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利用杆状病毒表达系统表达奶牛触珠蛋白及其单克隆抗体的制备
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作者 向敏 程蕾 +7 位作者 胡修忠 余婕 夏瑜 陶弼菲 熊海谦 周源 刘晓华 王定发 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第15期18-22,176-177共7页
为了建立奶牛早期妊娠诊断检测方法,试验用GenBank公布的奶牛触珠蛋白(haptoglobin)Hp基因序列设计引物,扩增出Hp基因全长片段,将Hp基因亚克隆至Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中,转入含昆虫杆状病... 为了建立奶牛早期妊娠诊断检测方法,试验用GenBank公布的奶牛触珠蛋白(haptoglobin)Hp基因序列设计引物,扩增出Hp基因全长片段,将Hp基因亚克隆至Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中,转入含昆虫杆状病毒骨架质粒的E.coliDH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选获得穿梭质粒rBacmid-Hp阳性克隆,在脂质体介导下转染昆虫细胞sf9,获得含Hp基因的重组杆状病毒质粒rBacmid-Hp;用纯化的rBacmid-Hp蛋白免疫Balb/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞和鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法和有限稀释法筛选杂交瘤细胞;分别用ELISA法、Western-blot检测单克隆抗体腹水效价及特异性。结果表明:在sf9细胞中成功表达Hp蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性;制备了8株单克隆抗体,分别命名为3B12、4F4、4F11、5D7、5G8、7E5、10C3和12F9,腹水效价均在1∶5.12×10^4以上;亚类鉴定显示,除3B12、4F11、10C3为IgG2a外,其余单克隆抗体均属于IgG1;筛选出1对配对单克隆抗体,分别为12F9和4F11。说明Hp蛋白可在Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统中高效表达,并成功筛选出一对配对的高效单克隆抗体。 展开更多
关键词 奶牛 触珠蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 单克隆抗体 SF9细胞 表达
抗猫细小病毒嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达与鉴定 预览
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作者 薛雨佳 宋彩玲 +4 位作者 赵爽爽 李彤彤 王文静 张云 刘明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期632-636,共5页
为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质... 为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质粒,经昆虫杆状病毒表达系统对重组嵌合抗体进行表达。SDS-PAGE和western blot试验显示鼠-犬嵌合抗体重链为55ku、轻链为25ku。间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗犬IgG和FPV特异性结合。上述结果表明,嵌合抗体保留了原MAb3EB对病毒特异结合能力的基础上,将鼠源恒定区替换为犬源NAb的恒定区。病毒中和试验表明嵌合抗体保留了3EB对FPV、CPV的中和活性。本研究首次通过昆虫杆状病毒表达系统表达了抗FPV、CPV的嵌合抗体,降低了原MAb的免疫原性,对FPV、CPV病临床治疗用抗体药物的研制具有重要指导意义。 展开更多
关键词 基因工程嵌合抗体 猫细小病毒 昆虫杆状病毒表达系统
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猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究 预览
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作者 孙裴 张娟 +4 位作者 舒金琪 施杏芬 FAHD 舒建洪 钱泓 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第9期17-24,共8页
[目的]在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1 NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础.[方法]PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PE... [目的]在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1 NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础.[方法]PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD.将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度.在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况.将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况.[结果]PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDVS1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高.在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P<0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P>0.05).[结论]成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免� 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S1蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 免疫原性 基因工程疫苗
