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腺相关病毒的生产方式及其在基因治疗中的应用 预览
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作者 杜梦潭 刘兴健 +2 位作者 胡小元 张志芳 李轶女 《生物技术进展》 2019年第4期326-331,共6页
随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相... 随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相关病毒载体的药品得到批准且效果显著,但由于大规模生产技术的缺乏限制了重组腺相关病毒载体的研究和广泛应用。就腺相关病毒的结构和功能、载体的生产方式及其现阶段在基因治疗中的应用进行了综述,以期为今后以腺相关病毒为载体的基因治疗大规模应用于市场提供参考。 展开更多
关键词 相关病毒 基因治疗 杆状病毒表达系统 脂蛋白脂肪酶缺乏症 人类视网膜疾病
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AAV介导的EPO基因下调对CNV的抑制作用
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作者 王艺晓 姚腾腾 +3 位作者 童尧 周雅丽 杨源 汪朝阳 《中华眼视光学与视觉科学杂志》 CAS CSCD 2019年第9期641-647,共7页
目的:研究腺相关病毒(AAV)介导的促红细胞生成素(EPO)shRNA靶向视网膜色素上皮(RPE)的EPO表达水平下调对脉络膜新生血管(CNV)进展的影响,以期发现潜在的湿性年龄相关性黄斑变性(nAMD)的治疗靶点。方法:实验研究。在HEK293T细胞内对包含E... 目的:研究腺相关病毒(AAV)介导的促红细胞生成素(EPO)shRNA靶向视网膜色素上皮(RPE)的EPO表达水平下调对脉络膜新生血管(CNV)进展的影响,以期发现潜在的湿性年龄相关性黄斑变性(nAMD)的治疗靶点。方法:实验研究。在HEK293T细胞内对包含EPOshRNA片段的AAV质粒进行验证(采用Student'st检验)。选用2个月龄C57/B6J小鼠10只,右眼作为实验组,视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP-EPO-shRNA;左眼作为对照组,视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP。注射后3周,进行激光诱导的CNV造模,造模后拍摄眼底照片确认病毒转染及造模情况,造模后15dRPE铺片以测算CNV面积大小,并用Student'st检验方法进行组间比较。结果:EPOshRNA在HEK293T细胞内对EPO表达的下调效率为69.6%,且与对照组相比差异具有统计学意义(t=6.080,P=0.022)。眼底照片显示,注射了AAV的小鼠造模成功;视网膜有点状的绿色荧光蛋白表达,证实病毒转染成功。造模后15d,RPE铺片显示实验组的平均CNV面积与对照组相比小44.7%(t=4.279,P=0.001)。结论:AAV介导的EPOshRNA对CNV的发生和发展起到显著的抑制作用,在未来可能作为nAMD的新治疗方法。 展开更多
关键词 相关病毒 脉络膜新生血管 促红细胞生成素 年龄相关性黄斑变性
miR-133a-3p重组腺相关病毒的构建及抑制LX-2细胞α-SMA基因表达
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作者 李亮 张传山 +4 位作者 毕晓娟 马洋洋 王慧 吐尔干艾力·阿吉 林仁勇 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第6期625-628,共4页
目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,... 目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,应用qRT-PCR法检测miR-133a-3p转染表达量,检测胶原蛋白(COL1A1)、-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β/Smad信号通路基因的表达量。结果重组腺相关病毒成功构建并转染LX-2细胞,AAV8-miR-133a-3p转染LX-2细胞组的miR-133a-3p相对表达量为11 000±343.10,与DMEM对照组比较差异有统计学意义(t=32.07,P<0.01)。AAV8-miR-133a-3p转染组与DMEM组α-SMA mRNA的相对表达量分别为0.42±0.06 vs 1.00±0.09(t=5.72,P<0.05),COL1A1 mRNA的相对表达量为0.34±0.03 vs 1.00±0.04(t=12.66,P<0.01)。结论重组腺相关病毒成功转染LX-2细胞,且能抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA的表达,为探讨miR-133a-3p在调控肝星状细胞所致纤维化中的作用奠定了理论基础。 展开更多
