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利用同源重组构建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒过表达载体 预览
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作者 李蕾 谢建山 +2 位作者 杜家政 师亮 崔慧林 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2020年第2期260-264,共5页
背景:慢病毒载体作为外源性转基因载体已被广泛应用,但是大鼠甘油二酯激酶γ(diacylglycerol kinaseγ,DGKγ)基因慢病毒载体未见报道。目的:用同源重组的方法构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录... 背景:慢病毒载体作为外源性转基因载体已被广泛应用,但是大鼠甘油二酯激酶γ(diacylglycerol kinaseγ,DGKγ)基因慢病毒载体未见报道。目的:用同源重组的方法构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的cDNA作为模板,通过PCR反应分段扩增大鼠DGKγ基因CDS区5'端1 029 bp和3'端1 362 bp,用同源重组技术将这2个片段与线性化载体进行定向连接,构建CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体并进行PCR扩增及测序鉴定。经293T细胞包装后产生慢病毒,收集慢病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达并应用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测细胞中DGKγmRNA和蛋白的表达。结果与结论:CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体经PCR扩增和测序鉴定构建成功;经CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T细胞,荧光显微镜下呈GFP阳性,实时荧光定量PCR显示DGKγmRNA的表达较空载体组显著升高(P<0.01),Western blotting显示DGKγ蛋白表达较空载体组极显著升高(P<0.001)。提示:成功构建了大鼠DGKγ慢病毒过表达载体,DGKγ在293T细胞有效高表达。 展开更多
关键词 甘油二酯激酶γ DGKγ 同源重组 慢病毒载体 过表达
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SUMO化修饰在DNA双链断裂修复中的研究进展
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作者 杨蒙蒙 王彦 +3 位作者 杜利清 刘强 纪凯华 徐畅 《国际生物医学工程杂志》 CAS 2019年第2期154-160,共7页
小泛素样修饰蛋白(SUMO)是一种与泛素结构类似的蛋白,其主要参与蛋白的翻译后修饰.SUMO化是指SUMO通过泛素样特异性蛋白酶1(Ulp1)、E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶,使自身经历成熟、激活、结合和连接4个步骤最终共价结合至靶蛋白的特定... 小泛素样修饰蛋白(SUMO)是一种与泛素结构类似的蛋白,其主要参与蛋白的翻译后修饰.SUMO化是指SUMO通过泛素样特异性蛋白酶1(Ulp1)、E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶,使自身经历成熟、激活、结合和连接4个步骤最终共价结合至靶蛋白的特定赖氨酸位点上,使靶蛋白活性发生改变,进而参与调节多种细胞功能,如转录调控、胚胎发育调节、细胞应激、维持染色质结构及基因组稳定性等.近年来发现SUMO化修饰也广泛参与DNA的损伤修复,尤其是DNA损伤类型最为严重的DNA双链断裂(DSBs),SUMO几乎参与了其修复的全过程,因此SUMO化修饰在DNA损伤修复中的作用已成为研究热点.对近年来SUMO化修饰调控DSBs修复的研究进展作一综述. 展开更多
关键词 DNA损伤 DNA修复 小泛素样修饰蛋白化 DNA双链断裂 同源末端连接 同源重组
非同源末端连接研究进展及其在肿瘤发生和治疗中的意义 预览
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作者 李家丽 刘颖 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第6期899-903,共5页
双链DNA损伤修复(DDR)途径主要包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR),其中非同源末端连接(NHEJ)是DNA双链断裂后主要的修复方式,在原发肿瘤的发生发展和变异中发挥关键调控作用。近年发现了NHEJ修复DNA损伤新的组分和分子机制,丰富了... 双链DNA损伤修复(DDR)途径主要包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR),其中非同源末端连接(NHEJ)是DNA双链断裂后主要的修复方式,在原发肿瘤的发生发展和变异中发挥关键调控作用。近年发现了NHEJ修复DNA损伤新的组分和分子机制,丰富了对NHEJ通路的认识。通过对NHEJ分子机制及相关肿瘤的研究,发现抑制NHEJ活性可提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性,提示NHEJ通路可能成为肿瘤治疗的新靶点。 展开更多