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含伯氏疏螺旋体OspA、OspC蛋白VLPs的构建及鉴定
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作者 于喜冰 李俊姣 +6 位作者 常瑾 费亦东 穆佳琦 丁佳欣 李金斗 丁壮 尹仁福 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1336-1341,1346共7页
莱姆病是一种经蜱传播的人兽共患病,随着人们经济的发展,伴侣动物的不断出现增加了人与动物经蜱传播莱姆病的风险,而当前并未有治疗莱姆病的有效方法,因此研制莱姆病疫苗成为一大热点。为了更好地预防莱姆病的发生,本研究通过替换新城... 莱姆病是一种经蜱传播的人兽共患病,随着人们经济的发展,伴侣动物的不断出现增加了人与动物经蜱传播莱姆病的风险,而当前并未有治疗莱姆病的有效方法,因此研制莱姆病疫苗成为一大热点。为了更好地预防莱姆病的发生,本研究通过替换新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase protein,HN)胞外域的方式,利用昆虫杆状病毒表达系统分别构建了含伯氏疏螺旋体候选抗原表位外膜蛋白A(outer surface protein A,OspA)、外膜蛋白C(outer surface protein C,OspC)的新城疫病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),形成了含有伯氏疏螺旋体抗原表位的新城疫病毒样颗粒,为之后研制莱姆病疫苗提供了新思路、新想法。 展开更多
关键词 伯氏疏螺旋体候选抗原蛋白 OspA/OspC 昆虫杆状病毒表达系统 新城疫病毒样颗粒
旋毛虫副肌球蛋白在BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统中的表达及鉴定 预览 被引量:1
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作者 王子霞 郝春悦 +3 位作者 赵夕 黄京京 程喻力 诸欣平 《寄生虫与医学昆虫学报》 2018年第1期1-6,共6页
利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统表达重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Trichinella spiralis paramyosin,rTsPmy),以获得生物学活性较好的重组蛋白。通过PCR和DNA重组方法构建含孔Pmy基因的Gateway入门载体重组质粒pDONR221... 利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统表达重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Trichinella spiralis paramyosin,rTsPmy),以获得生物学活性较好的重组蛋白。通过PCR和DNA重组方法构建含孔Pmy基因的Gateway入门载体重组质粒pDONR221(pDONR221/TsPmy),经测序鉴定后,扩增重组质粒;利用重组质粒pDONR221/TsPmy和BaculoDirect线性杆状病毒进行Gateway DNA重组反应,构建重组病毒,用其直接感染昆虫细胞Sf9使得重组病毒具有感染活力;连续感染Sf9以扩增病毒,利用滴度较高的病毒感染St9进行rTsPmy表达;SDS—PAGE及Western blotting分析鉴定表达的重组蛋白rTsPmy。结果显示,重组质粒经测序鉴定显示序列正确;SDS—PAGE及Western blotting显示rTsPmy分子量大小约110kDa,未见不完全表达;可溶性分析显示rTsPmy部分可溶,大部分为不可溶沉淀;Western blotting结果显示rTsPmy可被旋毛虫感染的小鼠和猪抗血清识别,具有抗原特异性。本研究首次利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统成功表达了rTsPmy,获得翻译后修饰更加完善、纯化效果更好的重组蛋白,对于进一步研究TsPmy的功能,为制备有效的旋毛虫病疫苗候选抗原分子提供了生物学基础。 展开更多
关键词 旋毛虫 副肌球蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 表达和鉴定 抗原性
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CDV强毒BJ16B2株H基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 预览
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作者 陈美荣 林伟东 +4 位作者 宋天琪 鑫婷 郭晓宇 黄克和 贾红 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第8期2041-2048,共8页
