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基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控 预览
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作者 王志远 刘月环 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第11期78-84,共7页
目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-... 目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。 展开更多
关键词 非酒精性脂肪性肝病模型 长爪沙鼠 Cip4基因 荧光素酶报告基因系统 维甲酸X受体(RXR) 甲状腺受体B(TRB)
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用于细胞水平家蚕转录调控元件研究的简单基础启动子的构建 预览
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作者 顾健健 刘红玲 +7 位作者 李凯荣 孟紫旺 王慧娟 沈关望 张宇靖 阮杨 林英 夏庆友 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期391-397,共7页
【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的... 【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2Element,BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。 展开更多
关键词 家蚕 细胞 简单基础启动子 荧光素酶报告基因系统 转录调控 转录元件
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基于雌激素受体调节Nrf2-ARE通路的黄芩中抗氧化成分的筛选 预览
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作者 刘媛媛 刘陶 +4 位作者 吴玉梅 张晗 赵鑫 刘志东 李楠 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-827,共6页
目的 建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性... 目的 建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性成分和(或)雌激素受体(ER)特异性抑制剂加入Nrf2-ARE双荧光素酶报告基因系统,检测其是否通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。将筛选出的成分和(或)ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂加入HaCaT细胞中,验证是否通过ER影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。结果 黄芩苷(100 μmol·L ^-1 )可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路,诱导表达倍数为空白组的(1.56±0.01)倍( P <0.01)。预给予ER抑制剂后,诱导表达倍数下降至(1.02±0.23)倍,抗氧化作用消失。分别预给予ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂后,黄芩苷干预UVB损伤的HaCaT细胞中的ROS值明显上升,SOD值明显下降。结论 黄芩苷可以通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。 展开更多
关键词 黄芩 抗氧化 Nrf2-ARE通路 植物雌激受体 荧光素酶报告基因系统 黄芩苷
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miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子基因表达的靶向调控作用 预览
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作者 余丹纯 聂玉强 +1 位作者 黄耀星 孙小娟 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2019年第1期48-51,共4页
目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCA... 目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCAM mRNA的表达情况,确定实验细胞株;通过PCR扩增合成含有miR-9结合位点的ALCAM mRNA 3′端非编码区(ALCAM 3′UTR)片段和在miR-9结合位点进行突变的ALCAM-mut mRNA 3′UTR,测序鉴定后将其克隆至报告基因载体psiCHECK-2质粒,分别命名为psiCHECK-2-ALCAM和psiCHECK-2-ALCAM-mut;分组转染重组质粒和miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达,SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting检测ALCAM mRNA及蛋白表达水平。结果生物信息学分析筛选发现miR-9可能靶向调控ALCAM;ALCAM mRNA在各胃癌细胞株中的表达量明显高于人正常胃黏膜GES-1细胞株,且SGC-7901细胞株ALCAM mRNA的表达量最高(P<0.05),确定为实验细胞株;测序验证ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR经PCR扩增合成成功;psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-9 mimics细胞组的相对荧光素酶活性较psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-NC、miR-9 inhibitor细胞组或空白对照组明显降低(P<0.05),且该组细胞ALCAM mRNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05);而psiCHECK-2-ALCAM-mut质粒共转染miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor细胞组的相对荧光素酶活性与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在SGC-7901中,miR-9通过与ALCAM mRNA 3′UTR结合而负性调控ALCAM基因的表达。 展开更多