关键词 DNA损伤修复 同源末端连接 同源重组 肿瘤
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同源重组修复基因在卵巢癌中的研究进展 预览
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作者 胡丹 杨永秀(审校) +1 位作者 王欣 李永霞 《国际妇产科学杂志》 CAS 2019年第4期453-457,共5页
卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,起病隐匿,约70%~75%的患者出现症状时已达晚期,严重威胁着女性的健康。目前已知的大多数卵巢癌易感基因通过同源重组在修复DNA双链断裂中发挥作用,乳腺癌易感基因1(BRC... 卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,起病隐匿,约70%~75%的患者出现症状时已达晚期,严重威胁着女性的健康。目前已知的大多数卵巢癌易感基因通过同源重组在修复DNA双链断裂中发挥作用,乳腺癌易感基因1(BRCA1)和BRCA2是卵巢癌最常见的两大基因,是双链DNA断裂同源重组修复过程中的关键因子,以其为核心组成的BRCA肿瘤抑制因子网络中多种致病性突变均可损伤基因组的完整性和稳定性,增加卵巢癌的易感性。多项研究表明同源重组相关基因或蛋白的表达与肿瘤对放疗及基因药物的敏感性相关,并可成为生物标记物被用于肿瘤的个体化治疗。现对同源重组修复通路中与卵巢癌关联最密切的几种重要基因突变与卵巢癌的关系进行初步探讨,为卵巢癌的筛查和早期预防奠定临床基础。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 同源重组 重组 遗传 基因突变 精准治疗
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无限制克隆技术研究进展及其应用
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作者 杨传辉 卢荣锐 杨愈丰 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第7期719-726,共8页
无限制克隆(restriction-free cloning,RFC)是近年来建立起来的一种简单通用的DNA克隆技术,它可以精确地将目的片段插入到质粒内任意位置,是一种不受酶切位点、连接酶效率、目的基因长度或载体序列等条件限制的新型DNA重组技术.与其他... 无限制克隆(restriction-free cloning,RFC)是近年来建立起来的一种简单通用的DNA克隆技术,它可以精确地将目的片段插入到质粒内任意位置,是一种不受酶切位点、连接酶效率、目的基因长度或载体序列等条件限制的新型DNA重组技术.与其他多种克隆方法相比,RFC技术拥有不可替代的优势.本文在总结国内外RFC技术研究的基础上,系统阐述了RFC技术的原理、特点和在克隆方面的研究进展,并探讨其在分子生物学和合成生物学等领域的应用价值. 展开更多
关键词 无限制克隆 无缝克隆 DNA重组 同源重组 合成生物学
同源重组修复相关Rad51在肿瘤中的研究进展 预览
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作者 巫彦博 《中外医学研究》 2019年第9期170-172,共3页
Rad51基因的突变在很多方面发挥着很关键的作用,比如抑制多种肿瘤的发生与发展,以及肿瘤对放疗和化疗药物的耐药性等方面。另外,由于Rad51基因是DNA修复基因,其在维持基因的稳定性方面有着极其重要的作用。而且,Rad51基因可能也会在肿... Rad51基因的突变在很多方面发挥着很关键的作用,比如抑制多种肿瘤的发生与发展,以及肿瘤对放疗和化疗药物的耐药性等方面。另外,由于Rad51基因是DNA修复基因,其在维持基因的稳定性方面有着极其重要的作用。而且,Rad51基因可能也会在肿瘤的发生、发展中与其他基因相互作用对其产生影响。本文主要对同源重组修复相关Rad51在肿瘤中的研究进展作一综述。 展开更多
关键词 同源重组 修复 RAD51 肿瘤
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维氏气单胞菌hfq基因敲除菌株的构建及鉴定
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作者 张霖 马香 +2 位作者 唐鸿倩 唐燕琼 刘柱 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期2049-2054,共6页