试验旨在获得具有天然构象且抗原性良好的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)强毒株的H蛋白。以分离的CDV强毒株BJ16B2为模板,RT-PCR特异扩增H基因,克隆至表达载体pFastBacTMHTA上,酶切及测序鉴定正确后比对分析H基因同源性,并... 试验旨在获得具有天然构象且抗原性良好的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)强毒株的H蛋白。以分离的CDV强毒株BJ16B2为模板,RT-PCR特异扩增H基因,克隆至表达载体pFastBacTMHTA上,酶切及测序鉴定正确后比对分析H基因同源性,并将重组质粒pFastBacTMHTA-H转化大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞,同源重组构建穿梭质粒rBacmid-H,将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,拯救重组杆状病毒。利用IFA和Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。结果显示,重组质粒pFastBacTMHTA-H酶切测序鉴定正确,该H基因属于Asia-1强毒株,与参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.3%和89.6%~99.5%。在杆状病毒中所表达的H蛋白能与CDV阳性血清及His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定能够产生特异性绿色荧光,且在68ku左右出现蛋白条带,表明H蛋白成功表达且具有良好的反应原性。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白,为后续蛋白结构和抗原特性差异分析、单抗制备、CDV亚单位疫苗的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒(CDV) H基因 昆虫杆状病毒表达系统
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基因Ⅱ、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的制备和鉴定 被引量:2
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作者 丁佳欣 李金斗 +8 位作者 刘亚林 张国军 姜翠翠 徐小洪 钱晶 于喜冰 吴金 尹仁福 丁壮 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1858-1863,共6页
将基因Ⅶ型新城疫NA-1株F、HN基因的胞外域与基因Ⅱ型新城疫Lasota株F、HN基因的胞内域及跨膜域进行融合,并命名为rNA-1 F/HN。利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有新城疫LaSota株M、F、HN等3个结构基因及rNA-1F、rNA-1 HN基因的重组杆状... 将基因Ⅶ型新城疫NA-1株F、HN基因的胞外域与基因Ⅱ型新城疫Lasota株F、HN基因的胞内域及跨膜域进行融合,并命名为rNA-1 F/HN。利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有新城疫LaSota株M、F、HN等3个结构基因及rNA-1F、rNA-1 HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-rNA-1 F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 HN。将几种重组杆状病毒共感染Sf9细胞96h后收取上清,经超速离心及蔗糖密度离心纯化病毒样粒子(virus-like particles,VLPs),并利用Western blot方法和透射电子显微镜技术检测,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的VLPs。结果表明:成功制备了新城疫标准疫苗株(LaSota株)及流行强毒株(NA-1株)二价NDV VLPs,为当前新城疫的防控提供新策略。 展开更多
关键词 新城疫病毒(NDV)样颗粒 基因Ⅱ型NDV 基因Ⅶ型NDV 昆虫杆状病毒表达系统
如何保障疫苗质量与免疫效果 预览
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作者 李相钊 《兽医导刊》 2017年第9期53-55,共3页
一、猪疫苗的种类包括活疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗;目前以常规的全病毒疫苗为主,但基因工程疫苗是各大生物制品企业研究的热点,目前已经上市的基因工程猪疫苗有:VLPs(病毒样颗粒)基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗;其中VLPs(病毒样颗... 一、猪疫苗的种类包括活疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗;目前以常规的全病毒疫苗为主,但基因工程疫苗是各大生物制品企业研究的热点,目前已经上市的基因工程猪疫苗有:VLPs(病毒样颗粒)基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗;其中VLPs(病毒样颗粒)基因工程亚单位疫苗又分为原核表达系统疫苗(大肠杆菌表达系统)和真核表达系统疫苗(昆虫杆状病毒表达系统),这种疫苗目前上市的产品主要在猪圆环疫苗这个产品上,主要因为猪圆环病毒的全基因组比较小,仅在l768bp与l767bp左右,对于全基因组功能认识更为透彻。合成肽疫苗主要在口蹄疫这个产品上。由于基因组学及基因改造技术的进步,基因工程疫苗更有利于随人的意愿控制,生产高含量、高安全、多联苗、低成本的疫苗更容易成为现实,这就是基因工程疫苗成为研究热点的重要原因。 展开更多
关键词 疫苗质量 免疫效果 基因工程亚单位疫苗 基因工程疫苗 昆虫杆状病毒表达系统 大肠杆菌表达系统 病毒样颗粒 合成肽疫苗
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ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达 预览 被引量:1
