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H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究 预览
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作者 彭成成 吴熠潇 +1 位作者 刘旭平 谭文松 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期2069-2078,共10页
为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯... 为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系(R~2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。 展开更多
关键词 H9N2亚型禽流感病毒 血凝素 蔗糖密度梯度离心 纯化 SDS-PAGE 定量
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蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒的研究 被引量:1
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作者 高顺平 吴国华 +2 位作者 颜新敏 赵志荀 张强 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第11期52-54,253共4页
为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV),试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000(PEG6000)沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检... 为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV),试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000(PEG6000)沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检测。结果表明:病毒得到有效富集,电镜观察可见完整病毒颗粒且背景清晰。说明蔗糖密度梯度离心技术可以有效纯化细胞培养物中的GTPV,且能保留其免疫原性。 展开更多
关键词 山羊痘病毒 蔗糖密度梯度离心 病毒纯化 聚乙二醇6000 电镜
脊髓灰质炎2型病毒样颗粒在毕赤酵母内的表达与鉴定 预览
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作者 赵辉 温晔 +3 位作者 彭少丹 晏巧玲 马金 朱涛 《微生物学免疫学进展》 2018年第4期7-13,共7页
目的构建可稳定表达脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)的整合型重组毕赤酵母,鉴定PV VLPs在毕赤酵母细胞中的表达及组装情况。方法根据毕赤酵母密码子偏好性优化salk株II型P1和3CD基因并连接到p ... 目的构建可稳定表达脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)的整合型重组毕赤酵母,鉴定PV VLPs在毕赤酵母细胞中的表达及组装情况。方法根据毕赤酵母密码子偏好性优化salk株II型P1和3CD基因并连接到p Pic ZA载体,构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体;用Bgl II线性化p Pic ZA-P1-3CD载体,电转至毕赤酵母GS115中。通过Zeocin抗性筛选获得整合型重组毕赤酵母,随后用高浓度Zeocin抗性筛选得到高表达菌株。甲醇诱导后,用Western Blot检测目的蛋白表达;蔗糖密度梯度离心纯化PV VLPs并进行透射电镜观察。结果成功构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体,获得PV VLPs重组毕赤酵母。Western Blot在重组毕赤酵母裂解上清中检测到目的蛋白的表达;蔗糖密度梯度离心纯化后,在透射电镜中观察到直径为30 nm左右的VLPs,其形态与天然的PV颗粒相似。结论成功构建PV-2型VLPs的整合型重组酵母系统,并在毕赤酵母中组装形成了VLPs,为酵母表达系统中PV VLPs疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 毕赤酵母 蔗糖密度梯度离心 病毒样颗粒
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一种高效分离埃可病毒30型病毒颗粒及其晶体培养方法的建立 预览
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作者 何娅玲 《中外医疗》 2018年第27期15-17,共3页
目的建立高效培养,分离纯化埃可病毒30型(echovirus 30,EC30)的有效方法并筛选优化病毒晶体生长条件,为后续病毒疫苗开发及病毒结构功能研究建立基础。方法先利用人胚胎横纹肌肉瘤细胞系(human embryonic rhabdomyosarcoma cell... 目的建立高效培养,分离纯化埃可病毒30型(echovirus 30,EC30)的有效方法并筛选优化病毒晶体生长条件,为后续病毒疫苗开发及病毒结构功能研究建立基础。方法先利用人胚胎横纹肌肉瘤细胞系(human embryonic rhabdomyosarcoma cell,RD)培养、生产在2010年广西手足口病疫情中分离到的埃可病毒30型毒株;而后使用蔗糖密度梯度离心法分离纯化病毒颗粒;再用透射电镜观察病毒颗粒的形态;最后使用Hampton晶体试剂盒筛选并优化病毒晶体适宜生长条件。结果经透射电镜验证获得完整形态病毒颗粒并在pH4.6的醋酸钠溶液中培养得到高质量的病毒颗粒晶体。结论通过RD细胞培养结合蔗糖密度梯度离心法可获得高纯度病毒颗粒;利用试剂盒筛选可获得高质量的病毒蛋白晶体。 展开更多
