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鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用 预览 被引量:2
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作者 徐重新 张霄 +6 位作者 张存政 刘媛 仲建锋 董飒 胡晓丹 林曼曼 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期210-217,共8页
构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延... 构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。 展开更多
关键词 体展示库 单链抗体 重叠延伸PCR 载体 BT毒素
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新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建 预览 被引量:7
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作者 沈毅 潘卫 +7 位作者 易进华 徐容 陈秋莉 潘欣 冯春芝 邓松华 戚中田 刘彦君 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期 298-302,共5页
目的:将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体pCANTAB5X中,构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量(>300个氨基酸)功能蛋白的新型噬菌粒展示载体.方法:应用5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识... 目的:将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体pCANTAB5X中,构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量(>300个氨基酸)功能蛋白的新型噬菌粒展示载体.方法:应用5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物,PCR扩增获得XbaⅠ-StuⅠ -SalⅠ-KpnⅠ-[G4S] 3-NotⅠ衔接片段,将该PCR产物克隆到pMD-18T 中 ,再将该片段插入pCANTAB5X中构建成新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L.结果:限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点Xba Ⅰ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5L中.结论:成功构建了新型噬菌粒展示载体pCANT AB5L,并能有效展示功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量功能蛋白. 展开更多
关键词 体展示 载体 多克隆位点 多肽接头
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抗人肝癌单链抗体的基因克隆和分泌型表达 被引量:1
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作者 牛利国 陈志南 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1998年第2期 102-104,109,共4页
应用RT-PCR技术,从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞HAb18中,扩增出抗体VH和VL连接肽基因,将VH和VL连接成ScFv基因,并进行序列测定,结果表明,VH,VL,linker拼接正确,基因全长为726bp... 应用RT-PCR技术,从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞HAb18中,扩增出抗体VH和VL连接肽基因,将VH和VL连接成ScFv基因,并进行序列测定,结果表明,VH,VL,linker拼接正确,基因全长为726bp。用噬菌粒表达载体pCANTAB 5E在大肠杆菌中表达了可溶性的ScFv融合蛋白,经流式细胞仪分析表达产物可特异地与肝癌细胞结合,而不与正常肝细胞及胃癌细胞结合。 展开更多
关键词 单链抗体 克隆 表达 载体 肝肿瘤
人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定 被引量:8
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作者 司晓辉 陈梅红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1998年第2期 141,共1页
人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定司晓辉杨连甲金岩陈梅红1(第四军医大学口腔医学院病理科1生化教研室,西安710032)骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)具有广泛的生物学作... 人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定司晓辉杨连甲金岩陈梅红1(第四军医大学口腔医学院病理科1生化教研室,西安710032)骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)具有广泛的生物学作用,特别是在形态发生和细胞分化两个... 展开更多
关键词 骨形成蛋白2 表达载体 载体 构建 鉴定
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