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作者 冯平 李云章 +2 位作者 孙丰廷 屈雷 闫海龙 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2017年第9期32-38,共7页
【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒... 【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 昆虫杆状病毒表达系统
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H7N9流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及抗血清的制备
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作者 权娅茹 崔晓雨 +3 位作者 邵铭 刘书珍 李长贵 袁力勇 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1798-1803,共6页
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统表达H7N9流感病毒血凝素(HA),以获得的重组血凝素(rHA1)蛋白免疫家兔制备抗rHA1血清,以用于单向免疫扩散(SRID)法检测H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量。方法:构建含H7N9 HA1基因的重组杆状病毒,转染Sf... 目的:利用昆虫杆状病毒表达系统表达H7N9流感病毒血凝素(HA),以获得的重组血凝素(rHA1)蛋白免疫家兔制备抗rHA1血清,以用于单向免疫扩散(SRID)法检测H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量。方法:构建含H7N9 HA1基因的重组杆状病毒,转染Sf9细胞表达rHA1蛋白。用rHA1蛋白免疫家兔获得抗rHA1血清。通过血凝抑制(HI)法和SRID法检测抗血清的HI效价、特异性和线性范围。结果:rHA1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中成功实现分泌表达,经纯化后纯度≥90%。不同剂量的rHA1蛋白免疫家兔后获得抗rHA1血清,HI效价分别为1 280和5 120。SRID试验中可与H7N9抗原国际参考品反应并产生沉淀环,10μg·m L-1到40μg·m L-1抗原浓度范围内沉淀环直径与抗原浓度线性正相关,R2大于0.99,与H1N1、H3N2和B型流感病毒无交叉反应。用该免疫血清和H7N9抗血清国际参考品分别检测H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量,两者无显著性差异。结论:在大流感发生时,昆虫杆状病毒表达系统表达的rHA1蛋白可以用于制备SRID试验用免疫血清,以用于H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量测定。 展开更多
关键词 流感疫苗有效成分检测 H7N9流感病毒 rHA1蛋白 血凝素 免疫血清 昆虫杆状病毒表达系统 血凝抑制效价 单向免疫扩散
利用类病毒脂质体抗原检测H5N1亚型禽流感病毒抗体ELISA方法的建立 预览 被引量:1
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作者 杨倩 朱道中 +6 位作者 薛春宜 李晓明 曹永长 段燕喻 王莹 吴晓薇 刘志玲 《动物医学进展》 北大核心 2015年第1期5-10,共6页
利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,分别作为包被抗原,建立了相应的检测H5N1亚型禽流感病毒抗体的ELISA方法。特异性试验、敏感性试验、重复性试验和稳定性试验结果表明,利用3... 利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,分别作为包被抗原,建立了相应的检测H5N1亚型禽流感病毒抗体的ELISA方法。特异性试验、敏感性试验、重复性试验和稳定性试验结果表明,利用3种抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重复性和稳定性,批间和批内变异系数均小于10%,但单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性更好,而且类病毒脂质体有更高的免疫反应性,与灭活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亚型AIV抗体水平检测方面更具有应用前景。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 禽流感病毒 病毒脂质体 抗体检测
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EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建
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作者 陈仕菊 向蕾 +3 位作者 王昕 吕星 陆家海 房师松 《热带医学杂志》 CAS 2014年第4期450-455,F0002共7页
目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HPl基因;HP1基因与载体pFastBacl连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得... 目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HPl基因;HP1基因与载体pFastBacl连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Westernblot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBacl载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×10^3 Mr的目的蛋白条带,经Westernblot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A16型 联合P1基因 昆虫杆状病毒表达系统