关键词 埃可病毒30型 蔗糖密度梯度离心 透射电镜 晶体生长条件筛选
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喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取方法的比较 被引量:1
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作者 梁俊毅 吉晓滨 +1 位作者 刘启才 谢景华 《临床耳鼻咽喉头颈外科杂志》 CAS 北大核心 2015年第17期1522-1526,共5页
目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清... 目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清液,先通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,再利用蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法,将上清液浓缩提纯;收集培养上清液4ml,依次加入ExosomeIsolationKit内试剂,通过exosomes提取专用过滤柱,收集浓缩液。用高倍透射电子显微镜对2种方法所得的exosomes浓缩液分别鉴定,作出评价。结果:2种方法均能成功地从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes。单个高倍视野下,蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法提取exosomes分散性较好,但密度较低,背景见杂质较多;ExosomeIsolationKit所提取exosomes排列紧密,密度较高,背景杂质较少。结论:2种方法各具特点,均是较理想的exosomes分离提取方法。利用ExosomeIsolationKit分离提取exosomes具有样本量少、提取时间短、步骤简单、产物量大等优点,为喉癌Hep-2来源exosomes的分离提取提供了较好的选择。 展开更多
关键词 EXOSOMES 蔗糖密度梯度离心 超滤离心 EXOSOME ISOLATION KIT
喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取和鉴定
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作者 吉晓滨 梁俊毅 +1 位作者 刘启才 谢景华 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2015年第4期170-172,共3页
目的观察喉癌Hep-2细胞能否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定。方法大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清液。通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,利用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度... 目的观察喉癌Hep-2细胞能否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定。方法大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清液。通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,利用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度离心法,将上清液浓缩提纯,透射电镜对exosomes做鉴定。结果成功从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes,电镜下观察exosomes呈圆形或椭圆形双层膜的囊泡状结构,直径约20~100 nm,密度较高,分散均匀。结论较先发现喉癌细胞自身能分泌exosomes,为喉癌免疫治疗做新的探求。 展开更多
关键词 肿瘤 鳞状细胞 细胞 培养的 显微镜检查 电子 透射 蔗糖密度梯度离心 超滤离心
Subcellular Redistribution of Root Aquaporins nduced by Hydrogen Peroxide
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作者 Michael M. Wudick Xiaojuan Li +5 位作者 Valeria Valentini Niko Geldner Joanne Chory Jinxing Lin Christophe Maurel Doan-Trung Luu 《分子植物:英文版》 SCIE CAS CSCD 2015年第7期1103-1114,共12页
Aquaporins 是调停的水隧道蛋白质在开发期间或响应环境压力调整房间膜水渗透。现在的工作集中于血浆膜的氧化导致压力的再分配内在的蛋白质(果仁) aquaporinsfrom 血浆膜(下午) 到细胞内部的膜。这个过程在 Arabidopsis 根被调查。蔗... Aquaporins 是调停的水隧道蛋白质在开发期间或响应环境压力调整房间膜水渗透。现在的工作集中于血浆膜的氧化导致压力的再分配内在的蛋白质(果仁) aquaporinsfrom 血浆膜(下午) 到细胞内部的膜。这个过程在 Arabidopsis 根被调查。蔗糖密度坡度 centrifugation 显示出根的那暴露到 0.5mM H <SUB>2</SUB > O <SUB>2</SUB> 在 15min 以后在几个丰富的果仁相当或相同的事物的下午部分导致重要弄空。由单个粒子的追踪和荧光关联词光谱学的分析显示出那,在表皮的房间的 PM, H <SUB>2</SUB > O <SUB>2</SUB> 处理在 prototypal AtPIP2 的一种荧光灯地标注的形式的密度在侧面的运动和减小导致增加; 1 isoform 分别地。AtPIP2 的合作表示分析; 1 与 endomembrane 标记揭示了那 H <SUB>2</SUB > O <SUB>2</SUB> 扳机 AtPIP2;在迟了的 endosomal 分隔空间的 1 累积。一生分析证实果仁的高稳定性在氧化压力条件下面被维持,建议那 H <SUB>2</SUB > O <SUB>2</SUB> 进一步为下午 aquaporinswithout 的细胞内部的隐遁触发机制降级。除了 aquaporins 的细胞的规定的信息,这研究提供新奇、互补的卓见进动态改变在氧化压力回答期间种内部膜。 展开更多
