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耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展 认领
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作者 郑茂 邹玉 +1 位作者 刘晓 袁成良 《中国感染与化疗杂志》 CAS 北大核心 2021年第1期105-110,共6页
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床常见的条件致病菌,可引起肺部感染、尿路感染以及血流感染等多种疾病,严重时还可引起脓毒血症、化脓性脑膜炎等致死率极高的危急重症[1]。伴随荚膜多糖的差异和细菌毒力的变迁,肺炎克雷伯菌... 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床常见的条件致病菌,可引起肺部感染、尿路感染以及血流感染等多种疾病,严重时还可引起脓毒血症、化脓性脑膜炎等致死率极高的危急重症[1]。伴随荚膜多糖的差异和细菌毒力的变迁,肺炎克雷伯菌还进化出新变种——高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 碳青霉烯类 高毒力 耐药 质粒
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四种去内毒素试剂盒提取质粒中内毒素水平的比较 认领
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作者 杨振苹 张静静 +7 位作者 邢体坤 王斌 宋路萍 荆新蕊 宋彦君 黄帅 王亚萍 潘若文 《中国医药科学》 2020年第13期11-14,共4页
目的比较四种去内毒素质粒提取试剂盒所提质粒中内毒素的水平。方法本实验选用了四种商业化去内毒素试剂盒进行质粒提取,然后用鲎试剂凝胶法和动态浊度法对所提质粒DNA进行内毒素检测。结果四种试剂盒所提取的质粒得率、A260/A280、A260... 目的比较四种去内毒素质粒提取试剂盒所提质粒中内毒素的水平。方法本实验选用了四种商业化去内毒素试剂盒进行质粒提取,然后用鲎试剂凝胶法和动态浊度法对所提质粒DNA进行内毒素检测。结果四种试剂盒所提取的质粒得率、A260/A280、A260/A230均符合要求,内毒素水平均小于0.1EU/μg。其中,C试剂盒所提取的质粒中内毒素含量最低。结论四种去内毒素质粒提取试剂盒在质粒得率、内毒素含量、价格方面有一定的差异。其中C试剂盒所提质粒得的率最高,内毒素含量最低,但价格也最贵;B试剂盒性价比最高,使用时应根据实际情况综合考虑。 展开更多
关键词 质粒 内毒素 去内毒素质粒提取试剂盒 凝胶法 动态浊度法
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红曲菌MpigE基因过表达质粒的构建 认领
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作者 郑学海 柳燕 +3 位作者 朱锦懋 杨成龙 陈由强 陈建楠 《福建农业科技》 2020年第5期1-11,共11页
以福建红曲菌MCL为出发菌株,以PSKH质粒为模板克隆PtrpC启动子及TrpC终止子。通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE(目的)基因、TrpC终止子,获得PMT融合片段。为了验证融合片段PMT的正确性,进行琼脂糖凝胶电泳分析,在2100 bp左... 以福建红曲菌MCL为出发菌株,以PSKH质粒为模板克隆PtrpC启动子及TrpC终止子。通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE(目的)基因、TrpC终止子,获得PMT融合片段。为了验证融合片段PMT的正确性,进行琼脂糖凝胶电泳分析,在2100 bp左右出现单一且清晰的条带。通过EcoR V和Spe I酶切PMT片段,插入带有潮霉素抗性的PSKH质粒的EcoR V和Spe I位点,构建1个红曲菌过表达载体HPMT,大小为7155 bp。通过构建过表达载体,以期对红曲菌MCL进行改造,获得高产色素低产桔霉素的菌株。 展开更多
关键词 红曲菌 MpigE基因 质粒 过表达 构建
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构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒 认领
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作者 梅芬 李瑞玮 +4 位作者 张娟娟 左荣霞 邹云莲 沈涛 撒亚莲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期110-114,共5页
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α... 旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。 展开更多
关键词 ALOX5 CRISPR/Cas9 基因敲除 构建 质粒
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帕金森病致病基因Parkin与突触相关蛋白synaptojanin1的相互作用研究 认领
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作者 张佳 陈旭 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2020年第9期979-982,共4页
