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猪圆环病毒3型ORF3蛋白的原核表达及纯化 认领
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作者 关现军 连凯琪 +4 位作者 时志琪 林正丹 王英杰 宋玉伟 王双山 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第3期96-98,102,共4页
为了制备猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3)ORF3蛋白的抗原,试验采用PCR技术扩增ORF3基因;通过PCR和双酶切技术鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3;利用SDS-PAGE鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3的表达情况,并分析其是否为可溶性表达... 为了制备猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3)ORF3蛋白的抗原,试验采用PCR技术扩增ORF3基因;通过PCR和双酶切技术鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3;利用SDS-PAGE鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3的表达情况,并分析其是否为可溶性表达;采用包涵体纯化试剂盒纯化ORF3蛋白,并利用SDS-PAGE分析纯化情况。结果表明:PCR扩增得到ORF3基因,其大小为696 bp,并成功构建出重组质粒pET28a(+)-ORF3;该重组质粒可在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,表达的ORF3融合蛋白以包涵体形式存在,纯化的蛋白条带单一。说明PCV-3 ORF3蛋白可被成功表达并纯化。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 ORF3蛋白 蛋白表达 蛋白纯化 包涵体 融合蛋白
类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性 认领
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作者 刘宁 崔梅英 +6 位作者 王明月 杨泽斌 王浩 毛禹 方楷漪 夏薇 关新刚 《北华大学学报:自然科学版》 CAS 2021年第1期42-46,共5页
目的构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELPmCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶... 目的构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELPmCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELPmCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELPmCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果DNA测序结果显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100%.结论成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性. 展开更多
关键词 类弹性蛋白多肽 红色荧光蛋白 原核表达 蛋白纯化 细胞相容性
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重组牛IFN-γ蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化和鉴定 认领
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作者 王睿男 蒋菲 +7 位作者 刘亚涛 宋晓晖 刘永生 王文 储岳峰 曹小安 王传彬 孙雨 《中国草食动物科学》 CAS 2021年第2期39-43,共5页
为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白。实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大... 为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白。实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒,最后利用SF9昆虫细胞悬浮培养大量表达目的蛋白。蛋白纯化后经Western Blotting和BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γELISA检测试剂盒检测分析,具有较好的免疫原性和反应原性。研究结果为牛IFN-γ的单克隆抗体制备以及牛结核病临床诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 重组牛IFN-γ蛋白 杆状病毒 真核表达 蛋白纯化
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IRF6调控IFN-β的功能验证与结构研究 认领
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作者 魏迪洋 闫利明 +1 位作者 李巍然 贾绮林 《生物学杂志》 CAS 北大核心 2021年第1期14-17,共4页
利用X射线衍射晶体学方法解析IRF6蛋白的三维结构,同时验证IRF6对干扰素-β的转录调控作用,为IRF6蛋白的结构生物学研究提供基础。研究利用高通量基因克隆、蛋白表达与纯化获得大量的IRF6 N端蛋白结构域可溶性表达。凝胶迁移试验(EMSA)... 利用X射线衍射晶体学方法解析IRF6蛋白的三维结构,同时验证IRF6对干扰素-β的转录调控作用,为IRF6蛋白的结构生物学研究提供基础。研究利用高通量基因克隆、蛋白表达与纯化获得大量的IRF6 N端蛋白结构域可溶性表达。凝胶迁移试验(EMSA)结果显示,IRF6 N端结构域可与干扰素-β启动子核酸片段形成蛋白-核酸复合体,具有明确的相互作用。将孵育后的蛋白-核酸复合体进行悬滴气相扩散法晶体筛选与优化后获得了X射线衍射分辨率达2.68的晶体,为进一步揭示IRF6蛋白三维结构提供了帮助。验证了IRF6具有结合干扰素-β启动子元件特定片段的N端结构域,可调控干扰素-β的转录与表达,并通过IRF6 N端结构域与干扰素-β启动子核酸片段共同孵育后获得高分辨率蛋白晶体,以解析IRF6蛋白三维结构。研究结果对IRF6相关疾病机制研究及干扰素相关免疫通路的调控机制有重要意义。 展开更多
关键词 干扰素调节因子6 干扰素-Β 蛋白纯化 蛋白结晶
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布鲁氏菌OMP16抗体的间接ELISA方法建立 认领
5
作者 田路路 李会玲 +4 位作者 支飞杰 王小雨 翟云逸 靳亚平 王爱华 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期30-35,共6页