三种抗原检测H1N1猪流感病毒抗体的比较 预览 被引量:1
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作者 杨倩 薛春宜 +2 位作者 朱道中 李晓明 曹永长 《广东畜牧兽医科技》 2014年第1期16-20,共5页
本研究采用昆虫杆状病毒表达系统制备了H1N1亚型猪流感病毒的HA蛋白、类病毒脂质体、病毒样颗粒,分别作为抗原进行包被,采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测H1N1猪流感病毒抗体.特异性实验结果表明,单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体... 本研究采用昆虫杆状病毒表达系统制备了H1N1亚型猪流感病毒的HA蛋白、类病毒脂质体、病毒样颗粒,分别作为抗原进行包被,采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测H1N1猪流感病毒抗体.特异性实验结果表明,单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性良好,但是病毒样颗粒不能区分不同亚型的流感病毒;敏感性实验结果表明,类病毒脂质体作为抗原的敏感性最好;重复性实验结果表明,三种抗原的重复性好,ELISA实验的批间和批内变异系数均小于10%;稳定性实验结果表明,在4℃可至少稳定保存1年.综上所述,类病毒脂质体有较高的免疫反应性,与灭活全病毒相比有更好的安全性,在抗体水平测定方面有较好的应用前景. 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 猪流感病毒 病毒脂质体 抗体检测
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昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建 预览
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作者 唐晓艳 高冬妮 +3 位作者 李梅 葛菁萍 平文祥 楼庄伟 《中国农学通报》 CSCD 2013年第8期26-30,共5页
为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用XbaI和HindIII酶切融合片... 为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用XbaI和HindIII酶切融合片段与pFastBacPH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明:通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况;结果证实:感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 增强型绿色荧光蛋白 昆虫细胞
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水貂阿留申病病毒VP2蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达 被引量:3
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作者 王振军 吴威 +10 位作者 闫喜军 呼延良浩 朱春生 胡博 张海玲 白雪 赵建军 徐淑娟 冯卓 张蕾 李明霞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1246-1251,共6页
为了得到结构和功能近似于天然的水貂阿留申病病毒G株(ADV—G)的衣壳蛋白VP2,将ADV—G的VP2基因5’端添加His标签后克隆到杆状病毒转移载体(pFastBacl)后转化入大肠杆菌DH10Bac中重组,筛选重组成功的克隆进行茵液扩增,获得重组... 为了得到结构和功能近似于天然的水貂阿留申病病毒G株(ADV—G)的衣壳蛋白VP2,将ADV—G的VP2基因5’端添加His标签后克隆到杆状病毒转移载体(pFastBacl)后转化入大肠杆菌DH10Bac中重组,筛选重组成功的克隆进行茵液扩增,获得重组的杆粒(Bacmid),然后用重组杆粒转染昆虫细胞(sf9),获得重组的杆状病毒。用P3代病毒感染s19细胞,接毒后第48小时进行免疫荧光试验,结果,检测到特异的绿色荧光,证实目的蛋白得到成功表达。Western—blot分析结果显示,表达的VP2蛋白能够与His标签单抗和ADV阳性血清产生特异性免疫印迹反应。经过对流免疫电泳(CIEP)验证,在敏感性、特异性、重复性、稳定性方面,表达的VP2蛋白与商业抗原有一致的表现。采用超速离心法对病毒液进行浓缩后,在电子显微镜下可见约为20nm的病毒样颗粒(VLPs)。以上试验结果表明,ADVVP2蛋白在昆虫杆状病毒中得到有效表达,并具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 水貂 阿留申病病毒 VP2基因 结构蛋白 昆虫杆状病毒表达系统
家蚕在生物制药行业的应用前景 预览
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作者 兰丽盼 吴纯清 +3 位作者 姚利娟 朱建忠 朱伟 杨海青 《蚕桑通报》 2012年第2期42-43,共2页
生物产业作为七大战略性新兴产业之一,近几年来,其发展前景正Et益显现。蛋白是生物产业药物研究的前期材料,所需要表达的蛋白须接近天然结构且具有较高的活性,才有利于药物分析研究。此外,蛋白表达的成本也是必须考虑的,所以昆虫... 生物产业作为七大战略性新兴产业之一,近几年来,其发展前景正Et益显现。蛋白是生物产业药物研究的前期材料,所需要表达的蛋白须接近天然结构且具有较高的活性,才有利于药物分析研究。此外,蛋白表达的成本也是必须考虑的,所以昆虫表达系统就凸现出其优势。其中应用最广的就是昆虫杆状病毒表达系统。 展开更多
关键词 生物产业 制药行业 应用 昆虫杆状病毒表达系统 家蚕 蛋白表达 昆虫表达系统 药物分析
