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可调控表达人博卡病毒1型非结构蛋白NS1稳定细胞系的建立及其反式转录激活作用初探
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作者 朱记平 刘媛 +2 位作者 骆茹梦 冯小婷 李毅 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1126-1134,共9页
人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构... 人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构蛋白NS1的稳定细胞系。构建NS1重组慢病毒质粒(含可调控启动子),应用转染试剂将NS1重组慢病毒质粒转染至HEK293T细胞。通过嘌呤霉素筛选抗性细胞、多西环素诱导NS1表达,建立可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系,利用荧光标记蛋白和Western blotting检测,确定NS1蛋白的表达。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒,分析NS1的反式转录激活活性。结果表明NS1蛋白可在建立的细胞系中稳定表达,且稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性,为进一步研究非结构蛋白NS1的功能及人博卡病毒致病机理奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 人博卡病毒1型 NS1 稳定表达细胞系 反式转录激活
HBV X蛋白真核表达质粒的构建及其对反式转录激活作用的影响 被引量:1
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作者 杨益大 郑临 +1 位作者 杨芊 马亦林 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期 222-224,共3页
目的构建HBV X蛋白真核表达质粒并了解其对反式转录激活作用的影响.方法用亚克隆方法构建HBV X蛋白真核表达质粒,以氯霉素乙酰转移酶转化率分析(CAT试验)揭示HBX蛋白的反式转录激活作用.结果 HBV X蛋白真核表达质粒转染HepaG2 细胞后,以... 目的构建HBV X蛋白真核表达质粒并了解其对反式转录激活作用的影响.方法用亚克隆方法构建HBV X蛋白真核表达质粒,以氯霉素乙酰转移酶转化率分析(CAT试验)揭示HBX蛋白的反式转录激活作用.结果 HBV X蛋白真核表达质粒转染HepaG2 细胞后,以Western Blot 检测发现2 μg、5 μg和10 μg的p5SGUTPLHBXDNA均能有效表达;CAT试验揭示2 μg、5 μg、10 μg的p5SGUTPLHBXDNA对报道基因pHE2×CAT的14C-标记乙酰化氯霉素转化率分别为(45.5 ±25.9)%、(65.6±14.4)%和(68.8±19.7)%.结论本结果为进一步研究HBV X蛋白的反式转录激活作用打下了基础. 展开更多
关键词 HBV X蛋白 真核表达 质粒 乙型肝炎 反式转录激活
人类免疫缺陷病毒-反式转录激活因子蛋白在心血管疾病中的作用研究现状 被引量:1
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作者 孙桂元 蒋雅楠 +3 位作者 张良栓 许颖 冯强 白云龙 《中国临床药理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第18期1729-1732,共4页
人免疫缺陷病毒(HIV)-反式转录激活因子(Tat)蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基因所编码的一种反式转录激活因子,在HIV复制和HIV感染相关的扩张型心肌病、动脉粥样硬化、冠心病和长QT间期综合征等心血管系统疾病的发生发展中起... 人免疫缺陷病毒(HIV)-反式转录激活因子(Tat)蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基因所编码的一种反式转录激活因子,在HIV复制和HIV感染相关的扩张型心肌病、动脉粥样硬化、冠心病和长QT间期综合征等心血管系统疾病的发生发展中起重要调控作用。HIV-Tat蛋白的蛋白转导域具有穿膜特性,可将外源性生物学分子携带进入多种哺乳动物细胞,且不具有细胞毒性。为此HIV-Tat蛋白的这一功能可应用到药物转运及疾病治疗等领域,这为生物学研究开辟了一条新途径。本文对HIV-Tat蛋白在HIV相关的心血管系统疾病中的作用和机制以及在医学相关领域中的研究现状进行了综述。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病 人免疫缺陷病毒-反式转录激活因子蛋白 心血管系统疾病
重组蛋白 PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究 预览 被引量:4
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作者 刘莲 余榕捷 +4 位作者 戴云 曾智星 郭晓令 季青山 钟敬祥 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期135-140,共6页