目的探讨帕金森病致病基因Parkin与突触相关蛋白synaptojanin1(SYJ-1)的关系。方法选择雄性8周龄野生型C57B/L小鼠5只,获取脑组织裂解物,分为阳性对照组、抗Parkin抗体组、抗SYJ-1抗体组和阴性对照组,阳性对照组不加任何抗体,后3组分别... 目的探讨帕金森病致病基因Parkin与突触相关蛋白synaptojanin1(SYJ-1)的关系。方法选择雄性8周龄野生型C57B/L小鼠5只,获取脑组织裂解物,分为阳性对照组、抗Parkin抗体组、抗SYJ-1抗体组和阴性对照组,阳性对照组不加任何抗体,后3组分别加入抗Parkin抗体、抗SYJ-1抗体、无效抗体处理,检测Parkin和SYJ-145表达。选择人胚肾细胞系(HEK-293T)细胞进行结构域鉴定实验,用免疫沉淀反应检测Parkin与SYJ-1共沉淀。检测构建Parkin不同结构域截短突变质粒。Pakrin对SYJ-1泛素化降解实验中,将HEK-293T细胞分为6组(n=5)转染:绿色荧光蛋白(GFP)-SYJ-145+HA-UB质粒组(A组)、GFP-SYJ-145+Flag-Parkin组(B组)、GFP-SYJ-145+HA-UB+Flag-Parkin质粒组(C组)、MG132处理的GFP-SYJ-145+HA-UB+MG132质粒组(D组)、GFP-SYJ-145+Flag-Parkin+MG132质粒组(E组)和GFP-SYJ-145+HA-UB+Flag-Parkin+MG132质粒组(F组),检查GFP-SYJ145表达。结果阳性对照组有Parkin和SYJ-145表达,抗Parkin抗体组有SYJ-145表达,抗SYJ-1抗体组有Parkin表达,而阴性对照组无Parkin和SYJ-145表达。转染293T细胞能够表达构建的6种截短突变质粒Ubl,LINK,R0,R1,IBR,R2。免疫沉淀反应发现,IBR和R2结构域的缺失抑制Parkin与SYJ-1的共沉淀。C组GFP-SYJ-145表达明显低于A组、B组、D组、E组、F组(0.23±0.01 vs 0.52±0.01,0.55±0.02,0.62±0.01,0.60±0.01,0.48±0.01,P<0.01)。结论SYJ-1为Parkin蛋白E3连接酶的一个新的底物,Parkin特异性的通过IBR和R2结构域直接结合SYJ-1,Parkin通过蛋白酶体途径促进SYJ-1降解。 展开更多
关键词 帕金森病 突触蛋白类 质粒 突触囊泡蛋白 转染
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结肠癌患者血清中miR-186-5p表达的研究 认领
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作者 程建平 李珍 +3 位作者 赵晓琳 杨梦媛 冀希炜 于久飞 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2020年第10期1097-1104,共8页
目的:探讨miR-186-5p在结肠癌中的表达及其对于结肠癌的影响,为结肠癌的治疗和预后治疗提供新的治疗靶点。方法:收集本院符合条件的病人血清样本,分为健康组、临床I、II、III、IV期5个组别(n=20),利用miRVana microRNA分离试剂盒提取病... 目的:探讨miR-186-5p在结肠癌中的表达及其对于结肠癌的影响,为结肠癌的治疗和预后治疗提供新的治疗靶点。方法:收集本院符合条件的病人血清样本,分为健康组、临床I、II、III、IV期5个组别(n=20),利用miRVana microRNA分离试剂盒提取病人血清中的miRNA,利用荧光实时定量PCR检测miR-186-5p在不同阶段结肠癌病人血清中表达的差异。将miR-186-5p的全长基因克隆到pENTR/D-Topo载体,构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂,降低miR-186-5p表达。利用细胞增殖ELISA试剂盒,将5×10^3/孔的细胞接种到96孔板中,孵育24 h后加入BrdU标记24 h,在370和492 nm测定吸光度,测定miR-186-5p对肿瘤细胞增殖的影响。用MTT法检测miR-186-5p对结肠癌细胞系对化疗药物敏感性的影响。结果:结肠癌病人血清中miR-186-5p呈低表达状态,与正常组相比,临床I、II、III、IV期病人血清中miR-186-5p表达明显减少(P<0.01)。利用质粒构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂(hsamiR-186-5p inhibitor)降低SW480、HCT116两种细胞内miR-186-5p的表达。与对照组相比,过表达miR-186-5p的HCT116细胞和SW480细胞增殖能力减弱,说明miR-186-5p表达增多抑制了HCT116细胞和SW480细胞的增殖。miR-186-5p抑制剂处理后,与对照组相比,HCT116细胞和SW480细胞的增殖能力均升高,说明miR-186-5p表达降低可以增加HCT116细胞和SW480细胞的增殖。不同浓度顺铂处理24 h后,高表达miR-186-5p的HCT116和SW480细胞死亡率均高于对照组(P<0.01),miR-186-5p表达降低后,死亡率低于对照组(P<0.01)。在miR-186-5p高表达的结肠癌细胞系中,PLK1蛋白表达降低,而抑制miR-186-5p表达后,PLK1蛋白表达升高。结论:结肠癌患者中miR-186-5p表达降低,过表达miR-186-5p可以抑制结肠癌细胞增殖生长,并降低结肠癌细胞的耐药性,抑制miR-186-5p表达可以增加结肠癌细胞增殖,并增强细胞的耐药性。 展开更多
关键词 结肠癌 miR-186-5p 质粒 细胞增殖 顺铂