关键词 水通道蛋白 亚细胞分布 诱导 过氧化氢 蔗糖密度梯度离心 H2O2 荧光标记 氧化应激
蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化 被引量:4
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作者 顾建阳 刘旭光 +9 位作者 郭占龙 孙志伟 杜金东 徐文 孙宇 曹海丹 刘燕 曾亮 王思燕 王亚军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第8期848-851,855共5页
目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量(600、700和800 ml)时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝... 目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量(600、700和800 ml)时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间(2、3和4 h)条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。 展开更多
关键词 流感病毒 蔗糖密度梯度离心 纯化
乙脑病毒猪源分离株CSF.XZ-2D感染BHK-21细胞毒的浓缩及纯化 预览
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作者 滕蔓 冯丽丽 +6 位作者 罗俊 樊剑鸣 王方雨 郅玉宝 李秀杰 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2015年第12期117-120,139共5页
研究了日本流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)猪源分离株CSF.XZ-2D感染的BHK-21细胞培养物中JEV的浓缩及纯化方法,对浓缩及纯化后的病毒TCID_(50)效价分别进行测定。结果表明,经差速离心后病毒液在4℃条件下分别... 研究了日本流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)猪源分离株CSF.XZ-2D感染的BHK-21细胞培养物中JEV的浓缩及纯化方法,对浓缩及纯化后的病毒TCID_(50)效价分别进行测定。结果表明,经差速离心后病毒液在4℃条件下分别以30 000 r/min、40 000 r/min、50 000r/min、60 000 r/min超速离心3 h,其中50 000 r/min超速离心可将绝大部分JEV病毒粒子充分沉淀至离心管底部,浓缩效果最佳;病毒沉淀用PBS重悬后进行不连续蔗糖密度梯度离心,病毒粒子主要集中在35%~50%的区带蔗糖层。 展开更多
关键词 乙脑病毒 BHK-21细胞 蔗糖密度梯度离心 浓缩 纯化
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蓝隐藻叶绿素蛋白复合物的圆二色谱特性 预览 被引量:3
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作者 梁源 陈敏 《烟台大学学报:自然科学与工程版》 CAS 2014年第3期177-183,共7页
采用蔗糖密度梯度离心分离的方法,从蓝隐藻(Chroomonas placoidea)中稳定分离到了4种活性的叶绿素蛋白复合物,分别为2种捕光复合物、1种PSⅡ颗粒和1种PSⅠ颗粒.采用圆二色谱技术对分离到的复合物进行了全波段(190~750 nm)光谱测定,结果... 采用蔗糖密度梯度离心分离的方法,从蓝隐藻(Chroomonas placoidea)中稳定分离到了4种活性的叶绿素蛋白复合物,分别为2种捕光复合物、1种PSⅡ颗粒和1种PSⅠ颗粒.采用圆二色谱技术对分离到的复合物进行了全波段(190~750 nm)光谱测定,结果显示:①远紫外区:二级结构预测表明各复合物的无规卷曲比例相近,约占30%左右;PSⅠ颗粒和1种PSⅡ和捕光复合物含有更高比例的α-螺旋和β-转角,但几乎不存在β-折叠.②近紫外区:在芳香族氨基酸的三级结构信号区,各复合物均未观测到Tyr的信号峰.③可见光区:690 nm附近信号峰的有无是隐藻捕光复合物和中心复合物的一个区别.实验结果不仅给出了隐藻叶绿素蛋白复合物性质的新信息,也为今后叶绿素蛋白复合物的分析和鉴定提供了新的光谱鉴定依据. 展开更多
关键词 蓝隐藻 叶绿素蛋白复合物 蔗糖密度梯度离心 圆二色谱
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PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物的制备及分离纯化
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作者 万瑜 樊戈睿 +1 位作者 郑洁 孙逊 《华西药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期444-446,共3页