目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒pKYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27... 目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒pKYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素( FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTD-HSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。 展开更多
关键词 蛋白转导域 热休克蛋白27 反式转录激活因子 晶状体上皮细胞
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融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白表达及对血迷路屏障作用
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作者 杜延顺 李颖 +2 位作者 杨军 张伟 张罗 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2015年第11期578-580,共3页
目的表达并纯化融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白(GST-transactivator of transcription-enhanced green f luorescence protein,GSTTAT-EGF P),并研究其是否能跨越血迷路屏障(blo o d labyrinth barrir,BLB)进入... 目的表达并纯化融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白(GST-transactivator of transcription-enhanced green f luorescence protein,GSTTAT-EGF P),并研究其是否能跨越血迷路屏障(blo o d labyrinth barrir,BLB)进入内耳。方法用基因重组技术将编码TAT蛋白11个氨基酸短肽基因和EGFP基因重组,分别构建p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-EGFP表达载体,将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,用GST树脂柱亲和层析纯化融合蛋白。将10只豚鼠随机分为两组,分别肌肉注射GST-EGFP和GST-TATEGFP;2~4 h后豚鼠经麻醉、断头取耳蜗等组织。用2%多聚甲醛固定,耳蜗经10%EDTA(p H7.4)脱钙、OCT包埋,制备颞骨冰冻切片,采用免疫组化技术和荧光显微镜技术观察TAT短肽是否可以携带分子量55 k D的GST-EGFP跨越BLB进入内耳。结果 GST-TAT-EGFP进入内耳后主要分布于血管纹和螺旋器,而对照组EGFP不能进入内耳。结论短肽TAT可转导大分子蛋白通过BLB进入内耳,为外源性蛋白药物治疗内耳疾病提供新手段。 展开更多
关键词 重组融合蛋白质类 迷路 血迷路屏障 反式转录激活因子蛋白 增强型绿色荧光蛋白
TAT-LHRH-壳聚糖/siRNA纳米复合物与巨噬细胞的相互作用 被引量:1
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作者 邵楠 董霞 +3 位作者 刘兰霞 朱敦皖 张海玲 冷希岗 《生物医学工程与临床》 CAS 2015年第4期339-344,共6页
目的:评价反式转录激活因子短肽-促黄体生成激素释放激素(TAT-LHRH)修饰的低分子质量壳聚糖(LMWC)作为siRNA载体的生物安全性。方法利用琥珀亚酰胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯(SPDP)共价连接TAT-LHRH双功能肽及LMWC(相对分子质量500... 目的:评价反式转录激活因子短肽-促黄体生成激素释放激素(TAT-LHRH)修饰的低分子质量壳聚糖(LMWC)作为siRNA载体的生物安全性。方法利用琥珀亚酰胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯(SPDP)共价连接TAT-LHRH双功能肽及LMWC(相对分子质量5000~8000;脱乙酰化程度90%),合成TAT-LHRH-壳聚糖(TLC)载体,并与未修饰的LMWC分别和非编码siRNA(序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)混合,合成TLC/siRNA纳米复合物和LMWC/siRNA纳米复合物。利用凝胶阻滞及光散射实验观察纳米粒的表征,并通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术及体内巨噬细胞吞噬实验分析纳米复合物诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7所引起的细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)的变化,以及对人巨噬细胞吞噬活性的影响。结果与未进行任何修饰的壳聚糖相比,TLC具有更好的siRNA结合能力(N/P比分别为1∶2、1∶1、2∶1、5∶1和10∶1)。以不同N/P(10∶1、20∶1)与siRNA形成纳米复合体后,其粒径分布于90~150 nm,zeta电位稳定在+2.7~+19.3 mV。含200 nmol/L siRNA的TLC/siRNA纳米复合物在24 h内未引起上述细胞因子的明显释放。体内与体外的巨噬细胞吞噬实验证明,相比未修饰壳聚糖/siRNA复合物而言,TLC/siRNA纳米复合物被巨噬细胞摄入量更高,但两者均未对吞噬活性和细胞因子生成产生明显影响。结论 TLC无明显免疫毒性,是一种有应用前景的siRNA载体。 展开更多
