘晖(正反交)为对照品种,进行了菁松N、皓月N、932N、芙蓉N、7532N、湘晖N及其杂交种菁松N×皓月N(正反交)、932N·芙蓉N×7532N·湘晖N(正反交)对BmNPV的抗性试验。其中新选育的品种分别用BmNPV多角体浓度为10^9、10^8、10^7、10^6、10^5个/mL的病毒液30uL均匀涂抹于直径2.5cm的圆形桑叶背面,于2龄起蚕时饲喂家蚕;对照品种的BmNPV多角体添食浓度相应地降低1个数量级。48h以后调查各处理区家蚕的发病情况,计算各品种的半致死浓度(LC50)。结果表明:新选育的品种及其杂交种对BmNPV多角体的LC50。均超过10^9个/mL,而其对照品种及其杂交种对BmNPV多角体的LC50均在10。个/ml水平或更低,2者相差3个数量级以上,新品种对BmNPV具有很强的抵抗性。 展开更多
关键词 家蚕品种 BMNPV 血液型脓病 半致死浓度 杂交优势 抗性鉴定
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家蚕核型多角体病毒CQ1分离株与T3株的单核苷酸多态性分析
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作者 潘国庆 李田 +3 位作者 许金山 张永华 倪琪 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期450-457,共8页
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpB... 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmid及Bm90基因补回型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid,并制备Bm90蛋白的多克隆抗体,研究Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装的影响。将3种重组病毒分别转染Bm N细胞,Western blot检测显示Bm90蛋白在病毒转染Bm N细胞后72 h有表达;但用荧光显微镜观察Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有出现绿色荧光,且检测其病毒滴度为0;用透射电子显微镜观察在Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有子代病毒粒子出现。研究结果表明,Bm90基因缺失会抑制子代病毒粒子的组装和产生,使病毒失去侵染性,Bm90基因是病毒增殖及组装的必需基因。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 Bm90基因 λRed重组系统 BAC-TO-BAC系统 病毒增殖 病毒组装
Bmp24缺失对家蚕核型多角体病毒基因组的复制、转录及病毒组装的影响 预览
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作者 陈琛 于威 +3 位作者 史利利 巩成见 蒋磊 童富淡 《浙江理工大学学报》 2016年第1期109-115,共7页
研究Bmp24基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统构建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修复型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后将Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分别转染BmN细胞,病... 研究Bmp24基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统构建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修复型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后将Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分别转染BmN细胞,病毒滴度测定发现3种病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞发病,但Bmp24-ko-Bacmid在各个时相的滴度值显著低于其他两种病毒(P〈0.05)。电镜观察结果发现Bmp24-ko-Bacmid感染的细胞中只有少量细长的杆状结构,而其他两种病毒感染细胞后能够产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qPCR实验结果显示,Bmp24缺失不会影响病毒基因组的复制,同时qRT-PCR结果显示Bmp24缺失使早期、晚期基因和极晚期基因的转录水平显著低于野生型病毒(P〈0.05)。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 Bmp24基因 RED重组系统 BAC-TO-BAC系统
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