目的制备并分离纯化PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。方法采用薄膜分散法制备空白阴离子脂质体,利用钙离子融合法制备阴离子脂质体与腺病毒的复合物,最后用后插入法制备PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。通过蔗糖密度梯度离... 目的制备并分离纯化PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。方法采用薄膜分散法制备空白阴离子脂质体,利用钙离子融合法制备阴离子脂质体与腺病毒的复合物,最后用后插入法制备PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。通过蔗糖密度梯度离心法分离制备的复合物,分别测定分离得到的各组分中脂质体、PEG-脂质材料及腺病毒的含量。结果成功制备了PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物,连接到脂质体上的PEG-脂质占加入总量的28.9%,被脂质体包裹的腺病毒占加入量的35.9%。结论通过蔗糖密度梯度离心可得到纯化的PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。 展开更多
关键词 PEG 腺病毒 阴离子脂质体 蔗糖密度梯度离心
斑点叉尾(鱼回)病毒(CCV)结构蛋白的鉴定 预览
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作者 毕鹏 吴志新 +1 位作者 苏念 李莉娟 《湖北农业科学》 北大核心 2012年第21期4841-4845,共5页
采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一... 采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供了参考。 展开更多
关键词 斑点叉尾病毒(Channel CATFISH virus CCV) 结构蛋白 蔗糖密度梯度离心 质谱
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Filipin对人脐静脉内皮细胞小凹蛋白-1作用的研究 预览
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作者 罗小林 梁霄 +4 位作者 赵慧 王静 吴玲玲 钟华 何芳 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2012年第3期337-339,共3页
为探讨filipin对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中小凹蛋白-1(Cav-1)的亚细胞定位影响,为进一步研究Cav-1作用机制提供理论依据。培养2~4代HUVECs随机分为:对照组;filipin处理组;采用Na_2CO_3蔗糖密度梯度离心法提取HUVECs中含caveola... 为探讨filipin对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中小凹蛋白-1(Cav-1)的亚细胞定位影响,为进一步研究Cav-1作用机制提供理论依据。培养2~4代HUVECs随机分为:对照组;filipin处理组;采用Na_2CO_3蔗糖密度梯度离心法提取HUVECs中含caveolae的膜碎片,Western blot技术鉴定Caveolae和检测Cav-1蛋白表达。结果显示,与Control组比较,filipin处理组caveolae区Cav-1表达减弱(P〈0.05)。由此可知,Cav-1富集于HUVECs的caveolae,filipin可抑制Cav-1在小凹的表达。 展开更多
关键词 小凹蛋白-1 人脐静脉内皮细胞 蔗糖密度梯度离心
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Aggregation Patterns of Proteasome in Injured Neurons Induced by Transient Cerebral Ischemia 预览
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作者 GE Peng-fei LIU Bin +4 位作者 FAN Wen-hai LI Shu-lei YANG Fu-wei LUO Yi-nan ZHANG Ping 《高等学校化学研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2011年第2期 249-253,共5页
Proteasome activity reduction is an important pathological phenomenon, resulting in proteins aggregation and neuronal death in the injured neurons induced by transient ischemia. Our previous report showed that the tra... Proteasome activity reduction is an important pathological phenomenon, resulting in proteins aggregation and neuronal death in the injured neurons induced by transient ischemia. Our previous report showed that the trap of proteasome in the protein aggregates was a reason to lead to the reduction of proteasome activity. However, the patterns of proteasome entered into protein aggregates are not clear. In this study, we used a global ischemia model, Hematoxylin-Eosin staining, differential centrifuge, proteasome activity assay, sucrose gradient density centrifuge, and Western blot analysis to investigate this problem. Our results show that there are two aggregation patterns of proteasome after transient ischemia and reperfusion. One is that 26S proteasome is trapped by protein aggregates as a whole unit, and the other is that 19S or 20S is trapped in the protein aggregates, respectively, after 26S disassociates. 展开更多
