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蓝舌病病毒10质粒反向遗传操作系统的建立 预览
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作者 郭运泽 孙恩成 +3 位作者 徐青元 步志高 吴东来 王凤龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期234-238,共5页
为建立蓝舌病病毒(BTV) 10质粒反向遗传操作系统,本研究将BTV16型BN96/16株10个基因节段分别克隆至pS111载体相应的酶切位点,构建10个重组质粒转染BSR细胞,拯救获得重组病毒,命名为rBTV-16。测序结果显示,拯救病毒rBTV-16与其亲本病毒wt... 为建立蓝舌病病毒(BTV) 10质粒反向遗传操作系统,本研究将BTV16型BN96/16株10个基因节段分别克隆至pS111载体相应的酶切位点,构建10个重组质粒转染BSR细胞,拯救获得重组病毒,命名为rBTV-16。测序结果显示,拯救病毒rBTV-16与其亲本病毒wtBTV-16的核苷酸序列完全相同;经电镜观察,可见典型形态的环状病毒属病毒粒子;间接免疫荧光试验结果显示,rBTV-16能够感染细胞;病毒基因组检测结果显示,rBTV-16各个基因节段的长度与亲本病毒完全一致;病毒生长曲线的测定结果显示,rBTV-16与亲本病毒具有一致的复制特性。本研究建立的10质粒系统比传统体外转录拯救系统的操作过程简便,提高了拯救病毒的效率,为进一步深入研究BTV的致病机理奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 反向遗传 质粒系统
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表达羊口疮病毒B2L蛋白重组小反刍兽疫病毒的拯救 预览
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作者 刘拂晓 孙成友 +1 位作者 李岭 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2019年第10期71-77,共7页
羊口疮(传染性脓疱)和小反刍兽疫的病原体分别为羊口疮病毒(orf virus,ORFV)和小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)。如果通过反向遗传技术进行基因修饰,PPRV可成为表达外源蛋白的有效载体。ORFV含有1个具有高免疫... 羊口疮(传染性脓疱)和小反刍兽疫的病原体分别为羊口疮病毒(orf virus,ORFV)和小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)。如果通过反向遗传技术进行基因修饰,PPRV可成为表达外源蛋白的有效载体。ORFV含有1个具有高免疫原性的B2L蛋白。本研究首先构建了含B2L基因开放阅读框的重组PPRV cDNA clone,然后通过反向遗传技术,拯救了一株表达B2L蛋白的重组PPRV。试验表明,该重组病毒的生长动力学类似其母源病毒;Western blot和质谱分析表明,该重组PPRV可在细胞内表达B2L蛋白。该研究为羊口疮和小反刍兽疫二联疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 重组小反刍兽疫病毒 羊口疮病毒 反向遗传 B2L蛋白 蛋白表达
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狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株构建及特性研究
3
作者 杨金金 陈腾 +5 位作者 张艳艳 齐宇 周鑫韬 米丽娟 张守峰 扈荣良 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第19期73-77,180共6页
为了探究狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)基因间隔区对狂犬病病毒生物学特性的影响,试验以狂犬病病毒CVS-11株为母本株,将其基因间隔区碱基均替换为胞嘧啶和胸腺嘧啶,分段扩增后与真核表达载体进行同源重组,运用反向遗传技术进行重组病... 为了探究狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)基因间隔区对狂犬病病毒生物学特性的影响,试验以狂犬病病毒CVS-11株为母本株,将其基因间隔区碱基均替换为胞嘧啶和胸腺嘧啶,分段扩增后与真核表达载体进行同源重组,运用反向遗传技术进行重组病毒拯救,经过菌液PCR鉴定和直接免疫荧光检测获得重组病毒rCVS11-2222。结果表明:重组病毒基因组稳定,重组病毒rCVS11-2222在细胞中的复制表现出与CVS-11株相似的特点;小鼠存活率显著降低。说明狂犬病病毒CVS-11株基因间隔区的缩短增强了原毒株的致病力。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 基因间隔区 反向遗传 病毒拯救 重组病毒 致病性
糖基化影响H9N2亚型禽流感病毒在小鼠体内复制能力和对α-2,6唾液酸受体的亲和性
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作者 谭刘刚 鲁梅 +7 位作者 黄庆华 艾武 亓丽红 吴家强 崔宁 黄艳艳 杨少华 许传田 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期88-92,125共6页
利用反向遗传操作技术验证了H9N2亚型禽流感病毒流行株(A/Chicken/Shandong/903,简称903)HA蛋白200和295位氨基酸糖基化可以影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,同时也能影响病毒在小鼠体内复制能力。固相ELISA结果显示,突变病毒N200Q(... 利用反向遗传操作技术验证了H9N2亚型禽流感病毒流行株(A/Chicken/Shandong/903,简称903)HA蛋白200和295位氨基酸糖基化可以影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,同时也能影响病毒在小鼠体内复制能力。固相ELISA结果显示,突变病毒N200Q(N→Q)和N295Q(N→Q)都能降低病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性。荧光定量结果显示,突变病毒N295Q主要在小鼠肺脏、脾脏和肾脏中复制(M基因拷贝分别为903野毒的56,64,39倍);而突变病毒N200Q主要在小鼠肾脏中复制(M基因拷贝分别为903野毒的936倍)。本试验为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子机制提供依据。 展开更多