关键词 相关病毒 肝星状细胞 miR-133a-3p
腺相关病毒介导的小鼠发育期大脑中的特定细胞和特定脑区的基因编辑及潜在应用探索 预览
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作者 周斌 胡镐申 +2 位作者 陈玲敏 王婷 蒋若天 《临床和实验医学杂志》 2019年第3期225-229,共5页
目的探索腺相关病毒(AAV)用于发育期星形胶质细胞的高分辨稀疏标记以及在皮质和海马中的区域性标记的可能性。方法 在成年小鼠海马立体定位注射携带有绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV5、AAV8和AAV9,比较感染效率。然后,立体定位注射AAV5和AAV9... 目的探索腺相关病毒(AAV)用于发育期星形胶质细胞的高分辨稀疏标记以及在皮质和海马中的区域性标记的可能性。方法 在成年小鼠海马立体定位注射携带有绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV5、AAV8和AAV9,比较感染效率。然后,立体定位注射AAV5和AAV9至新生小鼠大脑皮质和海马,观察稀疏细胞标记和区域性标记的标记效果。结果 三种血清型AAV的感染效率依次为AAV8 >AAV9 >AAV5,AAV5及AAV8分别对星形胶质细胞和神经元具有较高亲嗜性。AAV5注射至P0小鼠皮质,在P9时即可实现稀疏标记,且标记信号强度高,高分辨激光共聚焦显微镜下3D扫描后适用于星形胶质细胞的形态3D重建和量化分析。通过对P0小鼠的立体定位注射,还实现了发育期小鼠皮质和海马的区域性基因转导。结论 根据感染效率和细胞亲嗜性选择AAV血清型,通过立体定位注射,能够实现发育期小鼠特定细胞类型和脑区的高效基因转导。上述结果有助于扩展AAV在中枢系统发育和相关疾病中的应用范畴。 展开更多
关键词 小鼠 发育期大脑 相关病毒 亲嗜性 稀疏标记 区域性
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Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶提高静脉桥血管腺相关病毒感染效率的研究 预览
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作者 李送 钟昌明 +5 位作者 王小文 张诚 冯波 谢晓 黄春 向小勇 《上海交通大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期730-736,共7页
目的·探讨应用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶是否可以有效提高静脉桥血管中腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的感染效率。方法·构建大鼠静脉桥血管再狭窄模型。用编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescen... 目的·探讨应用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶是否可以有效提高静脉桥血管中腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的感染效率。方法·构建大鼠静脉桥血管再狭窄模型。用编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,Egfp)报告基因的重组AAV(AAV1、AAV6、AAV8、AAV9血清型)感染静脉桥血管,并使用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶增加病毒接触时间和改善血管壁通透性。分别在术后21d采集标本,应用冰冻切片、免疫组织化学染色和定量反转录PCR检测静脉桥血管中EGFP的表达以明确感染效率。通过测量组织拉伸强度来评估组织的结构完整性。结果·Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶能够显著提高静脉桥血管中AAV的感染效率,但并不影响静脉桥血管的组织抗拉性,且AAV6血清型相比AAV1、AAV8、AAV9血清型感染静脉桥血管的效率更高。结论·Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶涂染是一种提高静脉桥血管AAV感染效率安全有效的方法,可用于静脉桥血管再狭窄的防治研究。 展开更多
关键词 基因治疗 相关病毒 PLURONIC F-127 静脉桥血管 再狭窄
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携带小鼠白介素-4截短型突变体基因的5型腺相关病毒载体的构建及外源蛋白的体外表达
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作者 田丽春 朱情情 +2 位作者 刘艾洁 王青青 黄光瑞 《现代生物医学进展》 CAS 2019年第2期211-216,共6页