为建立羊血清布鲁氏菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,以布鲁氏菌(B.suis) S2疫苗株的基因组为模板,通过引物设计、PCR扩增、原核载体构建、IPTG诱导,NTA树脂层析柱亲和层析法纯化重组布鲁氏菌外模蛋白16(OMP16),通过SDS-PAGE... 为建立羊血清布鲁氏菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,以布鲁氏菌(B.suis) S2疫苗株的基因组为模板,通过引物设计、PCR扩增、原核载体构建、IPTG诱导,NTA树脂层析柱亲和层析法纯化重组布鲁氏菌外模蛋白16(OMP16),通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,以纯化的OMP16作为包被抗原,优化反应条件,建立检测布鲁氏菌抗体的iELISA方法。结果显示,克隆了Omp16基因,表达、纯化了重组蛋白OMP16,该重组蛋白具有很好的反应原性。iELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度1μg/mL,血清稀释倍数为10倍,酶标二抗的稀释度为1:1 000,TMB的反应时间为30 min。临床样本检测显示,建立的iELISA方法具有良好的灵敏度,与虎红平板凝集试验的符合率达到了93%。本研究建立的iELISA方法能够满足生产实践中布鲁氏菌病的检测,为布鲁氏菌病流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外模蛋白16 蛋白纯化 间接酶联免疫吸附试验
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口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备 认领
6
作者 辛旭 吴香菊 +5 位作者 齐静 王永志 李相安 杜正国 单虎 杜以军 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第3期109-114,共6页
为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细... 为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达。经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析法初步纯化及Millipore超滤浓缩进一步纯化,将其免疫试验动物新西兰大白兔后制备出了抗3B蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测了该多抗的效价,Western blot试验检测了其反应性,通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验检测了该多抗的应用性。结果表明:该抗体的效价为1∶512000,反应性良好;IFA试验和Western blot试验中可以检测到过表达后定位于细胞核和细胞质中的3B蛋白,也可以检测到在真核细胞中过表达的3B蛋白。说明本研究制备的口蹄疫病毒3B蛋白多克隆抗体可以作为开展该病毒相关研究的重要材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3B蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
基于荧光蛋白的防晒剂研制 认领
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作者 王慧慧 石蒙蒙 +2 位作者 周宏飞 刘杰 孙梅好 《浙江师范大学学报:自然科学版》 CAS 2021年第1期75-83,共9页
为分析湛蓝色荧光蛋白(marine fluorescent protein,MFP)作为蛋白防晒剂的可行性,通过PCR定点突变、原核表达和亲和层析纯化获得MFP,并通过UVB紫外线照射大肠杆菌存活实验初步分析了MFP吸收紫外线的能力,采用噻唑蓝法(thiazolyl blue te... 为分析湛蓝色荧光蛋白(marine fluorescent protein,MFP)作为蛋白防晒剂的可行性,通过PCR定点突变、原核表达和亲和层析纯化获得MFP,并通过UVB紫外线照射大肠杆菌存活实验初步分析了MFP吸收紫外线的能力,采用噻唑蓝法(thiazolyl blue tetrazolium bromide assay,MTT法)分析了MFP对细胞的毒理性.结果表明:MFP将250~400 nm波长的紫外线吸收后释放的荧光波长大于400 nm,吸收峰波长为280 nm(εmax280为3.27×10^4 L·mol^-1·cm^-1)和365 nm(εmax365为1.54×10^4 L·mol^-1·cm^-1);在大肠杆菌内表达MFP可提高菌株抗紫外线的能力;c MFP<5μmol/L时,MFP对TL-Om1细胞株基本没有毒性.因此,MFP可作为广谱防晒剂应用于防晒霜和防晒喷雾等,该结果为蛋白类防晒剂的开发奠定了一定的理论基础. 展开更多
关键词 荧光蛋白 防晒剂 蛋白纯化 光谱分析 细胞毒理性分析
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文章速递中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析 认领
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作者 彭竹 黄丽 +2 位作者 赵淑果 吕建华 赵慧婷 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期178-186,共9页
【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定... 【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂、20日龄中华蜜蜂成年雄蜂、中华蜜蜂采粉蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica采粉蜂触角中的表达量。构建原核表达载体pET28a/AcerOBP 14,表达并分离纯化重组蛋白AcerOBP14。利用荧光竞争结合实验检测AcerOBP14与37种气味配体化合物的结合特性。【结果】qRT-PCR分析发现,OBP14在中华蜜蜂采粉蜂触角中的表达量极显著高于20日龄中华蜜蜂成年工蜂和雄蜂以及意大利蜜蜂采粉蜂中的。荧光竞争结合实验表明,AcerOBP14与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物都具有结合能力,其中与β-罗勒烯的结合能力最强,解离常数Ki=0.297μmol/L。【结论】AcerOBP14的配体结合谱较宽,暗示其可能参与了中华蜜蜂的多种生理行为反应,且在中华蜜蜂的采粉行为中发挥着重要作用。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 气味结合蛋白 蛋白纯化 气味化合物 荧光竞争结合实验
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绵羊FHL2蛋白原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备 认领
9
作者 聂晓宁 李闰婷 +4 位作者 陈龙欣 李玉华 聂文营 张丽萌 王林青 《畜禽业》 2021年第1期3-4,共2页