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llinc000522调控Wnt通路影响胃癌侵袭转移的机制研究 认领
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作者 余国庆 赫永金 +1 位作者 许迪锋 许勇 《中国基层医药》 CAS 2020年第2期174-178,共5页
目的探讨llinc000522调控Wnt通路影响胃癌侵袭转移的机制。方法选取胃癌细胞系中的SGC-7901细胞,通过长链非编码RNA(IncRNA)表达谱与逆转录定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)结合,筛选出与INC0005相关且在胃癌细胞中具有侵袭转移作用的微小RN... 目的探讨llinc000522调控Wnt通路影响胃癌侵袭转移的机制。方法选取胃癌细胞系中的SGC-7901细胞,通过长链非编码RNA(IncRNA)表达谱与逆转录定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)结合,筛选出与INC0005相关且在胃癌细胞中具有侵袭转移作用的微小RNA(miRNA);通过体外细胞转染实验,研究Ilinc00052和miRNA的表达变化;通过分子实验,研究Ilinc00052表达及其对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响,探索linc00052能否通过调控miRNA影响Wnt/β-catenin信号通路,影响胃癌细胞的侵袭转移。结果通过Transwell小室试验测得未转染质粒组,穿膜细胞数为(134.10±4.29)个,llinc000522过表达转染质粒组穿膜细胞数为(169.24±6.99)个,差异有统计学意义(t=8.956,P=0.001)。划痕实验显示,llinc000522过表达转染质粒组迁移距离显著高于空载质粒转染组(r=0.907,P<0.01)。llinc000522过表达转染质粒组克隆形成率与空载质粒组相比明显提高[(92.75±6.32)%比(73.34±9.14)%,t=5.998,P<0.05]。与空白质粒转染相比,llinc000522过表达转染组Wnt1、Wnt3a、Wnt2、β-catenin的miRNA表达均显著上调(均P<0.05),而miRNA转染组对其表达并无明显作用,而当llinc000522、miRNA过表达共转染胃癌细胞后,Wnt1、Wnt3a、Wnt2、β-catenin miRNA转录水平提高[(1.82±0.11)、(1.52±0.15)、(1.42±0.21)、(1.71±0.19),P<0.05],但其表达仍低于单独llinc000522转染的基因miRNA转录水平。与空白质粒转染相比,llinc000522过表达转染组Wnt1、Wnt3a、Wnt2、β-catenin蛋白表达均显著上调(均P<0.05),而miRNA转染组对其表达并无明显作用,而当llinc000522、miRNA过表达共转染胃癌细胞后,Wnt1、Wnt3a、Wnt2、β-catenin蛋白表达也明显提高[(1.53±0.09)、(1.4±0.21)、(1.33±0.07)、(1.47±0.19),P<0.05],但其表达仍低于单独llinc000522转染的基因蛋白表达水平。结论在胃癌细胞中,llinc000522可通过调控miRNA水平,影响Wnt/β-catenin通路,进而影响胃癌的侵袭转移。 展开更多
关键词 胃肿瘤 肿瘤侵润 肿瘤转移 WNT蛋白质类 长链非编码RNA 质粒 转染 克隆细胞
志贺菌属对喹诺酮类药物的耐药性研究进展 认领
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作者 王华 孙娜 杨文 《农业科学研究》 2020年第3期51-54,共4页
肠科杆菌会引起人和动物以腹泻为主要发病特征的各类包括内源性和外源性的传染病,主要包括大肠杆菌、志贺杆菌等。志贺菌是一种从大肠杆菌逐渐进化分离出来的细菌种属,是临床上常见的细菌型痢疾的致病菌,近年来痢疾的发病率仍然居高不下... 肠科杆菌会引起人和动物以腹泻为主要发病特征的各类包括内源性和外源性的传染病,主要包括大肠杆菌、志贺杆菌等。志贺菌是一种从大肠杆菌逐渐进化分离出来的细菌种属,是临床上常见的细菌型痢疾的致病菌,近年来痢疾的发病率仍然居高不下。[1]在我国常见的志贺菌主要有福氏志贺菌和宋内志贺菌。20世纪80年代初期,人们发现喹诺酮类对腹泻患者表现出强大的杀灭细菌能力。但是,随着喹诺酮的使用,志贺菌对该类药物也产生了耐药性,其中可移动遗传元件包括质粒、转座子、整合子等对志贺菌的耐药性也有很大关联。细菌耐药性的产生会增加用药的成本、影响治疗效果以及新药的开发成本和周期。因此,需要了解并总结志贺菌耐喹诺酮类药物的耐药性机制及相关研究进展。 展开更多
关键词 志贺菌 耐药性 喹诺酮 质粒
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基于STAT3通路探讨沉默星形胶质上调基因-1对人胆囊癌GBC-SD细胞增殖及凋亡的影响 认领
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作者 徐松涛 孟松 +1 位作者 顾凤华 顾国建 《现代中西医结合杂志》 CAS 2020年第27期2970-2974,共5页