关键词 siRNA运输 肝癌 反式转录激活因子短肽(TAT) 促黄体生成激素释放激素(LHRH) 壳聚糖 巨噬细胞
反式转录激活因子蛋白转导技术在缺血性脑卒中中的应用进展 被引量:2
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作者 李立亚 钟海星 王强 《国际麻醉学与复苏杂志》 CAS 2014年第1期60-63,71共5页
背景蛋白转导结构域(protein transducer domain,PTD)使大分子药物可以通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),受到了日益广泛地关注。目的以应用最为广泛的反式转录激活因子(transactivator of transcription,TAT)蛋白转导... 背景蛋白转导结构域(protein transducer domain,PTD)使大分子药物可以通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),受到了日益广泛地关注。目的以应用最为广泛的反式转录激活因子(transactivator of transcription,TAT)蛋白转导结构域为核心,通过总结其在神经系统疾病中的作用及机制,为相关领域研究提供参考。内容TAT蛋白转导结构域是人类I型免疫缺陷病毒(human immunodeficiencv virus-1,HIV-1)的功能性结构域。目前已与红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derivedn eurotrophic factor,GDNF)、Nogo-A细胞外肽140(nogo extracellular peptide1-40,NEP1-40)、抗凋亡蛋白等多种功能性蛋白重组融合,不仅使其透过BBB发挥神经保护作用,还减少了药物副作用。尤其是突触后致密物蛋白-95(synapses dense protein-95,PSD-95)融合形成的TAT-NR289c可减少脑梗死容积,改善神经功能,已完成Ⅱ期临床试验。趋向TAT蛋白转导技术在神经系统疾病的治疗中具有显著优势,为临床治疗脑卒中的新药研发提供了新的方向。 展开更多
关键词 蛋白转导结构域 反式转录激活因子 融合蛋白 神经保护
反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响
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作者 杨熹 李海杰 +4 位作者 王桂华 陈成 杨锐 龚建平 胡俊波 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期239-241,共3页
目的 观察反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸(TAT-N24)穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响.方法 对结直肠癌细胞Lovo过表达p55PIK和/或同时给予p55PIK的特异性抑制剂TAT-N24后,通过Western blot法检测乏氧诱导因子-1α的表达,通... 目的 观察反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸(TAT-N24)穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响.方法 对结直肠癌细胞Lovo过表达p55PIK和/或同时给予p55PIK的特异性抑制剂TAT-N24后,通过Western blot法检测乏氧诱导因子-1α的表达,通过双荧光素酶报告系统检测血管内皮生长因子-A的启动子活性,并用酶联免疫吸附试验检测其蛋白分泌,最后通过体外血管形成实验检测p55PIK及TAT-N24对结直肠癌血管形成的影响.结果 过表达p55PIK促进结直肠癌细胞株Lovo中乏氧诱导因子-1α的表达,进而增强血管内皮生长因子-A的启动子活性(p55PIK组比对照组,常氧:9.1±1.1比1.0±0.2,乏氧:14.5 ±1.6比1.0±0.3),并且促进其在培养基上清中的分泌[p55PIK组比对照组,常氧:(412±23) mg/L比(150±18) mg/L,乏氧:(859±203) mg/L比(233±12) mg/L],而且其条件培养基可促进脐静脉内皮细胞形成血管,而TAT-N24可拮抗上述过程,抑制结直肠癌的血管形成.结论 p55PIK可促进结直肠癌的血管形成,而TAT-N24作为其特异性抑制剂,可抑制结直肠癌的血管形成. 展开更多
关键词 结直肠癌 p55PIK 反式转录激活因子 血管形成 血管内皮生长因子
pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 预览
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作者 张晓红 夏春波 +2 位作者 刘源劼 蒋常文 门楠 《山东医药》 CAS 北大核心 2011年第7期 35-37,共3页
目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE... 目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。 展开更多
关键词 免疫缺陷病毒-反式转录激活因子 X连锁调亡抑制蛋白 大肠杆菌 蛋白表达
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