关键词 胃癌 荧光素酶报告基因系统 逆转录聚合链反应 蛋白质印迹法 MIR-9 活化白细胞黏附分子
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一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建(英文) 被引量:1
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作者 刘红玲 林英 +6 位作者 沈关望 顾健健 张海燕 吴金鑫 徐银莹 龙威 夏庆友 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1631-1641,共11页
双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒... 双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。 展开更多
关键词 家蚕 荧光素酶报告基因系统 内参质粒 方法
miR-181b-5p调控TIMP3对apoE^-/-鼠动脉粥样硬化炎症影响及相关因子检验
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作者 郑莉 谭成宇 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2018年第5期2200-2206,共7页
为探究mi R-181b-5p靶向调控TIMP3对apo E^-/-鼠动脉粥样硬化炎症的影响,本研究基于生物信息学预测筛选,并采用双荧光素酶报告基因系统验证mi R-181b-5p靶基因。同时在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E^-/-动脉粥样硬化模型小鼠中检测mi ... 为探究mi R-181b-5p靶向调控TIMP3对apo E^-/-鼠动脉粥样硬化炎症的影响,本研究基于生物信息学预测筛选,并采用双荧光素酶报告基因系统验证mi R-181b-5p靶基因。同时在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E^-/-动脉粥样硬化模型小鼠中检测mi R-181b-5p靶基因m RNA及蛋白水平的表达情况,并且检测转染mi R-181b-5p后细胞水平和动物体内炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达变化。此外,通过病理切片方法检测转染mi R-181b-5p后小鼠主动脉窦处病变情况。研究通过双荧光素酶报告基因系统验证TIMP3为mi R-181b-5p靶基因,并在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E^-/-动脉粥样硬化模型小鼠中证明了mi R-181b-5p可以降低TIMP3转录水平从而降低其蛋白水平表达,同时研究发现mi R-181b-5p在细胞水平和动物体内均会增强炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达,并可以增加小鼠主动脉窦处病变面积。研究认为在动脉粥样硬化发生中,mi R-181b-5p可以增加病变面积并且提升相关炎症因子的表达、分泌,其作用机理很可能是通过抑制靶基因TIMP3表达,进而降低TIMP3蛋白水平实现的,为研究动脉粥样硬化机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 荧光素酶报告基因系统 动脉粥样硬化 miR-181b-5p TIMP3
miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化
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作者 李登 沙明磊 +2 位作者 陈磊 赵圣 邵怡 《现代生物医学进展》 CAS 2018年第17期3201-3208,共8页
目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变... 目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P〈0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。 展开更多
关键词 miR-203 RAW264.7 荧光素酶报告基因系统 巨噬细胞极化 TLR4-Myd88-NF-κB
ABCG1基因多态对转录活性及冠心病易感性的影响
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作者 马秋洁 刘本荣 +1 位作者 田朝伟 陈晓辉 《中华急诊医学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期685-692,共8页
目的探讨三磷酸腺苷结合盒子转运体G1 (ATP binding cassette transporter,ABCG1)启动子多态性对其转录活性的影响及其与冠心病(coronary atherosclerotic disease,CAD)易感性的关系。方法采用病例对照研究,对217例CAD患者和142... 目的探讨三磷酸腺苷结合盒子转运体G1 (ATP binding cassette transporter,ABCG1)启动子多态性对其转录活性的影响及其与冠心病(coronary atherosclerotic disease,CAD)易感性的关系。方法采用病例对照研究,对217例CAD患者和142例对照者的ABCG1近端启动子区转录启始位点上游约1 000 bp核苷酸序列进行测序分析,分析CAD组和对照组、早发冠心病组和非早发冠心病组、多支病变组和单支病变组间单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和单倍型的频率分布差异。采用等位基因特异引物测序或基因克隆测序鉴定启动子单倍型,选用双荧光素酶报告基因系统检测不同单倍型转录活性的差异。两组间的频率分布比较采用χ2检验或Fisher精确检验,组间荧光素酶活性差异比较采用成组t检验或单因素方差分析。结果在约1 000 bp启动子序列中发现3个SNPs[ -384(A/G)、-204(A/C)和-134(T/G)],可形成ACG、GAT和GCG 3种单倍型,3个SNPs间强连锁不平衡,Tajima’s D=2.655(P〈0.01)。3个SNPs频率和单倍型频率在CAD组和对照组间无统计学意义,与冠状动脉血管病变严重程度和早发冠心病无显著相关性。3种启动子单倍型的转录活性比较无统计学意义,但将GAT突变为GAG后,转录活性明显增强(P〈0.05)。结论ABCG1启动子A区的3个SNPs组成的3种单倍型对启动子活性无影响,该区域的SNPs及其组成的单倍型的频率分布与CAD的易感性无显著性相关。 展开更多