目的探讨沉默星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)对人胆囊癌GBC-SD细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的影响。方法实验分为空白对照组(仅有空质粒,无任何阴性或阳性干扰序列)、阴性对照组(携带AEG-1阴性序列)、RNA干扰组(携带AEG-1基因干扰序... 目的探讨沉默星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)对人胆囊癌GBC-SD细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的影响。方法实验分为空白对照组(仅有空质粒,无任何阴性或阳性干扰序列)、阴性对照组(携带AEG-1阴性序列)、RNA干扰组(携带AEG-1基因干扰序列),将人GBC-SD细胞接种于培养板内,按要求进行质粒载体转染细胞操作,采用qPCR法检测各组AEG-1 mRNA表达水平,采用Western blot法检测STAT3、p-STAT3和AEG-1蛋白表达水平,采用MTT法检测各组GBC-SD细胞增殖情况,采用Hoechst 33342染色法检测各组GBC-SD细胞凋亡情况,采用ELISA法检测各组GBC-SD细胞分泌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平。结果与空白对照组和阴性对照组比较,RNA干扰组AEG-1 mRNA及蛋白表达水平和p-STAT3蛋白表达水平均明显降低,GBC-SD细胞增殖明显下降,凋亡率明显增高,MMP-2和MMP-9水平明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论沉默AEG-1可以通过STAT3信号通路抑制人GBC-SD细胞的增殖和诱导其凋亡。 展开更多
关键词 胆囊癌 星形胶质细胞上调基因-1 质粒 基质金属蛋白酶
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5株发酵食品源乳酸菌的抗药性分析 认领
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作者 黄晓棠 姚妞妞 +2 位作者 周璇 郭润芳 于宏伟 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第8期111-116,共6页
以实验室前期分离自混合果蔬酵素的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum S)、分离自树莓酵素的植物乳杆菌(L.plantarum WD)和分离自不同奶制品的保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus LB-DR)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus Lr-05-281)与干酪乳杆菌(... 以实验室前期分离自混合果蔬酵素的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum S)、分离自树莓酵素的植物乳杆菌(L.plantarum WD)和分离自不同奶制品的保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus LB-DR)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus Lr-05-281)与干酪乳杆菌(L.casei D-400)5株乳酸菌为研究对象,采用平板药敏纸片扩散法、PCR及RT-PCR技术从表型、基因型以及基因表达几个方面分析菌株的抗药性。结果表明5株菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、糖肽类抗生素、多粘菌素B均有抗性;对大环内酯类、四环素类、磺胺类抗生素、呋喃妥因均敏感,并有较为相似的耐药谱;而对不同的β-内酰胺类抗生素敏感性不同;5株乳酸菌均含有质粒,供试的12个抗性基因中,在质粒上检测到erm、aph、vanⅠ、aacⅠ4种抗性基因,基因组DNA上检测到aph、erm、vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ、aacⅡ6种抗性基因。部分抗性基因在MRS和加抗生素的MRS培养下会表达,不表达的抗性基因在相应抗生素诱导的条件下其抗性基因不表达。L.plantarum WD菌株质粒上因只含一种vanⅠ抗性基因,其应用安全性较好。 展开更多
关键词 发酵食品 乳酸菌 抗药性 抗药基因 质粒
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IL-35 慢病毒表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达 认领
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作者 冯涛 吴学举 +9 位作者 赵娟 林雯昕 杨明义 李家勇 阮进松 张学刚 陈祥 史浪涛 朱立 韩鹏 《国际医药卫生导报》 2020年第18期2685-2690,共6页
目的通过构建过表达IL-35的慢病毒载体,转染鼻咽癌细胞,建立稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株,为进一步研究IL-35对鼻咽癌细胞的影响奠定基础。方法根据GenBank中的EBI3和IL-l2p35基因序列,设计引物克隆EBI3和IL-l2p35基因。PCR产物和pLVX-I... 目的通过构建过表达IL-35的慢病毒载体,转染鼻咽癌细胞,建立稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株,为进一步研究IL-35对鼻咽癌细胞的影响奠定基础。方法根据GenBank中的EBI3和IL-l2p35基因序列,设计引物克隆EBI3和IL-l2p35基因。PCR产物和pLVX-IRES-ZsGreenl质粒(命名为H145)经过经酶切、转化、筛选、测序鉴定等后获得重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl,命名为H11864。