通过表达和纯化重组的绵羊FHL2抗原蛋白和制备其多克隆抗体,用于研究该蛋白的生物学功能及绵羊繁殖调控的作用机制。研究采用PCR技术扩增绵羊FHL2蛋白的编码序列,利用限制性内切酶双酶切后插入pET28a-sumo中,加入0.5 M IPTG诱导蛋白表达... 通过表达和纯化重组的绵羊FHL2抗原蛋白和制备其多克隆抗体,用于研究该蛋白的生物学功能及绵羊繁殖调控的作用机制。研究采用PCR技术扩增绵羊FHL2蛋白的编码序列,利用限制性内切酶双酶切后插入pET28a-sumo中,加入0.5 M IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA纯化获得48 ku的重组FHL2蛋白。以重组FHL2蛋白为抗原,混合佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,获得抗FHL2的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示抗体效价达到16400。通过转染pEGFP-C1-FHL2质粒至HEK 293F细胞,提取细胞总蛋白,利用制备的抗FHL2多克隆抗体检测蛋白的结合力,具有良好的免疫原性,为研究FHL2蛋白的生物学功能及繁殖调控机制提供良好的基础材料。 展开更多
关键词 绵羊 FHL2基因 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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小麦TaSIM蛋白的原核表达与纯化及Western blotting检测 认领
10
作者 于月华 郑崇珂 倪志勇 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2021年第2期494-497,共4页
为了获得TaSIM(Salinity-induced R2R3-MYB)基因的纯化蛋白,以便研究TaSIM转录因子的DNA结合特异性。本研究以含有pET28a-TaSIM原核表达载体的大肠杆菌BL21为材料,用0.5 mmol/L IPTG,在37℃诱导TaSIM融合蛋白表达2 h,收集上清液,采用Ni-... 为了获得TaSIM(Salinity-induced R2R3-MYB)基因的纯化蛋白,以便研究TaSIM转录因子的DNA结合特异性。本研究以含有pET28a-TaSIM原核表达载体的大肠杆菌BL21为材料,用0.5 mmol/L IPTG,在37℃诱导TaSIM融合蛋白表达2 h,收集上清液,采用Ni-NTA柱纯化含有His标签的TaSIM融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果表明获得了分子量大小约为33 kD的TaSIM融合蛋白。采用Western blotting检测TaSIM融合蛋白的表达,以鼠抗血清和辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠Ig G为抗体,结果表明TaSIM融合蛋白能够和抗体特异结合,说明诱导的蛋白是TaSIM融合蛋白。研究结果为进一步利用凝胶阻滞方法检验TaSIM蛋白与顺式作用元件的结合提供实验基础。 展开更多
关键词 小麦(Triticum aestivum) TaSIM 蛋白纯化 Western杂交
重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化 认领
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作者 张发友 周浩 《南开大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2021年第1期35-40,47,共7页
NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时... NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用,形成一种伸展的打开的构象.果蝇Merlin蛋白的N、C端分子内的相互作用比人源Merlin更强,其构象的调节机制还不是很清楚.构建了原核表达质粒pET-28a-His_(6)-sumo-Merlin,通过大肠杆菌表达系统表达出了可溶性的重组果蝇Merlin蛋白,通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析获得了纯度较高、构象均一的重组蛋白Merlin.而且,还利用分析型超速离心分析了重组蛋白Merlin的构象,为进一步研究Merlin蛋白的三维结构及其构象的调节机制提供了一定的基础. 展开更多
关键词 MERLIN 原核表达 层析 蛋白纯化
人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析 认领
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作者 马文君 滕琳 +4 位作者 田顺利 郭校燕 王培培 郑春阳 卫宏远 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第2期70-75,82,共7页
为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后... 为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,Km值为12.2 mmol/L,V(max)为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A2的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人磷脂酶A2 载体构建 异源可溶表达 蛋白纯化 活性测定
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文章速递非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备 认领
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作者 张赫 杭天宇 +3 位作者 刘春羽 尹坤 温永俊 王凤雪 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期370-375,共6页
由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通... 由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) CP204L基因 原核表达 蛋白纯化 单抗
非成熟体序列对肺表面活性蛋白B分布及表达的影响 认领
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作者 李承燕 张星亮 +1 位作者 刘国军 黄宇戈 《生物技术》 CAS 2020年第2期134-139,共6页