RNA分子伴侣蛋白Hfq是细菌中普遍存在的全局调控因子,对于细菌的生长增殖、毒性和逆境耐受等都有重要影响。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型人-鱼共患条件致病菌,会在水产养殖中造成巨大危害。本研究从维氏气单胞菌基因组DN... RNA分子伴侣蛋白Hfq是细菌中普遍存在的全局调控因子,对于细菌的生长增殖、毒性和逆境耐受等都有重要影响。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型人-鱼共患条件致病菌,会在水产养殖中造成巨大危害。本研究从维氏气单胞菌基因组DNA中扩增hfq基因上、下游序列,连接到pRE112质粒中,构建敲除质粒pRE112-Δhfq,通过接合转移将敲除质粒从大肠杆菌感受态转入维氏气单胞菌后,基于同源重组原理,利用蔗糖压力筛选得到hfq基因敲除的维氏气单胞菌突变株C4-Δhfq。生长曲线分析表明,hfq基因敲除显著延缓维氏气单胞菌的生长速率,同时,回补hfq使细菌恢复生长。本研究获得的hfq基因敲除菌株,可为进一步研究维氏气单胞菌中Hfq调控因子的功能及其调控机制提供一定帮助。 展开更多
关键词 维氏气单胞菌 hfq基因 同源重组 基因敲除
单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建 预览
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作者 舒加乐 郑琳琳 《湖北畜牧兽医》 2019年第5期5-7,共3页
利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突... 利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 单增李斯特菌 NrdD基因 突变株 同源重组
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端粒延长技术在癌症治疗中的应用 预览
9
作者 张柄德 《当代化工研究》 2019年第1期57-59,共3页
癌症已经成为现代人最为恐慌的疾病,它的难预防、难诊断、难治疗是当前世界上最为头疼的难题。我国平均每年患癌人数高达三百多万,近年来受环境、食品等不良因素影响,癌症发病率逐年上升,致病患者平均年龄下降,癌症已经成为人类的头号... 癌症已经成为现代人最为恐慌的疾病,它的难预防、难诊断、难治疗是当前世界上最为头疼的难题。我国平均每年患癌人数高达三百多万,近年来受环境、食品等不良因素影响,癌症发病率逐年上升,致病患者平均年龄下降,癌症已经成为人类的头号杀手。导致癌症的罪魁祸首之一,就是端粒长度的变化和结构的稳定性。端粒长短与细胞的分裂次数息息相关,分裂次数增多则端粒长度逐渐缩小,最终细胞分裂能力下降、活性降低,逐渐走向凋亡。但在细胞分裂过程中,有些细胞会修复受损的端粒长度诱导DNA发生断裂,使正常细胞发生突变,导致癌细胞永生化。端粒延长技术的出现使人们了解了癌细胞拥有无限增殖能力的原因,本文将从端粒延长技术的作用原理出发,讨论端粒与癌细胞增殖之间的关系,并以此为靶点探究其在癌症治疗方面的作用,以期为后续癌症治疗研究提供参考。 展开更多
关键词 端粒酶 端粒延长替代机制-ALT DNA修复 同源重组 癌症治疗
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农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量 预览
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作者 陈国枝 储炬 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 2019年第7期805-810,共6页
目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系。方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA和sorB,并通... 目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系。方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA和sorB,并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量。结果筛选并验证了6株A.chrysogenum-Δpks菌株,遗传稳定,转化效率约为20%。通过发酵实验测定发现,缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70%。结论农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统,并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量。 展开更多
关键词 农杆菌转化法 顶头孢霉 聚酮合酶 同源重组 头孢菌素C
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结核分枝杆菌EF4敲除菌株的构建 预览
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作者 李明 陈润 +2 位作者 葛文雪 姚梦依 张雪莲 《微生物与感染》 2019年第3期172-179,共8页