将重组质粒H11864和H145经过慢病毒包装后转染HEK-293T细胞,收取病毒浓缩液并检测其滴度。用病毒浓缩液感染CNE细胞,用Real-time PCR和ELISA检测IL-35的表达情况。检测IL-35过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。结果测序结果显示,本研究成功构建重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.10×108 TU·ml-1和1.03×109 TU·ml-1。Real-time PCR检测结果显示,与CNE-H11864(4626159.23±246221.40)相比,CNE-H145(1.22±0.77)和CNE(0.80±0.65)中IL-35的mRNA表达量显著较低(均P<0.01)。ELISA检测显示,CNE-H11864中IL-35的蛋白含量为344.84 pg/ml,与CNE-H145的33.00 pg/ml相比,显著增高(P<0.01)。CCK-8检测结果表明,与空白组和质粒对照组相比,CNE-H11864组在转染72 h后吸光度值明显升高(均P<0.05),并且在96 h进一步升高(均P<0.01)。结论本研究成功构建稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株,IL-35蛋白能够促进人鼻咽癌细胞的增殖能力。 展开更多
关键词 白细胞介素-35 质粒 慢病毒 鼻咽癌细胞
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酪氨酸羟化酶的大肠杆菌表达载体构建 认领
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作者 余群慧 田雪珂 +2 位作者 高燕 李飞翔 肖桂然 《合肥工业大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2020年第10期1417-1421,共5页
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的作用是将L-酪氨酸催化为L-多巴,而L-多巴是多巴胺的前体物质。TH功能异常导致多巴胺合成受损,进而引起多种神经性疾病的发生。为了探索TH的结构和功能性质,文章利用基因工程技术和生物学方法,... 酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的作用是将L-酪氨酸催化为L-多巴,而L-多巴是多巴胺的前体物质。TH功能异常导致多巴胺合成受损,进而引起多种神经性疾病的发生。为了探索TH的结构和功能性质,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增TH基因全长,连接至pET-28a载体,构建原核表达载体pET-28a/TH,转入表达菌株E.coli BL21,IPTG诱导表达蛋白。结果表明,pET-28a/TH表达载体构建成功,并且TH基因能有效表达,为进一步研究该基因的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 酪氨酸羟化酶(TH) 大肠杆菌 质粒
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大鼠β-arrestin2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定 认领
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作者 陈思思 周恒 +4 位作者 王继春 谢菁 周艳丽 卢帅 卢力 《贵州医科大学学报》 CAS 2020年第9期1025-1030,共6页
目的:构建大鼠β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)基因过表达慢病毒载体并鉴定。方法:取Pubmed数据库中大鼠β-arrestin 2的cDNA序列合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获取大鼠β-arrestin 2基因;采用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收PCR产物并对... 目的:构建大鼠β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)基因过表达慢病毒载体并鉴定。方法:取Pubmed数据库中大鼠β-arrestin 2的cDNA序列合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获取大鼠β-arrestin 2基因;采用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收PCR产物并对其进行纯化;取限制性内切酶BamHI/AgeI酶切载体质粒和纯化后的PCR产物,将二者实施连接后转化感受态细胞,挑取菌落进行PCR鉴定,并对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对抽提质粒;将β-arrestin2重组质粒与慢病毒辅助包装质粒共转染至293T细胞,获取病毒粗提液并进行扩增、纯化,稀释法测定病毒滴度、荧光显微镜下观察慢病毒感染效率。结果:PCR扩增所得产物大小为1274 bp,与Pubmed数据库中该基因片段大小一致;阳性转化子的PCR产物大小为728 bp,对比Pubmed数据库中大鼠Arrb 2基因序列,上下游引物基因序列大小与转化子PCR产物结果一致;慢病毒包装完成后病毒滴度为5×1011 TU/L,病毒感染效率较高。结论:成功构建了携带大鼠β-arrestin2基因的慢病毒载体,目的基因在转染细胞内能稳定高表达。 展开更多