目的:制备携带碳端结构域缺失的小鼠白介素-4(Interleukin-4,IL-4)基因突变体的5型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, r AAV)并在细胞水平检测其介导的外源蛋白表达情况。方法:通过分子克隆技术构建携带小鼠IL-4碳端2... 目的:制备携带碳端结构域缺失的小鼠白介素-4(Interleukin-4,IL-4)基因突变体的5型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, r AAV)并在细胞水平检测其介导的外源蛋白表达情况。方法:通过分子克隆技术构建携带小鼠IL-4碳端22个氨基酸缺失的突变体的表达质粒pSNAV-mIL-4ΔC22,三质粒共转染法制备重组的5型AAV病毒,体外感染人支气管上皮样细胞系16HBE和BEAS-2B,并通过Western blot和ELISA检测外源蛋白表达。结果:DNA测序表明构建的小鼠IL-4碳端第118位氨基酸位点处截短的突变体基因表达序列正确无误,制备的重组病毒载体r AAV5-mIL-4ΔC22滴度约为3×1011vg/m L。r AAV5-GFP感染16HBE和BEAS-2B细胞后36小时开始可见持续稳定的荧光蛋白表达,重组病毒r AAV5-mIL-4ΔC22感染16HBE和BEAS-2B细胞后外源蛋白在培养上清中呈分泌型表达。结论:本研究成功构建了携带小鼠IL-4碳端结构域缺失型突变体的AAV表达质粒并制备了重组病毒r AAV5-mIL-4ΔC22,该病毒可有效转染16HBE和BEAS-2B细胞并介导外源基因分泌表达截短型小鼠IL-4突变体蛋白。 展开更多
关键词 白介素-4 突变体 相关病毒 基因治疗
经圆窗膜鼓阶显微注射腺相关病毒转染小鼠耳蜗的研究 预览
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作者 陈嘉伟 王卫龙 +4 位作者 丁雪瑞 赵倩倩 安晓刚 王人凤 卢连军 《听力学及言语疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期301-305,共5页
目的 探讨经圆窗膜鼓阶显微注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒AAV2/9-GFP转染小鼠耳蜗的可行性,为应用腺相关病毒治疗遗传性聋提供实验基础。方法 将24只野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组:实验组(12只)和人工外淋巴液组(6只)分... 目的 探讨经圆窗膜鼓阶显微注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒AAV2/9-GFP转染小鼠耳蜗的可行性,为应用腺相关病毒治疗遗传性聋提供实验基础。方法 将24只野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组:实验组(12只)和人工外淋巴液组(6只)分别经耳后径路通过圆窗膜向鼓阶内注射2 μl AAV2/9-GFP或人工外淋巴液;空白对照组(6只)正常饲养,不做任何处理。于术后21 d进行ABR测试,之后取耳蜗基底膜行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果 术后实验组和人工外淋巴液组术侧耳ABR各频率反应阈均不同程度升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义( P < 0.05 ),实验组与人工外淋巴液组比较差异无统计学意义( P > 0.05 )。实验组转染AAV2/9-GFP后可见基底膜底回至顶回均有GFP表达,转染阳性细胞呈逐渐减少的趋势,底回、中回及顶回的内毛细胞平均转染效率分别为 82.7%、 75.0%、 44.7%,底回与顶回、中回与顶回转染效率比较差异均有统计学意义( P < 0.05 ),底回与中回比较差异无统计学意义( P > 0.05 )。AAV2/9-GFP主要转染内毛细胞,外毛细胞未见GFP表达;实验组对侧耳、人工外淋巴液组及空白对照组均未见GFP表达。结论 携带目的基因的腺相关病毒载体可通过经圆窗膜鼓阶显微注射的方法转染至小鼠耳蜗内毛细胞并表达。 展开更多
关键词 基因转染 圆窗膜 相关病毒 小鼠 绿色荧光蛋白
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腺相关病毒介导shRNA敲减小鼠海马兴奋性氨基酸转运体3动物模型的构建 预览
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作者 侯爱生 王晓燕 +5 位作者 武屹爽 曹福羊 刘蔷薇 张璇 沈浩 曹江北 《解放军医学院学报》 CAS 2019年第5期473-477,481共6页