EF4是一个由 lepA 基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道。为探索EF4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株。本... EF4是一个由 lepA 基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道。为探索EF4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株。本研究以结核分枝杆菌H37Ra全基因组DNA为模板,设计并通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增 lepA 基因左、右臂,连接到p0004S质粒,构建同源重组质粒p0004S-Δ lepA 。然后,通过噬菌体体外包装,将p0004S-Δ lepA 质粒连接到phAE159质粒,构建phAE159-Δ lepA 噬菌体包装质粒。在耻垢分枝杆菌mc 2155中大量扩增噬菌体并受结核分枝杆菌侵染进行同源重组,筛选阳性克隆,从基因组和蛋白质表达水平检测该突变株中 lepA 基因及EF4蛋白表达。PCR结果显示,敲除株基因组中 lepA 基因已被潮霉素抗性基因成功替换,蛋白免疫印迹结果显示该敲除株中无EF4表达,表明其为成功构建的Ra Δ lepA 。生长曲线分析显示,正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长趋势一致。敲除株与野生株在菌落形态上有一定差异,相比于野生株,Ra Δ lepA 菌落颜色发黄,凸起偏厚,生长过程中生物膜皱褶较少。耐胁迫能力分析显示,与野生株相比,Ra Δ lepA 耐热、抗去垢剂、抗氧化能力无显著差异,但耐酸性环境能力明显增强。本研究利用噬菌体介导的重组法成功构建了结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株,为后续研究结核分枝杆菌EF4的功能提供了重要基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 EF4 同源重组 基因敲除
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羊痘病毒活载体疫苗研究进展
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作者 何宇乾 段笑笑 +1 位作者 刘枢清 张严琦 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第15期51-54,共4页
广义的“羊痘”包括山羊痘、绵羊痘和结节皮肤病,是羊、牛等反刍动物的重要皮肤传染病,三者分别由山羊痘病毒( Goatpox virus,GTPV)、绵羊痘病毒( Sheeppox virus,SPPV)和结节皮肤病病毒( Lumpy skin disease virus,LSDV)感染引起,也可... 广义的“羊痘”包括山羊痘、绵羊痘和结节皮肤病,是羊、牛等反刍动物的重要皮肤传染病,三者分别由山羊痘病毒( Goatpox virus,GTPV)、绵羊痘病毒( Sheeppox virus,SPPV)和结节皮肤病病毒( Lumpy skin disease virus,LSDV)感染引起,也可交叉感染。GTPV、SPPV 和 LSDV 同属于痘病毒科( Poxviridae)羊痘病毒属( Capripoxvirus)成员,三者统称“羊痘病毒( capripoxvirus,CaPV)”。CaPVs基因组为两端共价闭合的线性双链 DNA,对外源基因容纳性较强。病毒本身具有强启动子,可启动外源基因的转录进而对其进行蛋白表达。因此,CaPVs 是理想的活疫苗载体,可在体内表达外源抗原并诱导特异性免疫反应。文章综述了 CaPVs 的基本特征、弱毒活疫苗及 CaPV 活载体疫苗的研究进展,以期为 CaPV 活载体疫苗的研究提供参考。 展开更多
关键词 羊痘 羊痘病毒 同源重组 活载体疫苗 免疫保护
布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定
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作者 卜昭阳 钱晶 +8 位作者 梁佳茗 王莉 屈海龙 王晓旭 杨艳玲 王秀然 闫广谋 郎需龙 王兴龙 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1533-1539,共7页
旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗... 旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域(B0419基因)并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D600值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。 展开更多
关键词 犬布鲁菌 分子标记 细菌菌壳 同源重组 候选疫苗
PARP抑制剂在三阴性乳腺癌中的作用及研究进展 预览 被引量:1
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作者 王宏宇(综述) 王伏生(审校) 《癌症进展》 2019年第9期1011-1015,共5页