关键词 质粒 慢病毒属 β-抑制蛋白2基因 基因过表达 聚合酶链式反应
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多粘菌素耐药基因mcr-1的研究进展 认领 被引量:1
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作者 王新兴 翟真真 +2 位作者 常维山 王巧云 蒋汉明 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第2期110-114,共5页
多粘菌素耐药基因mcr-1由1626个核苷酸序列组成,其主要作用是介导肠杆菌科细菌对多粘菌素产生抗药性。mcr-1基因可携带完整的ISApl1或ISApl1片段,翻译一段由541个氨基酸组成具有介导磷酸乙醇胺转移作用的酶。mcr-1能整合于质粒,可以随... 多粘菌素耐药基因mcr-1由1626个核苷酸序列组成,其主要作用是介导肠杆菌科细菌对多粘菌素产生抗药性。mcr-1基因可携带完整的ISApl1或ISApl1片段,翻译一段由541个氨基酸组成具有介导磷酸乙醇胺转移作用的酶。mcr-1能整合于质粒,可以随质粒在不同细菌中水平传播,甚至可以与其他的耐药基因共同存在于同一质粒,表达后产生多种耐药机制。mcr-1基因介导多粘菌素类药物耐药,但并不耐受目前所有的抗生素。本文对mcr-1基因的发现、分布、流行及耐药性等研究进展进行综述,以期为人类共同遏制多粘菌素类药物耐药基因的流行,及抗生素的安全用药提供可参考依据。 展开更多
关键词 mcr-1 多粘菌素 耐药性 质粒
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亚剂量抗生素诱导抗性基因水平迁移 认领
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作者 袁其懿 CHEN Hong-jie +1 位作者 Laurence Haller 何义亮 《环境科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第8期3748-3757,共10页
为探究亚剂量抗生素诱导下编码广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase,ESBL)基因的接合转移(conjugation),使用从新加坡主要医院的废水中直接分离的可合成ESBL的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)菌株作为ESBL编... 为探究亚剂量抗生素诱导下编码广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase,ESBL)基因的接合转移(conjugation),使用从新加坡主要医院的废水中直接分离的可合成ESBL的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)菌株作为ESBL编码质粒的供体,以携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的耐氯霉素(chloramphenicol,CHL)大肠杆菌SCC1(E.coli SCC1)作为受体,借助响应面分析,检测并分析了携带有ESBL编码基因的质粒在亚剂量水平的四环素(tetracycline,TC),磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SMZ)和头孢他啶(ceftazidime,CAZ)单一暴露和共同暴露时,从供体菌株接合传递至受体菌株的特征.结果发现,ESBL编码质粒可在无诱导抗生素胁迫下,以平均0.0015和0.0042的频率分别由铜绿假单胞菌和大肠杆菌供体接合转移至受体大肠杆菌SCC1菌株,具有较低的"适应性代价",并在质量浓度低于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的抗生素暴露下更易在大肠杆菌菌株之间传递.大肠杆菌菌株之间的接合转移显著发生在质量浓度低于0.03 mg·L-1的TC与质量浓度低于0.002 mg·L-1的CAZ单一暴露或共同暴露时,并可被亚MIC的TC显著抑制.铜绿假单胞菌与大肠杆菌间的接合转移可在5倍MIC的TC、CAZ共同暴露时被显著诱导,未检测到亚MIC水平抗生素对其的促进作用. 展开更多
关键词 广谱β-内酰胺酶(ESBL) 质粒 接合体 抗生素 亚剂量 响应面分析
志贺氏菌CRISPR位点的比较基因组学及与质粒数量的相关性分析 认领 被引量:1
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作者 曲道峰 陆诗铫 +4 位作者 陈跃文 黄东萍 龚俏玲 易松强 韩剑众 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第5期242-250,共9页