目的构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型。方法基于SLC1A1(solute carrierfamil... 目的构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型。方法基于SLC1A1(solute carrierfamily 1 member 1)基因mRNA 序列设计4条shRNA(short hairpin RNA),将其模板DNA与酶切后的AAV-GP-1(pAAV-U6-EGFP)载体质粒连接、转化并测序鉴定得到重组质粒,将重组质粒、pHelper包装质粒和pAAV-DJ辅助质粒共同转染至AAV-293细胞包装得到rAAV;用所得rAAV侵染HT-22细胞,72h后RT-qPCR检测SLC1A1mRNA表达水平;36只成年C57小鼠随机分为6组,每组6只,予海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP病毒液1μL/侧,分别于注射后即刻、24h、7d、14d、21d、28d取双侧海马组织,Westernblot检测EAAT3表达水平。结果经测序重组质粒核苷酸序列正确,包装所得病毒浓缩滴度为1×1013TU/ml;rAAV感染HT-22细胞72h后SLC1A1表达量明显降低且显著低于阴性对照(P<0.01,n=3);小鼠海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP7d后EAAT3相对表达量下降(P<0.01),注射后21d、28d表达进一步降低(P<0.01)。结论成功构建介导shRNA表达的重组腺相关病毒系统,建立了一种有效的小鼠海马EAAT3敲减动物模型。 展开更多
关键词 相关病毒 兴奋性氨基酸转运体3 短发卡RNA 小鼠 海马
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可见光起搏心脏的在体实验研究
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作者 饶盼盼 王晞 +2 位作者 程玥 姜婵 黄从新 《中国心脏起搏与心电生理杂志》 2019年第2期133-137,共5页
目的探究473 nm可见蓝光能否对表达光敏感蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)的大鼠心脏成功实现在体光起搏及光起搏所需的光照功率密度与脉冲波宽的关系。方法将27只SD大鼠随机分为三组:正常组、ChR2组、空载病毒组,每组9只。分别经右侧颈... 目的探究473 nm可见蓝光能否对表达光敏感蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)的大鼠心脏成功实现在体光起搏及光起搏所需的光照功率密度与脉冲波宽的关系。方法将27只SD大鼠随机分为三组:正常组、ChR2组、空载病毒组,每组9只。分别经右侧颈静脉注射60μl PBS,60μl载有ChR2的腺相关病毒[AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry],60μl空载病毒(AAV9-CAG-mCherry)。8周后,大鼠经麻醉开胸充分暴露心脏后,给予473 nm蓝光8 Hz频率的脉冲照射心脏右心室,并同步记录光照输出信号和体表心电图,改变光照功率密度(0.03~1.97 mw/mm~2)和脉冲波宽(2、5、10、20、50 ms),观察光照对心室夺获起搏的情况。结果 8 Hz脉冲光照固定脉冲宽度20 ms时,0.64 mw/mm~2可完全夺获心脏节律。在0.03~0.64 mw/mm~2范围内,心脏夺获率随功率密度增大而增加,夺获率可达100%。改变473 nm蓝光脉冲波宽,完全起搏心脏所需最小光照功率密度(mw/mm~2)依次为0.46±0.33, 0.26±0.10, 0.18±0.04,0.13±0.04,0.16±0.07。2倍功率密度阈值脉冲光照结束后,心电图RR间期、QT间期、QRS波宽与基础心率无显著差异(P均>0.05)。结论颈静脉注射腺相关病毒AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry能够使心脏表达光敏感蛋白ChR2,473 nm蓝光可有效起搏心脏。心脏夺获率与光照的功率密度和脉冲宽度有关。 展开更多
关键词 心血管病学 右心室 起搏 光遗传 光敏蛋白 相关病毒
基因疗法中非整合型病毒载体的应用 预览
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作者 邱苏赣(综述) 罗建辉(审校) 白玉(审校) 《微生物学免疫学进展》 2018年第6期89-93,共5页
在过去的十年间,基因疗法在肿瘤、遗传性疾病以及传染性疾病等多个领域的临床治疗中取得了突破性进展。在基因疗法中,广泛地应用了各种各样的病毒载体,按其生活史可分为整合型病毒载体(如γ-逆转录病毒、慢病毒)和非整合型病毒载体(如... 在过去的十年间,基因疗法在肿瘤、遗传性疾病以及传染性疾病等多个领域的临床治疗中取得了突破性进展。在基因疗法中,广泛地应用了各种各样的病毒载体,按其生活史可分为整合型病毒载体(如γ-逆转录病毒、慢病毒)和非整合型病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和痘病毒)。腺病毒、单纯疱疹病毒是溶瘤病毒中最常用的病毒载体,能优先感染肿瘤细胞,经复制后造成其裂解。这些病毒的特点是基因携带量大,但只能维持较短时间的外源性基因表达,加之免疫原性较强,因此需要采取肿瘤内注射的给药方式。腺相关病毒则由于其较低的免疫原性和持久的表达能力而被广泛使用于遗传缺陷性疾病的基因替代疗法中。现就用于直接在体细胞内进行稳定表达的非整合型病毒载体作一概述。 展开更多