关键词 冠心病 三磷酸腺苷结合盒转运体G1 启动子 单核苷酸多态性 单倍型 连锁 不平衡 基因克隆 荧光素酶报告基因系统
MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响 预览 被引量:2
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作者 邱进 刘辉 +5 位作者 热孜宛古丽·伊敏 袁芳 许瑞 马玲 霍强 周勇 《新疆医科大学学报》 CAS 2017年第5期606-611,616共7页
目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939-+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧... 目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939-+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C〉T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P〈0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356--108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1� 展开更多
关键词 肌细胞增强因子2 启动子突变 单纯性先天性心脏病 荧光素酶报告基因系统 维吾尔族人群
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Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用 被引量:1
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作者 钱平 蒋涛 +5 位作者 王欣 宋菲 陈晨 范洋洋 唐顺明 沈兴家 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期826-831,共6页
微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21... 微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P〈0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。 展开更多
关键词 家蚕 丝胶蛋白基因Ser-1 微小RNA Bmo-miR-2771 转录后调控 半定量RT-PCR 荧光素酶报告基因系统
靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定 预览 被引量:2
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作者 戴丽荷 褚晓红 +2 位作者 路伏增 黄孙平 徐如海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1281-1289,共9页
本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序... 本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。 展开更多
关键词 ATGL基因 MIRNA 荧光素酶报告基因系统 3′UTR
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人MicroRNA335的预测靶基因CCL11 CCL26及SOX4的鉴定 预览 被引量:1
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作者 温志红 代艳 何爽 《重庆医学》 CAS 北大核心 2015年第24期3316-3318,共3页
目的验证人MicroRNA335(hsa-miR-335)与嗜酸细胞趋化因子1(CCL11)、嗜酸细胞趋化因子3(CCL26)、SOX4的靶向调控关系。方法选择网络在线的生物信息学软件miRanda和TargetScan共同预测为hsa-miR-335靶基因的CCL11、CCL26、SOX4作为... 目的验证人MicroRNA335(hsa-miR-335)与嗜酸细胞趋化因子1(CCL11)、嗜酸细胞趋化因子3(CCL26)、SOX4的靶向调控关系。方法选择网络在线的生物信息学软件miRanda和TargetScan共同预测为hsa-miR-335靶基因的CCL11、CCL26、SOX4作为研究对象。构建CCL11、CCL26、SOX4基因3′端非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT-CCL11 3′UTR、pMIR-REPORT-CCL26 3′UTR、pMIR-REPORT-SOX4 3′UTR;采用Lipofectamine 2000将真核表达质粒pMIR-REPORT-CCL11 3′UTR、pMIR-REPORT-CCL26 3′UTR、pMIR-REPORT-SOX4 3′UTR、阳性对照质粒分别与Pre-miRTM miRNA335Precursor或阴性对照质粒共转染到293T7/17细胞;双荧光素酶报告基因检测系统检测CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR与Hsa-mir-335共转染萤火虫(Firefly)和海洋腔肠(Renilla)荧光素酶活性,并与阴性对照对比。结果hsa-miR-335对SOX4的荧光表达有显著的抑制作用(P〈0.01),但并不影响CCL11、CCL26荧光素酶活性(P〉0.05)。结论 hsa-miR-335可靶向调控SOX4,而对CCL11、CCL26的表达无影响。 展开更多
关键词 微RNAS hsa-miR-335 基因 基因调控 CCL11 CCL26 SOX4 荧光素酶报告基因检测系统