关键词 26S蛋白酶体 脑缺血再灌注 神经损伤 神经元 合模 蔗糖密度梯度离心 蛋白质总量 蛋白质聚集
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胰岛素分泌囊泡双层脂膜中胆固醇的可视化与定量研究 预览
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作者 王蓉 牛刚 +1 位作者 张少娟 贺大林 《西安交通大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期共4页
目的 通过菲律宾菌素Ⅲ染色和脂质测定法,对胰岛素分泌囊泡双层脂膜中胆固醇的分布进行可视化与定量研究.方法 利用胆固醇荧光探针菲律宾菌素Ⅲ标记稳定表达phogrin-gfp的min6细胞,对比细胞内游离胆固醇与胰岛素分泌囊泡的分布情况.通... 目的 通过菲律宾菌素Ⅲ染色和脂质测定法,对胰岛素分泌囊泡双层脂膜中胆固醇的分布进行可视化与定量研究.方法 利用胆固醇荧光探针菲律宾菌素Ⅲ标记稳定表达phogrin-gfp的min6细胞,对比细胞内游离胆固醇与胰岛素分泌囊泡的分布情况.通过连续蔗糖密度梯度离心法分离min6细胞中的胰岛素分泌囊泡,应用钼酸铵分光光度法和薄层分析法分别测定生物脂膜中磷脂和游离胆固醇含量,从而得到胆固醇所占比例.结果 min6细胞内菲律宾菌素Ⅲ标记的游离胆固醇与胰岛素分泌囊泡在胞浆中的分布一致,主要聚集在核周及细胞膜下.此外,连续蔗糖密度梯度离心法分离胰岛素分泌囊泡层中富含胆固醇,该层游离胆固醇摩尔百分比为(48.62±3.28)mol%,高于其余各层的细胞器.结论 本研究首次进行了胰岛素分泌囊泡双层脂膜中胆固醇的可视化与定量测定,发现胰岛素分泌囊泡富含胆固醇,为进一步研究胆固醇对胰岛素分泌囊泡形成的影响提供了理论基础和方法学依据. 展开更多
关键词 胰岛素 分泌囊泡 胆固醇 菲律宾菌素Ⅲ 蔗糖密度梯度离心
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登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定 被引量:2
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作者 付春云 方丹云 +4 位作者 刘岩 喻治准 江汉宁 江丽芳 周俊梅 《热带医学杂志》 CAS 2011年第6期613-616,656共5页
目的探讨登革病毒3型病毒样颗粒(DENV3-VLPs)的免疫原性。方法用PCR法扩增登革病毒3型prME基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33。对转化子表达上清和细胞裂解液进行SD... 目的探讨登革病毒3型病毒样颗粒(DENV3-VLPs)的免疫原性。方法用PCR法扩增登革病毒3型prME基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33。对转化子表达上清和细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blotting分析。用蔗糖密度梯度离心纯化表达的DENV3-VLPs并进行鉴定和电镜观察。结果成功构建重组载体pGAPZaA-prME-D3,获得酵母转化子pGAPZaA-prME-D3/X33,并应用毕赤酵母表达了DENV3-VLPs,表达蛋白约50000Mr,电镜观察VLPs直径为20~50nm。结论应用酵母表达系统成功表达了DENV-3VLPs,经鉴定表明其具有免疫反应性,为后续免疫原性研究及四价登革VLPs疫苗的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 登革病毒 病毒样颗粒 蔗糖密度梯度离心 毕赤酵母
Ⅰ型鸭肝炎病毒间接ELISA方法的建立 预览 被引量:4
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作者 孙凤萍 高骏 +2 位作者 胡建华 王胜昌 高诚 《上海农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第4期 70-73,共4页
采用Ⅰ型鸭肝炎病毒通过SPF鸡胚进行病毒培养和增殖,反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法纯化后作为ELISA包被抗原,建立了鸭病毒性肝炎-Ⅰ型病毒全病毒间接ELISA诊断方法。试验表明:此方法具有敏感性高、特异... 采用Ⅰ型鸭肝炎病毒通过SPF鸡胚进行病毒培养和增殖,反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法纯化后作为ELISA包被抗原,建立了鸭病毒性肝炎-Ⅰ型病毒全病毒间接ELISA诊断方法。试验表明:此方法具有敏感性高、特异性好的优点,为快速诊断鸭病毒性肝炎-Ⅰ型病毒感染提供了一条方便的途径。 展开更多
关键词 鸭病毒性肝炎 间接ELISA 蔗糖密度梯度离心
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Plasma membrane proteome analysis of the early effect of alcohol on liver: implications for alcoholic liver disease