关键词 基因疗法 非整合型病毒载体 病毒 相关病毒 单纯疱疹病毒
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生物起搏中的病毒载体 预览
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作者 张健 黄从新 《心血管病学进展》 CAS 2018年第1期20-24,共5页
随着分子生物学和基因工程学的进展,为了弥补电子起搏器的不足,生物起搏器应运而生。基因治疗作为构建生物起搏器的一个切实可行的方法,指通过载体将目的基因导入宿主并使其表达,以达到治疗的目的。而病毒载体是实现基因递送的前提条件... 随着分子生物学和基因工程学的进展,为了弥补电子起搏器的不足,生物起搏器应运而生。基因治疗作为构建生物起搏器的一个切实可行的方法,指通过载体将目的基因导入宿主并使其表达,以达到治疗的目的。而病毒载体是实现基因递送的前提条件,不同病毒载体在研究应用中均存在一定的优势和局限,现就生物起搏中常用的病毒载体(慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)的结构特性以及在起搏中的应用选择做一综述。 展开更多
关键词 生物起搏 基因治疗 病毒 病毒 相关病毒
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利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型(rAAV2)研究 预览 被引量:1
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作者 鲁念 刘兴健 +3 位作者 胡小元 李轶女 易咏竹 张志芳 《生物技术进展》 2018年第1期71-77,F0003共8页
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表... 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)。首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和荧光素酶(luciferase,Luc)基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE(cytomegalovirus-IE,CMV-IE)启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上。随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒re Bm Bac共转染Bm N细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)。再将纯化的重组病毒(re Bm-Cap2、re Bm-Rep2)与re Bm-EGFP、re Bm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒。利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否。结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达。 展开更多
关键词 相关病毒 家蚕 杆状病毒表达系统 包装
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Duchenne型肌营养不良基因治疗研究进展 预览
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作者 董奇超 陈慧敏 金欣 《中国当代儿科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第8期691-696,F0003共7页
Duchenne型肌营养不良(DMD)是由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因突变导致的X连锁隐性遗传病。它的特点是进行性肌无力和因缺乏抗肌萎缩蛋白而导致的骨骼肌和心肌退化。患儿多于2~5岁起病,常在20岁左右死于心力衰竭或呼吸功能不全。目前,临... Duchenne型肌营养不良(DMD)是由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因突变导致的X连锁隐性遗传病。它的特点是进行性肌无力和因缺乏抗肌萎缩蛋白而导致的骨骼肌和心肌退化。患儿多于2~5岁起病,常在20岁左右死于心力衰竭或呼吸功能不全。目前,临床上多采用支持疗法改善疾病症状,但并不能改变疾病的最终结局。基因治疗的兴起为该病的治愈提供了希望。本文总结了DMD的基因替代疗法,包括腺相关病毒介导的DMD基因转导技术、肌营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)上调技术和成簇规律间隔的短回文重复序列基因编辑技术的研究进展,并为解决腺相关病毒载量、转基因产物的长期有效表达、utrophin蛋白表达量问题提出的建议进行综述,为研究者们进一步研究提供参考。 展开更多