成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)在多数细菌和古生菌中广泛存在,该遗传结构可以有效防御外源DNA(如质粒、噬菌体等)的侵袭,从而降低外源基因的水平转移。本文的研究对象为志贺氏菌属中的鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、宋内氏志贺... 成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)在多数细菌和古生菌中广泛存在,该遗传结构可以有效防御外源DNA(如质粒、噬菌体等)的侵袭,从而降低外源基因的水平转移。本文的研究对象为志贺氏菌属中的鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌以及福氏志贺氏菌等40株菌。研究不同志贺氏菌种中CRISPR位点的结构差异,其与可移动质粒之间的关联。采用生物信息学的方法比较间隔序列与插入序列的同源性,判断CRISPR位点与RNA二级结构稳定性的关系。结果:40株志贺氏菌中均含CRISPR结构,共有241个CRISPR位点和6个确定位点。本研究发现cas3基因和重复序列均不可作为这4类细菌的分类依据。结论:CRISPR位点的数量和间隔区数量之间在统计学上无关。耐药基因、间隔序列整合子等移动遗传原件具有一定的同源性,表明志贺氏菌在进化过程中不断受到外源基因的侵袭。 展开更多
关键词 志贺氏菌 CRISPR 间隔区 外源基因 质粒
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PRRSV结构蛋白GP5的原核表达与鉴定 认领
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作者 于秀菊 孙铮 +1 位作者 李钰钰 韩小涛 《山西农业科学》 2020年第11期1852-1855,共4页
利用大肠杆菌原核表达系统体外表达猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的GP5蛋白,可为GP5蛋白的应用奠定物质基础。研究利用PCR技术获得带有酶切位点的gp5基因,通过酶切、连接构建p Cold I-gp5重组质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,获得阳性单... 利用大肠杆菌原核表达系统体外表达猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的GP5蛋白,可为GP5蛋白的应用奠定物质基础。研究利用PCR技术获得带有酶切位点的gp5基因,通过酶切、连接构建p Cold I-gp5重组质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,获得阳性单克隆后诱导其表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果显示,p Cold I-gp5原核表达载体构建成功,该重组载体在大肠杆菌表达系统中能够表达,并且重组蛋白GP5以可溶性蛋白的形式表达。 展开更多
关键词 GP5蛋白 原核表达 质粒
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一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用 认领
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作者 连拯民 田明星 +3 位作者 尹伊 石文弢 包世俊 于圣青 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期322-329,共8页
[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的... [背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 NanoLuc荧光素酶 布鲁菌 启动子活性 质粒
植物植原体病害研究进展 认领
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作者 徐平洛 翟晓巧 《河南林业科技》 2020年第4期20-23,30,共5页
植原体是一种无细胞壁的多形态原核生物,由昆虫传播并感染了全球1000多种植物,是超过100种植物疾病的病原体,包括数种重要的林木及经济作物,从经济和环境的角度来看,对植原体病害的研究是非常必要的。从植原体的概况、植原体病害的症状... 植原体是一种无细胞壁的多形态原核生物,由昆虫传播并感染了全球1000多种植物,是超过100种植物疾病的病原体,包括数种重要的林木及经济作物,从经济和环境的角度来看,对植原体病害的研究是非常必要的。从植原体的概况、植原体病害的症状、植原体的分类、植原体基因组的研究、植原体质粒以及植原体PMU这几个方面进行了综述,从而全面了解植物植原体病害的研究进展,为植原体的分子生物学研究提供借鉴。 展开更多
关键词 植原体 分类 基因组 质粒 PMU
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RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定 认领
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作者 张明明 张博文 +8 位作者 王思涵 覃金华 曾泉 范增 何丽娟 岳文 裴雪涛 李艳华 孙自敏 《军事医学》 CAS 北大核心 2020年第2期97-104,共8页
目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-M... 目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白。通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高。结论成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础。 展开更多
关键词 Runt相关转录因子1c GATA结合蛋白2 质粒 水动力转染 肝细胞
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