[目的]研究成熟体之外的蛋白序列对肺表面活性蛋白B(SP-B)分布和表达的影响。[方法]将人sp-b(1-381).sp-b(1-279)、sp-bM(201-279)构建到真核载体pEGFP-CI上,转染至A549细胞后采用荧光显微镜检测各SP-B蛋白的表达分布。将sp-b截断基因... [目的]研究成熟体之外的蛋白序列对肺表面活性蛋白B(SP-B)分布和表达的影响。[方法]将人sp-b(1-381).sp-b(1-279)、sp-bM(201-279)构建到真核载体pEGFP-CI上,转染至A549细胞后采用荧光显微镜检测各SP-B蛋白的表达分布。将sp-b截断基因构建到原核载体pGEX-4T-2上转化至大肠杆菌BI21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达,再过亲和层析纯化。[结果]GFP-SP-B(1-381)蛋白均匀分布于A549细胞质,缺失C端非成熟体的GFP-SP-B(1-279)表达分布明显发生改变,缺失N、C端非成熟体的GFP-SP-B"蛋白分布与GFP-SP-B(1-279)类似;重组表达并纯化了分子量约为39 kDa的可溶性蛋白GST-SP-B(265-381)。[结论]非成熟序列可改变成熟体SP-B"在A549细胞中的表达和分布;GST-sp-6(265-381)重组质粒可在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为39kDa的可溶性蛋白。 展开更多
关键词 肺表面活性蛋白B 非成熟体序列 A549细胞 蛋白表达分布 蛋白纯化
细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化 认领
15
作者 徐阳 何好 +2 位作者 朱国庆 陈诗雅 金淑梅 《生物技术》 CAS 2020年第5期417-423,448,共8页
[目的]探究LpPEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(LpPEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到pQE-30原... [目的]探究LpPEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(LpPEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到pQE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出LpPEX5基因,构建pQE-LpPEX5原核表达载体并且诱导和纯化出LpPEX5蛋白。[结论]LpPEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析LpPEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 细叶百合 过氧化物酶体生物合成蛋白 蛋白表达 蛋白纯化
断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用 认领
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作者 杜夜星 周挺峻 +1 位作者 陈浩然 夏海锋 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第2期438-446,共9页
应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的... 应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg·mL^-1,动态吸附载量约为30 mg·mL^-1;纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。 展开更多
关键词 Cfa断裂内含肽 蛋白纯化 亲和层析 剪切 无标签纯化
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大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究 认领 被引量:1
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作者 方佳炜 张梦 +2 位作者 杨一鸣 叶依杨 王中山 《生物技术》 CAS 2020年第1期7-11,共5页
[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表... [目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。 展开更多
关键词 UVRB DNA损伤 切除修复 蛋白表达 蛋白纯化
卵形鲳鲹JAK3蛋白的原核表达与纯化 认领
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作者 杨萌 高爽爽 +3 位作者 谢业扬 段家文 陆专灵 韦友传 《广东农业科学》 CAS 2020年第1期137-142,共6页
【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-... 【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。 展开更多
关键词 卵形鲳鲹 JAK3蛋白 原核表达 蛋白纯化
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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究 认领 被引量:1
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作者 周稳 金前跃 +9 位作者 陈晓 丁培阳 李旭峰 王垚 柴永笑 张雨航 周恩民 郭军庆 郅玉宝 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2020年第1期1-7,共7页
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪... 猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 毕赤酵母 蛋白纯化 免疫活性
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阿胶粗多糖脱蛋白方法比较及抑制酪氨酸酶活性研究 认领
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作者 刘春媛 廖峰 +3 位作者 汝文文 张建岭 李萍 苏宁 《安徽农业科学》 CAS 2020年第3期182-184,235共4页
[目的]研究阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]针对阿胶多糖提取中蛋白质的干扰,通过对几种脱蛋白方法(TCA法、Sevage法、蛋白酶法)的比较,优选出阿胶多糖提取液的脱蛋白方法,并探讨阿胶多糖对酪氨酸酶的抑制作用。[结... [目的]研究阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]针对阿胶多糖提取中蛋白质的干扰,通过对几种脱蛋白方法(TCA法、Sevage法、蛋白酶法)的比较,优选出阿胶多糖提取液的脱蛋白方法,并探讨阿胶多糖对酪氨酸酶的抑制作用。[结果]TCA法、Sevage法及蛋白酶法的脱蛋白率分别为78.94%、87.73%和29.97%,多糖保留率分别为73.96%、32.14%和72.57%。所得阿胶多糖对酪氨酸酶有一定的抑制作用,当浓度为1 mg/mL时,抑制率为24.42%。[结论]TCA法脱蛋白率较高、多糖损失率较低,筛选方法可有效去除阿胶粗多糖中的蛋白,所得阿胶多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用。 展开更多
关键词 阿胶 多糖 蛋白方法 蛋白纯化 酪氨酸酶
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