关键词 DUCHENNE型肌营养不良 相关病毒 肌营养不良蛋白相关蛋白 成簇规律间隔的短回文重复序列技术 儿童
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腺相关病毒介导血红素加氧酶-1基因转移对大鼠脊髓损伤的保护作用
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作者 林文平 王思远 +3 位作者 郑煜晖 柯庆峰 施进兴 肖丹蕊 《中华实验外科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第1期46-49,共4页
目的观察血红素加氧酶-1(HO-1)过表达对脊髓损伤(SCI)后运动功能恢复的影响,并探讨其机制。方法96只健康雄性SD大鼠,应用完全随机法分为假手术组(Sham组)、单纯SCI组(SCI组)、空载体组[AAV-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组]和H... 目的观察血红素加氧酶-1(HO-1)过表达对脊髓损伤(SCI)后运动功能恢复的影响,并探讨其机制。方法96只健康雄性SD大鼠,应用完全随机法分为假手术组(Sham组)、单纯SCI组(SCI组)、空载体组[AAV-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组]和HO-1过表达腺相关病毒载体组(AAV-HO-1组),采用重物压迫脊髓损伤模型;采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分评估大鼠后肢运动功能;原位缺口末端标记法(TUNEL)检测脊髓组织细胞凋亡;荧光显微镜下观察EGFP表达;免疫荧光染色显示脊髓组织中神经元核性蛋白(NeuN)阳性细胞的表达;Western blot测定脊髓组织中HO-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)蛋白表达。结果SCI后1 d,可观察到AAV-EGFP组和AAV-HO-1组脊髓组织有EGFP表达;AAV-HO-1组与SCI组和AAV-EGFP组比较,凋亡细胞数量[分别为(21.50±8.02)%、(49.83±13.60)%、(44.83±11.74)%]、bax蛋白表达量(分别为1.15±0.19、1.96±0.24、1.77±0.30)明显减少,差异有统计学意义(分别为F=30.630,P=0.000;F=29.900,P=0.000),而AAV-HO-1组与SCI组和AAV-EGFP组比较,HO-1(分别为1.96±0.28、1.48±0.23、1.54±0.16)、bcl-2蛋白表达量(分别为0.69±0.13、0.35±0.11、0.29±0.10)明显增加,差异有统计学意义(分别为F=23.900,P=0.000;F=68.140,P=0.000);SCI后7、14、21 d,AAV-HO-1组BBB评分[分别为(8.00±1.79)、(11.67±2.16)、(13.83±2.22)分]明显高于SCI组[分别为(5.17±1.94)、(6.17±1.72)、(7.50±1.97)分]和AAV-EGFP组[分别为(4.67±1.51)、(5.67±1.86)、(7.17±2.14)分],差异有统计学意义(分别为F=152.900,P=0.000;F=109.700,P=0.000;F=75.880,P=0.000)。SCI后21 d,AAV-HO-1组(108.5±27.74)的NeuN阳性细胞较SCI组(50.00±20.93)和AAV-EGFP组(55.83±13.57)明显增加,差异有统� 展开更多
关键词 脊髓损伤 相关病毒 血红素加氧酶-1 基因治疗
糖原合成酶激酶3β在糖尿病因素减弱七氟醚后处理心肌保护中的作用 预览
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作者 张一强 贺建东 +5 位作者 韩冲芳 方爱莉 王晓鹏 杨文曲 PEI Ruomeng LUO Weihao 《临床麻醉学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第10期1005-1008,共4页
目的通过糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的过表达,探讨其在糖尿病因素减弱七氟醚后处理心肌保护中的作用。方法 2月龄健康清洁级雄性SD大鼠60只,体重200~300g,采用随机对照法分为五组:假手术组(Sham组)、正常大鼠IR组(NI组)、正常... 目的通过糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的过表达,探讨其在糖尿病因素减弱七氟醚后处理心肌保护中的作用。方法 2月龄健康清洁级雄性SD大鼠60只,体重200~300g,采用随机对照法分为五组:假手术组(Sham组)、正常大鼠IR组(NI组)、正常大鼠IR+七氟醚后处理组(NS组)、糖尿病大鼠缺血-再灌注(IR)+七氟醚后处理组(DS组)、正常大鼠GSK-3β过表达+IR+七氟醚后处理组(GS组),每组12只。采用腹腔单次注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg的方法制备糖尿病大鼠模型。