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作者 Lijun Zhang Xiaofang Jia +9 位作者 Yanling Feng Xia Peng Zhiyong Zhang Wenjiang Zhou Zhanqing Zhang Fang Ma Xiaohui Liu Ye Zheng Pengyuan Yang Zhenghong Yuan 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2011年第1期19-29,共11页
在人,酒精的在消费上能导致严肃的肝疾病。在肝疾病上检验酒精的早效果,老鼠被给足够的乙醇开发肝肝硬化。在纤维变性的发作前的老鼠在这个工作被学习。肝的血浆膜(下午) 被提取由两次蔗糖密度坡度 centrifugation。从对待乙醇的老鼠... 在人,酒精的在消费上能导致严肃的肝疾病。在肝疾病上检验酒精的早效果,老鼠被给足够的乙醇开发肝肝硬化。在纤维变性的发作前的老鼠在这个工作被学习。肝的血浆膜(下午) 被提取由两次蔗糖密度坡度 centrifugation。从对待乙醇的老鼠和控制的下午的 proteome 侧面为相对、绝对的 quantitation (iTRAQ ) 用二维的胶化电气泳动(2-DE ) 和等压的标签被分析技术。乙醇处理改变了 15 不同的肝蛋白质的数量:他们中的 10 个被 2-DE 检测并且 5 由 iTRAQ。角质素 8 被两个方法检测。这些差别的基因本体论分析检测了显示的蛋白质他们的那个大多数涉及象有约束力的活动那样的重要房间函数(包括离子, DNA, ATP 绑定,等等) ,房间结构,或酶活动。在这些之中, annexin A2,角质素 8,和角质素 18 进一步用西方的污点分析被验证, annexin A2 被 immunohistochemistry 验证。我们的结果建议酒精有潜力由在 PM 改变几相关蛋白质的表示层次影响房间结构,粘附和酶活动。就我们的知识而言,这是第一次在肝下午 proteome 上学习酒精的效果,它可能对理解导致白酒的肝疾病的可能的机制有用。 展开更多
关键词 肝脏疾病 蛋白质组 酒精性 肝病 早期 质膜 蔗糖密度梯度离心 ANNEXIN
小凹蛋白-1和细胞外钙敏感受体在人脐静脉内皮细胞小凹共定位研究 预览 被引量:1
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作者 龚艳 胡清华 +3 位作者 钟华 梁霄 罗小林 何芳 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2011年第3期 305-308,共4页
前期研究发现小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)和细胞外钙敏感受体(extracellular Ca2+-sensing receptor,CaR)在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)膜上有共定位,且Cav-1下调CaR介导的钙内流。本实... 前期研究发现小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)和细胞外钙敏感受体(extracellular Ca2+-sensing receptor,CaR)在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)膜上有共定位,且Cav-1下调CaR介导的钙内流。本实验探讨HUVECs中Cav-1与CaR的亚细胞定位,可为进一步机制研究提供理论依据。以3~4代HU-VECs随机分为2组:(1)对照组;(2)甲基-β-环糊精(MβCD)处理组,分别采用蔗糖密度梯度离心和Western blot技术提取含小凹膜碎片和检测Cav-1和CaR蛋白的表达。结果显示,(1)MβCD处理组HUVECs细胞中Cav-1和CaR蛋白的表达与对照组相比无差异(P〉0.05)。(2)MβCD处理组小凹区Cav-1和CaR蛋白的表达低于对照组(P〈0.05)。由此可知,Cav-1和CaR蛋白共定位于HUVECs的小凹区,MβCD可抑制两者在小凹的共定位。 展开更多
关键词 蔗糖密度梯度离心 甲基-β-环糊精 小凹蛋白-1 细胞外钙敏感受体
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基因芯片检测5种动物冠状病毒的初步研究 被引量:1
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作者 李健 谢爱织 +5 位作者 陈沁 王巧全 熊炜 张建武 王权 胡永强 《畜牧与兽医》 北大核心 2010年第12期共6页
采用蔗糖密度梯度离心,纯化浓缩犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的细胞培养物,分别设计7,17,11,10和4对引物,构建了49个基因片段的克隆.煮沸裂解法制... 采用蔗糖密度梯度离心,纯化浓缩犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的细胞培养物,分别设计7,17,11,10和4对引物,构建了49个基因片段的克隆.煮沸裂解法制备质粒DNA,回收PCR扩增产物,点制冠状病毒基因芯片.抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗人反转录PCR标记,与芯片进行杂交检测,淘汰交叉的克隆片段.结果表明:克隆CCV1,CCV2,CCV5和CCV7可特异诊断CCV,克隆FCV6,FCV7,FCV8和FCV9可特异诊断FCV,克隆FIPV2,FIPV7,FIPV8和FIPV9可特异诊断FIPV,克隆PRCV1,PRCV2和PRCV3可特异诊断PRCV,克隆TGEV3,TGEV4,TGEV5和TGEV6可特异诊断TGEV.将这些特异克降扩增片段重新点制基因芯片,与病毒PCR产物杂交,未发现交叉现象.基因芯片检测比传统PCR敏感1 000倍,可有效应用于这5种动物冠状病毒的检测与区分. 展开更多
关键词 基因芯片检测 动物冠状病毒 初步研究 GENECHIP 特异诊断 克隆 猪传染性胃肠炎病毒 猪呼吸道冠状病毒 蔗糖密度梯度离心 猫传染性腹膜炎 扩增片段 PCR扩增产物 细胞培养物 犬冠状病毒 杂交检测 交叉现象 基因片段 纯化浓缩 TGEV PCR产物
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