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均阴性表达的乳腺癌,是一种特殊的免疫组织化学亚型,约占全部乳腺癌病理类型的15%~20%;大多数TNBC的病理类型为基底样型,具有较强的侵袭性,于诊断后3年即可出现远... 三阴性乳腺癌(TNBC)是一种雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均阴性表达的乳腺癌,是一种特殊的免疫组织化学亚型,约占全部乳腺癌病理类型的15%~20%;大多数TNBC的病理类型为基底样型,具有较强的侵袭性,于诊断后3年即可出现远处复发峰值。虽然TNBC患者的基因差异程度因种族和年龄的不同而明显不同,但是乳腺癌易感基因(BRCA)突变(包括种系突变和体细胞基因畸变)在非选择性患者中的发生率为20%~25%,尤其是基底样乳腺癌。因此,DNA修复缺陷可能成为TNBC患者的潜在治疗靶点。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARPi)利用DNA修复缺陷选择性致死同源重组(HR)修复缺陷的细胞,这种“合成致死”现象为肿瘤患者的治疗提供了新的方向,尤其是对BRCA1或BRCA2突变的患者。 展开更多
关键词 三阴性乳腺癌 同源重组 合成致死 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂 乳腺癌易感基因突变 BRCAness
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谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较 被引量:1
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作者 占米林 阚宝军 +4 位作者 张辉 董晋军 许国超 韩瑞枝 倪晔 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期278-291,共14页
【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Corynebacteriumglutamicu... 【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。 展开更多
关键词 谷氨酸棒状杆菌 CRISPR-Cpf1 Cre/loxP 同源重组 基因敲除
以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用 预览
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作者 武有聪 孟媛媛 +3 位作者 丁百兴 韩海燕 瞿涤 白丽 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期581-586,共6页
葡萄球菌是医院内感染的重要病原菌,通过同源重组敲除葡萄球菌的靶基因是研究其功能的重要方法。以质粒为基础的重组系统是外源基因序列传递,发生同源重组的重要载体。近年来,葡萄球菌基因敲除所用的重组质粒的特性取得不断改进。结合... 葡萄球菌是医院内感染的重要病原菌,通过同源重组敲除葡萄球菌的靶基因是研究其功能的重要方法。以质粒为基础的重组系统是外源基因序列传递,发生同源重组的重要载体。近年来,葡萄球菌基因敲除所用的重组质粒的特性取得不断改进。结合本课题组工作,简要综述以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用及技巧,重点比较不同质粒的特点及使用条件,对于葡萄球菌致病机制研究具有借鉴意义。 展开更多
关键词 质粒 同源重组 基因敲除 葡萄球菌
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PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的研究现状 预览
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作者 黄馨禾 董丹丹 刘倩 《医学信息》 2019年第21期26-29,共4页
ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂是目前已知对于上皮性卵巢癌(EOC)治疗效果较好的药物。高级别浆液性癌是上皮性卵巢癌中最常见的组织学亚型,由于其同源重组缺乏率(HR)较高,PARP抑制剂对其效果尤为明显。PARP抑制剂通过破坏DNA修复,促进肿瘤... ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂是目前已知对于上皮性卵巢癌(EOC)治疗效果较好的药物。高级别浆液性癌是上皮性卵巢癌中最常见的组织学亚型,由于其同源重组缺乏率(HR)较高,PARP抑制剂对其效果尤为明显。PARP抑制剂通过破坏DNA修复,促进肿瘤细胞的死亡。已有研究表明,对于伴有BRCA1/2突变或铂敏感性的复发性上皮性卵巢癌妇女,PARP抑制剂的效果十分显著。目前已有3种PARP抑制剂(Olaparib、Niraparib和Rucaparib)现在被批准用于对铂敏感和铂敏感复发患者的维持治疗。此外,PARP抑制剂也被批准用于有3种或3种以上的既往治疗的伴有BRCA1/2突变的复发性EOC患者的积极治疗。本文主要对EOC中PARP抑制剂的研究现状进行综述。 展开更多
关键词 卵巢癌 ADP核糖聚合酶 乳腺癌相关抗原 同源重组
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丙戊酸对乳腺癌MCF7细胞的放射增敏性依赖于抑癌基因p53 预览
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作者 田竹筠 杨春旺 +1 位作者 蔡祖超 凤志慧 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期257-264,共8页