关键词 反向遗传 糖基化 H9N2禽流感病毒 跨种传播
表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒的构建、鉴定与免疫反应 被引量:1
5
作者 傅倩芸 燕丽娜 +5 位作者 赵忠欣 王化磊 杨松涛 郑文文 郑学星 王志玉 《军事医学》 CSCD 北大核心 2018年第5期348-352,共5页
目的构建表达发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)Gn蛋白的重组狂犬病病毒,并研究重组病毒的免疫反应。方法将SFTSV的保护性抗原Gn蛋白基因插入至狂犬病病毒(RABV)SAD株基因组的假基因区,通过反向遗传技术拯救获得重组病毒SAD—Gn... 目的构建表达发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)Gn蛋白的重组狂犬病病毒,并研究重组病毒的免疫反应。方法将SFTSV的保护性抗原Gn蛋白基因插入至狂犬病病毒(RABV)SAD株基因组的假基因区,通过反向遗传技术拯救获得重组病毒SAD—Gn株。对SAD—Gn进行生物学特性鉴定,并将SAD—Gn株免疫小鼠,测其血清中和抗体效价。结果通过酶切、RT—PCR和荧光抗体染色鉴定,证明SAD—Gn株基因组中含有Gn基因,且能正确表达Gn蛋白。该重组病毒细胞适应性好,滴度可达3.3×108FFU/ml。免疫小鼠后,可同时诱导产生高效价的抗RABV和SFTSV的中和抗体。结论成功构建了重组病毒SAD—Gn,并诱导小鼠产生针对RABV和SFTSV的中和抗体.为进一步研制预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征的二联疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 发热伴血小板减少综合征病毒 Gn蛋白 反向遗传 二联疫苗
携带GFP基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究 预览 被引量:1
6
作者 刘翠 殷相平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第7期1965-1971,共7页
本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒,以便更快速、准确地检测疫苗效价。利用基因重组技术构建含有GFP基因的重组质粒,并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救,在Vero细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行Western blot... 本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒,以便更快速、准确地检测疫苗效价。利用基因重组技术构建含有GFP基因的重组质粒,并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救,在Vero细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行Western blotting试验,检测外源蛋白GFP的表达情况,测定一步法生长曲线,比较与原始毒株的生物学特性差异。结果显示,本试验成功拯救出携带GFP基因的重组狂犬病病毒毒株SAD-GFP;Western blotting试验结果显示,重组病毒可表达GFP,且随着病毒感染时间的延长,蛋白表达增多;病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响,重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异;传代后GFP仍可在病毒中稳定表达。在连续传代过程中,本试验成功拯救出SAD-GFP重组毒株,GFP基因并未丢失,且蛋白表达量并未降低,证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达,且对病毒生长特性并未产生影响。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 反向遗传 GFP
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传染性法氏囊病病毒基因组A节段3'-UTR对病毒复制影响的研究 预览
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作者 杨搏 陈泽华 +9 位作者 韩春燕 么帅 祁小乐 高立 高玉龙 刘长军 张艳萍 杨玉莹 王永强 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期177-180,185共5页
为探究传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A节段3'-UTR是否影响IBDV的复制,本实验应用融合PCR技术将IBDV弱毒Gt株A节段的3'-UTR替换为超强毒Gx株的相应区段,并利用反向遗传操作系统拯救嵌合病毒rGt-Gx3'UTR,对拯救病毒进行鉴定。结果... 为探究传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A节段3'-UTR是否影响IBDV的复制,本实验应用融合PCR技术将IBDV弱毒Gt株A节段的3'-UTR替换为超强毒Gx株的相应区段,并利用反向遗传操作系统拯救嵌合病毒rGt-Gx3'UTR,对拯救病毒进行鉴定。结果显示嵌合病毒拯救成功,Gt株的RNA依赖的RNA聚合酶既能识别Gt株的3'-UTR,也能识别超强毒Gx株的3'-UTR。通过比较嵌合病毒与亲本病毒的体外复制曲线,表明3'-UTR能够影响IBDV的复制。3'-UTR二级结构的预测结果表明其可能是以特定的二级结构而非一级序列发挥其功能。本研究为认识IBDV复制特点奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 反向遗传 3'-UTR 病毒复制
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鸽新城疫病毒毒力致弱株的拯救及免疫原性分析 预览
8
作者 蒋艳玉 赵莎莎 +4 位作者 孙娜娜 孙军峰 孔宪刚 刘胜旺 刘怀然 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期1037-1042,共6页