采用左开胸心脏左前降支冠状动脉结扎30min后再灌注120min的方法制备IR模型。采用在IR模型构建前2周经尾静脉注射包装有GSK-3β突变型基因的腺相关病毒(AAV9型)方法处理构建GSK-3β过表达。观察大鼠IR模型制备过程中是否有心肌缺血的ECG表现(ST段抬高,出现宽大Q波及心律失常等),120min后经腹主动脉取血,检测肌钙蛋白I(cTnI)浓度;处死大鼠取心脏,计算心肌梗死体积;光镜下观察心肌病理学损伤;采用Western blot法测定心肌GSK-3β和caspase-3含量。结果与Sham组比较,NI组、NS组、DS组、GS组cTnI浓度明显升高,梗死体积明显增大,病理损伤加重,GSK-3β和caspase-3含量明显升高(P 〈0.05);与NI组比较,NS组cTnI浓度明显降低,梗死体积明显减小,病理损伤减轻,GSK-3β和caspase-3含量明显降低(P 〈0.05);与NS组比较,DS组、GS组cTnI浓度明显升高,梗死体积明显增大,病理损伤加重,GSK-3β和caspase-3含量明显升高(P〈0.05);DS组和GS组cTnI浓度、心肌梗死体积、GSK-3β和caspase-3含量差异无统计学意义。结论 GSK-3β过表达可加重大鼠心肌IR损伤,七氟醚后处理对糖尿病大鼠心肌IR时的保护作用减弱可能是通过GSK途径导致的。 展开更多
关键词 麻醉药 吸入 心肌再灌注损伤 相关病毒
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耳蜗毛细胞miR-30b对Dynamin基因靶向调控的研究
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作者 李洋 唐小林 +2 位作者 余菲 李华君 袁伟 《四川大学学报:医学版》 CSCD 北大核心 2018年第3期347-351,共5页
目的观察正常成年小鼠耳蜗毛细胞中miR-30b的表达,研究其对靶基因(Dynamin1,DNM1)的调控是否会影响内毛细胞中突触囊泡内吞关键蛋白Dynamin的表达。方法取正常成年C57小鼠耳蜗基底膜行原位杂交,观察耳蜗毛细胞中miR-30b的表达分布;构... 目的观察正常成年小鼠耳蜗毛细胞中miR-30b的表达,研究其对靶基因(Dynamin1,DNM1)的调控是否会影响内毛细胞中突触囊泡内吞关键蛋白Dynamin的表达。方法取正常成年C57小鼠耳蜗基底膜行原位杂交,观察耳蜗毛细胞中miR-30b的表达分布;构建荧光素酶报告基因载体,转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确DNM1是否为miR-30b的靶基因;通过耳蜗圆窗显微注射过表达miR-30b的腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV),14d后通过real time-PCR检测miR-30b和DNM1的mRNA表达,免疫印迹实验(Western blot)检测Dynamin蛋白表达。结果 miR-30b在小鼠耳蜗内、外毛细胞胞质和胞核均有表达;miR-30b可抑制DNM1载体的荧光表达(P〈0.05),而突变型DNM1载体的荧光表达无抑制作用;转染AAV-miR-30b后miR-30b的相对表达量增高,DNM1和Dynamin蛋白表达降低。结论 miR-30b在小鼠耳蜗内、外毛细胞均有表达;miR-30可以靶向下调DNM1基因从而抑制Dynamin蛋白表达。 展开更多
关键词 毛细胞 miR-30b DNM1 DYNAMIN 原位杂交 双荧光素酶报告基因 相关病毒
腺相关病毒作为基因治疗载体在生殖系统中的分布及影响的研究进展
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作者 葛圆圆 张梅 +3 位作者 姜颖 杨丹 韩松洋 于英君 《现代生物医学进展》 CAS 2018年第6期1189-1192,共4页
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为一种基因治疗载体被广泛应用于医学相关的各个领域。大量以AAV为载体的基因治疗被应用于药物研究,但目前国内外没有相关的基因药物应用于临床,原因在于其安全性问题有待进一步研究。AAV具... 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为一种基因治疗载体被广泛应用于医学相关的各个领域。大量以AAV为载体的基因治疗被应用于药物研究,但目前国内外没有相关的基因药物应用于临床,原因在于其安全性问题有待进一步研究。AAV具有器官靶向性,易于分布在靶器官,但在非靶器官也会分布。AAV在生殖系统的短暂分布降低了对其功能的影响,但不排除潜在影响。就目前的研究结果来看,AAV不会整合在生殖细胞,从而不会对子代产生影响。本文将综述目前以腺相关病毒介导的基因治疗中对生殖系统安全性的研究进展,从载体在生殖系统的分布、对生殖系统功能的影响以及对子代影响的三个方面进行阐述。 展开更多
关键词 相关病毒 生殖系统 分布
外伤性视神经病变的神经再生研究进展 预览 被引量:4
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作者 陈海英 黄正如 《中华实验眼科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第1期75-80,共6页