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CYP3A4*1G基因多态性及功能的初步探讨 预览 被引量:1
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作者 贺宝霞 赵秀莉 +1 位作者 石磊 赵树进 《河南医学研究》 CAS 2014年第7期4-7,共4页
采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4* 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4* 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显... 采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4* 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4* 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G(P=0.022< 0.05). CYP3A4* 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性. 展开更多
关键词 细胞色P4503A4 基因多态性 荧光素酶报告基因系统
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腺苷酸环化酶激活剂调控FMR1基因启动子活性及作用位点CRE的鉴定
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作者 陈瑶 秀芳 +1 位作者 张红琴 姚英民 《中国优生与遗传杂志》 2014年第12期12-13,20共3页
目的本研究试图证明,特异性腺苷酸环化酶激活剂forskolin(FSK)可以通过调控FMRl启动子区内的MSE/CRE位点而再激活封闭的FMRl基因。方法拟以FMRl启动子MSE/CRE位点为研究对象,在不改变MSE的整体结构功能的情况下,运用分子生物学... 目的本研究试图证明,特异性腺苷酸环化酶激活剂forskolin(FSK)可以通过调控FMRl启动子区内的MSE/CRE位点而再激活封闭的FMRl基因。方法拟以FMRl启动子MSE/CRE位点为研究对象,在不改变MSE的整体结构功能的情况下,运用分子生物学方法诱导CRE位点突变,达到其'~CRE功能目的,从而建立正常MsE以及两种CRE突变启动子M1、M2双荧光素酶报告基因系统,比较CRE在正常或灭活情况下,FSK药物对FMRl诱导效果的影响。结果成功构建FMRl启动子区MSE/CRE位点双荧光素酶报告基因系统,结果显示当CRE位点正常时,FSK对活性低下的FMRl启动子有显著地激活作用,而当CRE位点突变之后,FSK则无此作用,由此证实CRE位点是FSK重启FMRl基因的关键位点。结论提示腺苷酸环化酶激活剂FSK可能主要是通过FMRl启动子区内的MSE/CRE重叠位点,经cAMP通路实现了对FMRl基因的调控。 展开更多
关键词 脆性X智力低下一号基因(FMR1) 荧光素酶报告基因系统 AC激动剂 MSE/CRE
DNMT3BmRNA3′非编码区报告基因载体的构建与功能验证 预览
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作者 曹成建 杨晓玲 +5 位作者 王磊 杨程 蔡欣 徐华 王洁 姜怡邓 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第13期1587-1590,共4页
目的:构建用于鉴定microRNA(miRNA)靶基因的报告基因系统并进行功能验证,为研究动脉粥样硬化的发生发展机制奠定良好基础。方法在pGL3-control载体的荧光素酶基因下游克隆位点插入DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)3′非编码区序列,经酶... 目的:构建用于鉴定microRNA(miRNA)靶基因的报告基因系统并进行功能验证,为研究动脉粥样硬化的发生发展机制奠定良好基础。方法在pGL3-control载体的荧光素酶基因下游克隆位点插入DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)3′非编码区序列,经酶切、测序验证是否插入及正确性。生物信息学分析 DNMT3B与 miRNA-125b的靶向关系,并用 miRNA-125b过表达载体与所构建载体共转染人血管平滑肌细胞,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了DNMT3 B 3′非编码区报告基因载体,经酶切和测序鉴定正确;共转染细胞24 h后,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性,结果显示与空载体对照组相比,构建载体组荧光素酶活性下降了54.8%(P<0.01)。结论成功构建了DNMT3B mRNA 3′非编码区报告基因载体,且提示miRNA-125b靶向调控了DNMT3B。 展开更多
关键词 DNA甲基转移3B 微RNAS 动脉粥样硬化 表遗传学 荧光素酶报告基因系统
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小鼠miR-151-3p靶基因筛选和鉴定 预览 被引量:1
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作者 魏欢 李仲文 沈清武 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第5期23-31,共9页
采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖... 采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖性钙通道α1g亚基(calcium channel,voltage-dependent,T type,alpha 1g subunit,Cacna1g)。采用实时定量PCR及双荧光素酶报告基因检测技术对以上靶基因进行初步验证,结果表明,超表达miR-151-3p显著抑制Akt 3mRNA表达,而Twist 1和Cacna1g mRNA表达变化不显著;双荧光素酶报告系统分析发现,miR-151-3p显著抑制野生型Akt 3报告载体相对荧光素酶活性,突变Akt 3 3′UTR与miR-151-3p结合的位点后,相对荧光素酶活性得到恢复,而Twist 1和Cacna1g基因双荧光素酶报告载体无此现象,结果证实Akt 3是miR-151-3p的靶基因。 展开更多