目的研究抑癌基因p53对丙戊酸(VPA)所致乳腺癌细胞放射增敏性的影响及其与同源重组(HR)修复机制的关系。方法用含PLKO.1或p53 shRNA慢病毒颗粒液感染乳腺癌MCF7细胞,建立p53表达下调的同源配对MCF7细胞系,即MCF7/野生型p53(MCF7/wtp53)... 目的研究抑癌基因p53对丙戊酸(VPA)所致乳腺癌细胞放射增敏性的影响及其与同源重组(HR)修复机制的关系。方法用含PLKO.1或p53 shRNA慢病毒颗粒液感染乳腺癌MCF7细胞,建立p53表达下调的同源配对MCF7细胞系,即MCF7/野生型p53(MCF7/wtp53)和MCF7/缺欠型p53(MCF7/dp53)细胞;感染MCF7/(pDR-GFP)细胞,建立MCF7/pDR-GFP/wtp53和MCF7/pDR-GFP/dp53细胞;各分为细胞对照组、VPA组(VPA 0.5 mmol·L-1处理24 h)、电离辐射(IR,8 Gy)组和VPA+IR组(VPA 0.5 mmol·L-1预处理24 h后联用IR)。通过Western印迹实验检测P53蛋白表达水平,彗星和免疫荧光实验分别检测细胞核拖尾尾距及磷酸化组蛋白(γH2AX)焦点细胞比率,细胞克隆形成实验检测克隆形成率,流式细胞术检测HR修复效率,免疫荧光实验检测含乳腺癌易感基因1(BRCA1)蛋白和重组酶51(Rad51)蛋白焦点细胞比率。结果 Western印迹结果显示,MCF7/wtp53细胞中存在P53蛋白表达,MCF7/dp53细胞中P53蛋白表达显著降低(P<0.05)。彗星和免疫荧光结果显示,在MCF7/wtp53细胞中,与IR组相比,VPA+IR组细胞核拖尾尾距和含γH2AX焦点细胞百分率升高(P<0.05);在MCF7/dp53细胞中,与IR组相比,VPA+IR组细胞核拖尾尾距和含γH2AX焦点细胞百分率均升高(P<0.05),但仍低于MCF7/wtp53细胞VPA+IR组(P<0.05)。细胞克隆形成结果显示,在MCF7/wtp53细胞中,VPA+IR组细胞存活率低于IR组(P<0.05);在MCF7/dp53细胞中,VPA+IR组细胞存活率虽低于IR组(P<0.05),但高于MCF7/wtp53细胞VPA+IR组(P<0.05)。流式细胞术结果显示,在MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞中,VPA组HR效率低于细胞对照组(P<0.05);在MCF7/pDR-GFP/dp53细胞中,VPA组HR效率低于细胞对照组(P<0.05),但仍高于MCF7/pDRGFP/wtp53细胞VPA组(P<0.05)。免疫荧光结果显示,在MCF7/wtp53细胞中,VPA+IR组含BRCA1和Rad51焦点细胞百分率均低于IR组(P<0.05);在MCF7/dp53细胞中,VPA+IR组含BRCA1和Rad51焦点细胞百分率均低于IR组(P<0.05),但仍高于MCF7/wtp53细胞VPA+IR组(P<0.0 展开更多
关键词 乳腺癌细胞 丙戊酸 抑癌基因P53 电离辐射 同源重组
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正选择基因无启动子的供体质粒pN(CDS)(N2)-R的构建及应用
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作者 王英泽 曹晴晴 +4 位作者 马文惠 王凤利 薛巍 王晨晨 杜朝 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期465-472,共8页
为提高对发生基因编辑细胞的筛选效率,本研究构建了具备正负筛选功能的供体质粒pN(CDS)(N2)-R,其正选择基因是无启动子NeoR,负选择基因是能自主表达的RED。利用该质粒和CRISPR-Cas9系统对小鼠B16细胞FasL进行编辑。G418筛选2周,获得混... 为提高对发生基因编辑细胞的筛选效率,本研究构建了具备正负筛选功能的供体质粒pN(CDS)(N2)-R,其正选择基因是无启动子NeoR,负选择基因是能自主表达的RED。利用该质粒和CRISPR-Cas9系统对小鼠B16细胞FasL进行编辑。G418筛选2周,获得混合克隆。镜下观察显示,混合克隆质量较高。junction PCR结果表明,有基因编辑发生。DNA测序结果表明,NeoR准确插入靶位点。细胞杀伤实验表明,FasL功能被有效敲除。该供体质粒的多克隆位点,充分利用同尾酶酶切位点,因而具有广泛的适用性。综上所述,在对各种位点进行编辑时,使用该供体质粒有助于混和克隆的筛选。 展开更多
关键词 供体质粒 基因编辑 同源重组 FASL
单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析 预览
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作者 赵莹莹 贾艳艳 +5 位作者 杜付玉 余祖华 廖成水 何雷 李银聚 张春杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期509-513,共5页
为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果... 为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。 展开更多
关键词 单增李斯特菌 hly基因 安全性 基因缺失 同源重组
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