外伤性视神经病变(TON)是头面部外伤后视功能损害的重要原因之一。与成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)神经元一样,视网膜神经节细胞(RGC)的轴突在视神经损伤后通常不能自发再生,从而导致不可逆的视功能丧失。RGC轴突不能再生的原... 外伤性视神经病变(TON)是头面部外伤后视功能损害的重要原因之一。与成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)神经元一样,视网膜神经节细胞(RGC)的轴突在视神经损伤后通常不能自发再生,从而导致不可逆的视功能丧失。RGC轴突不能再生的原因被归结为视神经损伤后RGC的凋亡、成熟神经元丧失固有的再生能力、缺乏合适的再生刺激信号、视神经损伤局部的抑制性细胞外微环境。本文阐述了激活RGC的再生潜能、阻断抑制轴突再生的信号传导、给予适当的再生刺激信号等途径促进视神经再生的研究现状,以及以腺相关病毒为载体的基因治疗在视神经再生中的应用潜能。 展开更多
关键词 外伤性视神经病变 神经再生 相关病毒 基因治疗
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重组腺相关病毒介导的RNAi靶向治疗作用研究
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作者 于水澜 姜颖 +3 位作者 张淑香 韩松洋 葛圆圆 宋高臣 《现代生物医学进展》 CAS 2018年第13期2431-2436,共6页
目的:采用前期成功构建的靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒r AAV-sh RNA-CDK2转染人肝癌Hep G2细胞,研究其对人肝癌细胞增殖的抑制作用。方法:取人肝癌Hep G2细胞于裸鼠前肢腋下接种,构建裸鼠皮下移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为三组... 目的:采用前期成功构建的靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒r AAV-sh RNA-CDK2转染人肝癌Hep G2细胞,研究其对人肝癌细胞增殖的抑制作用。方法:取人肝癌Hep G2细胞于裸鼠前肢腋下接种,构建裸鼠皮下移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为三组:肿瘤组、NC对照组、r AAV-sh RNA-CDK2给药组。各试验组均通过尾静脉注射给药,每隔五天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),计算肿瘤体积。根据每组裸鼠移植瘤体积的平均值,绘制移植瘤生长曲线。于给药24 h后处死,称取瘤重,计算抑瘤率,应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测各组肝癌组织中CDK2基因m RNA和蛋白的表达量,观察r AAV-sh RNA-CDK2对肝癌组织CDK2表达的影响;结果:r AAV-sh RNA-CDK2能够显著抑制肝癌Hep G2细胞的增殖,其抑瘤率为72.18%;并能够下调肝癌组织中CDK2基因m RNA与蛋白表达量;结论:r AAV-sh RNA-CDK2实现了体内靶向治疗肝癌的目的,并确定静脉定量给药方式。 展开更多
关键词 肝癌 相关病毒 r AAV-sh RNA-CDK2 靶向治疗
腺相关病毒与生物素葡聚糖胺顺行标记小鼠皮质脊髓束的比较 预览
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作者 王坚 孙玉慧 《基础医学与临床》 CSCD 2018年第7期961-966,共6页
目的比较腺相关病毒(AAV)与生物素葡聚糖胺(BDA)用于顺行标记小鼠皮质脊髓束(CST)的差异,探索AAV病毒应用于小鼠皮质脊髓束的顺行神经示踪的优势。方法通过立体定位注射将AAV8-CAG-GFP-2A病毒与BDA分别注射到正常小鼠以及脊髓损伤小鼠... 目的比较腺相关病毒(AAV)与生物素葡聚糖胺(BDA)用于顺行标记小鼠皮质脊髓束(CST)的差异,探索AAV病毒应用于小鼠皮质脊髓束的顺行神经示踪的优势。方法通过立体定位注射将AAV8-CAG-GFP-2A病毒与BDA分别注射到正常小鼠以及脊髓损伤小鼠大脑体感运动皮质,通过免疫组织化学法检测AAV与BDA标记到的CST轴突,并对轴突束(bundle)及轴突分支(branch)的荧光强度进行定量分析。结果在正常小鼠的脊髓颈段、胸段及脊髓损伤小鼠胸段,AAV与BDA均可标记到经典的CST轴突束,及投射到脊髓灰质中的轴突分支。相较于BDA,AAV在小鼠脊髓颈段和胸段均能标记到更广泛的CST轴突分支。结论AAV对于CST轴突的标记效果优于传统的神经示踪剂BDA,可作为一种更好的神经示踪方法应用于小鼠皮质脊髓束及相关神经环路的形态学研究。 展开更多
关键词 相关病毒 生物素葡聚糖胺 皮质脊髓束
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