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蚊虫乙酰胆碱酯酶的真核表达、纯化及活性测定 预览 被引量:1
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作者 谭烽 兰文升 +2 位作者 崔峰 乔传令 陈雯莉 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期 423-427,共5页
利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得... 利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10^-4mol/(min·g)。 展开更多
关键词 有机磷农药 乙酰胆碱酯酶 昆虫杆状病毒表达系统 纯化酶 生物传感器
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昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展 预览 被引量:3
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作者 李晶梅 靖志强 +4 位作者 秦红刚 薛霜 漆世华 谢红玲 吴玉石 《中国兽药杂志》 2012年第12期67-70,共4页
综述了昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展,同时分析了昆虫杆状病毒表达系统表达流感病毒样颗粒用于流感疫苗的优势和前景,以期为兽用流感病毒VLPs疫苗研发提供参考。
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 流感病毒样颗粒 流感疫苗
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利用两种真核昆虫表达系统表达可溶性甲型H1N1血凝素蛋白 被引量:2
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作者 王浩 马驰 +2 位作者 崔莲仙 巴德年 何维 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期345-349,共5页
目的利用两种昆虫杆状病毒表达系统表达甲型H1N1血凝素(haemegglutinin,HA)蛋白,进而获得具有生物学活性的目的蛋白。方法选取中国内地第1例2009甲型H1N1确诊病例病毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1),人工合成完整HA基因序列;分别... 目的利用两种昆虫杆状病毒表达系统表达甲型H1N1血凝素(haemegglutinin,HA)蛋白,进而获得具有生物学活性的目的蛋白。方法选取中国内地第1例2009甲型H1N1确诊病例病毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1),人工合成完整HA基因序列;分别利用杆状病毒表达系统BaculoGoldsystem和Bac—to-Bacsystem,在昆虫细胞中表达日的基因HA;经亲和层析纯化及Westernblot搭定,红细胞血凝试验检测ttA蛋门的生物学活性。结果获得测序正确的HA基因,分别克隆到pAcGP67B(Baculo Goldsystem)和pFASTBacl(Bac-to-Bacsystem)载体,经杆状病毒同源重组后转染Sf9细胞,Westernblot鉴定硅示,BaculoGoldsystem表达HA蛋白是分泌型的,而Bac—to—Bacsystem是胞内表达且表达效果优于前者;血凝试验证实,这两种表达系统表达的HA蛋白均具有生物学活性。结论利用杆状病毒表达系统成功表达出具有生物学活性的HA蛋白,Bac—to-Bacsystem更适合表达HA蛋白,为流感病毒的相关研究提供了保障。 展开更多
关键词 流感病毒血凝素蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 BaculoGold system BAC-TO-BAC sys-tern 血凝试验
杆状病毒和分批补料发酵联用高效表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D
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作者 刘涛 董惠钧 +2 位作者 黄志成 郑伟 祝水芬 《中国预防医学杂志》 CAS 2011年第8期653-657,共5页
目的利用Bac-to-Bac表达系统和分批补料式培养技术在草地夜蛾昆虫细胞(Sf9)中高效表达重组单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2 gD2)。方法 以HSV-2基因组DNA为模板克隆全长gD2基因,利用Bac-to-Bac表达系统构建含目的基因的重组杆状病... 目的利用Bac-to-Bac表达系统和分批补料式培养技术在草地夜蛾昆虫细胞(Sf9)中高效表达重组单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2 gD2)。方法 以HSV-2基因组DNA为模板克隆全长gD2基因,利用Bac-to-Bac表达系统构建含目的基因的重组杆状病毒。同时采用分批补料式培养技术高密度培养Sf9细胞实现重组gD2蛋白的高效表达。构建豚鼠生殖器疱疹模型,研究重组HSV-2 gD2蛋白的免疫活性。结果在一个5 L生物反应器内,在15 mmol/L葡萄糖、0.4 g/L谷氨酰胺以及45%溶解氧的培养条件下,重组gD2蛋白的产量高达192 mg/L。此外,纯化后的重组gD2免疫能显著降低豚鼠生殖器疱疹模型的外阴皮损症状。结论 重组HSV-2 gD2蛋白利用杆状病毒和分批补料发酵联用得到高效表达,并表现出良好的免疫原性,为发展HSV-2疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 单纯疱疹病毒Ⅱ型 糖蛋白D 分批补料发酵
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