关键词 miR-151-3p 基因 荧光素酶报告基因检测系统
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miR-191通过调控C/EBPβ转录影响猪前体脂肪细胞分化 被引量:3
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作者 刘帅 宁小敏 +4 位作者 李美航 仇杨 李艳杰 董培越 杨公社 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2013年第2期165-176,共12页
对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方... 对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方法,初步研究miR-191对猪前体脂肪细胞分化的影响.结果发现,miR-191随着猪前体脂肪细胞的分化表达量逐渐增加.与对照组相比,过表达miR-191的猪前体脂肪细胞中miR-191转录本显著增加,并引起CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、PPARγ和aP2的mRNA水平降低,抑制了猪前体脂肪细胞分化.同时,Western blot结果显示,与对照组相比过表达miR-191的猪前体脂肪细胞在48 h C/EBPβ蛋白水平下降了55%.更重要的是,通过TargetScan等算法正向筛选以及MicroInspector反向筛选联合获得miR-191候选靶基因,经双荧光素酶报告基因检测结果证实,miR-191可直接作用于C/EBPβ3′UTR,从而降低萤火虫荧光素酶活性.综上所述,miR-191可能通过抑制脂肪细胞分化早期标志基因C/EBPβ的表达,从而抑制了猪前体脂肪细胞的分化. 展开更多
关键词 miR-191 C EBPβ 猪前体脂肪细胞 表达谱 基因预测 腺病毒 荧光素酶报告基因检测系统
SV40增强子对奶牛β-酪蛋白启动子活性的影响
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作者 钟宇 邵正 江黎明 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期175-179,187共6页
该文采用重叠PCR方法在奶牛B.酪蛋白启动子(op0)中插.SV40增强子构建重组启动子op0-SV40enh,并分析其活性。首先PCR扩增op05’端2.1Kb片段、op03.端1Kb片段和SV40增强子序列,重叠PCT接三种片段得到插A.SV40增强子的op0-SV40en... 该文采用重叠PCR方法在奶牛B.酪蛋白启动子(op0)中插.SV40增强子构建重组启动子op0-SV40enh,并分析其活性。首先PCR扩增op05’端2.1Kb片段、op03.端1Kb片段和SV40增强子序列,重叠PCT接三种片段得到插A.SV40增强子的op0-SV40enh启动子并测序鉴定后,酶切连接将其插入GL3.Basic中的指定克隆位点,构建重组载体pGL3-op0-SV40enh。将重组载体pGL3-op0和pGL3.op0-SV40enh分别瞬时转染乳腺癌MCF.7细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子op0和op0-SV40enh的相对活性。结果显示,重叠PCR拼接出长度为3.4Kb的片段,测序结果与预期结果-致,表明成功构建了重组载体pGL3.op0-SV40enh;op0.SV40enh启动子的活性远高于op0启动子的活性,表明奶牛β-酪蛋白启动子中插入SV40增强子序列可显著提高其引导荧光素酶报告基因表达的活性。 展开更多
关键词 SV40增强子 奶牛op0 荧光素酶报告基因检测系统
Let-7对施万细胞凋亡的调节作用 预览
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作者 李石营 陈褚 +3 位作者 王星辉 刘倩倩 冯倩 顾晓松 《交通医学》 2012年第6期515-517,522共4页
目的:探讨Let-7对施万细胞凋亡的调控作用及其发挥作用的靶基因。方法:采用AnnexinV/PI双染色法检测Let-7对2O2刺激的原代培养的施万细胞凋亡的调控作用,双荧光素酶报告基因系统检测Let-7对白介素10的3’UTR的直接靶向作用。结果:L... 目的:探讨Let-7对施万细胞凋亡的调控作用及其发挥作用的靶基因。方法:采用AnnexinV/PI双染色法检测Let-7对2O2刺激的原代培养的施万细胞凋亡的调控作用,双荧光素酶报告基因系统检测Let-7对白介素10的3’UTR的直接靶向作用。结果:Let-7能够抑制H2O2刺激的原代培养的施万细胞的凋亡,并可直接作用于白介素10基因的3’UTR。结论:Let-7可以直接靶向IL10的3’UTR,从而通过下调靶基因IL10的表达调控施万细胞的凋亡。 展开更多
关键词 LET-7 微型核糖核酸 白介10 施万细胞 凋亡 染色法 荧光素酶报告基因系统
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Trim6结合并降解接头蛋白TAB2抑制NF-κB活化 被引量:1
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作者 孙大康 安新业 +2 位作者 周荣佼 赵延婷 宋向芹 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期 131-134,共4页
观察Trim6是否与接头蛋白TAB2存在蛋白相互作用,进而影响TAB2介导的NF-κB荧光素酶报告基因的活化。在HEK293T细胞中共转染Trim6及TAB2的真核表达载体,免疫共沉淀法验证两者是否存在蛋白相互作用;用蛋白印迹法验证Trim6是否能降解TAB... 观察Trim6是否与接头蛋白TAB2存在蛋白相互作用,进而影响TAB2介导的NF-κB荧光素酶报告基因的活化。在HEK293T细胞中共转染Trim6及TAB2的真核表达载体,免疫共沉淀法验证两者是否存在蛋白相互作用;用蛋白印迹法验证Trim6是否能降解TAB2;同时用双荧光索酶报告基因系统检测Trim6是否影响TAB2介导的NF-κB荧光素酶报告基因活化。免疫共沉淀结果证明Trim6与TAB2存在蛋白相互作用;蛋白印迹检测发现Trim6能显著降解TAB2,进而明显抑制TAB2介导的NFKB荧光素酶报告基因的活化。 展开更多
关键词 Trim6 TAB2 蛋白相互作用 荧光素酶报告基因系统
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