为快速获得鸽新城疫(ND)疫苗株,本研究构建了鸽NDV/Pi/CH/LHLJ/110822株反向遗传操作平台,拯救得到2株亲本病毒株r0822-21A、r0822-17A,以及1株F蛋白裂解位点突变为La Sota相应位点的病毒株r0822-FCS。HA/HI试验结果显示r0822-FCS毒力... 为快速获得鸽新城疫(ND)疫苗株,本研究构建了鸽NDV/Pi/CH/LHLJ/110822株反向遗传操作平台,拯救得到2株亲本病毒株r0822-21A、r0822-17A,以及1株F蛋白裂解位点突变为La Sota相应位点的病毒株r0822-FCS。HA/HI试验结果显示r0822-FCS毒力已致弱,将其灭活乳化后免疫SPF鸡可刺激其产生高滴度HI抗体。安全性评价试验结果显示其安全性良好,但接种14 d时SPF鸡的HI抗体滴度仅达3 log2,对基因Ⅶ型鸡源强毒CK/CH/HLJ/01/06攻毒保护率小于50%;免疫效力试验显示,r0822-FCS分别以105EID50/0.1 mL、106EID50/0.1 mL剂量接种14日龄SPF鸡,未检测到明显的抗体阳转。基因组测序分析结果显示,3株拯救病毒均在L基因的不同位置与新城疫病毒(NDV) V4株高度同源的外源基因片段重组,推测在实验条件下的细胞内拯救病毒过程中,病毒L基因与辅助质粒中的L基因发生了随机同源重组。综上所述,本研究获得的r0822-FCS株作为弱毒疫苗效果不佳,但可作为鸽ND灭活疫苗候选株。此外,本研究首次报道了反向遗传操作实验条件下,NDV基因组与V4株辅助质粒之间发生了基因重组,且L基因是决定病毒复制的关键基因。此次基因重组现象应为实验条件下的偶发事件,其机制和风险尚需后继实验研究分析。 展开更多
关键词 鸽新城疫病毒 反向遗传 致弱毒株 L基因重组
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Key elements for designing and performing a CRISPR/Cas9-based genetic screen
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作者 Wanjing Shang Fei Wang +1 位作者 Gaofeng Fan Haopeng Wang 《遗传学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2017年第9期439-449,共11页
Reverse genetic screens are invaluable for uncovering gene functions, but are traditionally hampered by some technical limitations. Over the past few years, since the advent of the revolutionary CRISPR/Cas9 technology... Reverse genetic screens are invaluable for uncovering gene functions, but are traditionally hampered by some technical limitations. Over the past few years, since the advent of the revolutionary CRISPR/Cas9 technology, its power in genome editing has been harnessed to overcome the traditional limitations in reverse genetic screens, with successes in various biological contexts. Here, we outline these CRISPR/Cas9-based screens, provide guidance on the design of effective screens and discuss the potential future directions of development of this field. 展开更多
关键词 屏幕设计 反向遗传 基因功能 基因组 技术 传统 生物
H7N9亚型流感候选疫苗株的构建及免疫效力试验 预览 被引量:4
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作者 蒋文明 侯广宇 +5 位作者 李金平 王素春 袁万哲 王灏 程善菊 陈继明 《中国动物检疫》 CAS 2017年第6期86-89,共4页
近期的禽流感主动监测结果表明,我国部分H7N9亚型流感病毒已突变为高致病性毒株。为预防H7N9流感在禽群中引发大流行,本研究利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,分别以H7N9亚型流感弱毒A/chick... 近期的禽流感主动监测结果表明,我国部分H7N9亚型流感病毒已突变为高致病性毒株。为预防H7N9流感在禽群中引发大流行,本研究利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,分别以H7N9亚型流感弱毒A/chicken/SH/3277/2016(S3277)和强毒A/chicken/SD/GDRZ/2017(GDRZ)的基因组为模板,扩增HA及NA基因,并对GDRZHA基因进行修饰,去除裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性流感病毒的分子特征,最终成功构建了H7N9流感疫苗候选株rS3277和rGDRZ。将两株病毒与自然分离的H7N3弱毒株A/duck/ZJ/1208/2009(ZJ1208)同时作为候选疫苗株,进行免疫效力试验。结果表明,rS3277、rGDRZ和ZJ1208灭活疫苗免疫SPF鸡21d后,针对GDRZ的平均HI抗体效价分别达到7.2log2、10.1log2和6.2log2。免疫攻毒保护试验结果表明,上述3种灭活疫苗均可100%保护SPF鸡免受H7N9强毒攻击。本研究所构建的rGDRZ重组候选疫苗株可为H7N9高致病性流感的防控提供支持。 展开更多
关键词 流感病毒 H7N9 强毒 反向遗传 疫苗
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猫杯状病毒2280株反向遗传系统的构建 预览 被引量:1
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作者 祖少坡 田进 +7 位作者 吴红霞 孙雪 刘家森 黄倩倩 刘春国 刘大飞 曲连东 师东方 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期20-23,共4页
为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为... 为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为3段分别进行RT-PCR扩增,通过酶切依次克隆于p OK-12载体中,构建FCV基因组全长c DNA重组质粒。以其为模板经体外转录制备其全长基因组RNA,并在5'末端加帽,转染CRFK细胞,24 h后出现典型的细胞病变。提取出现细胞病变的病毒液的总RNA制备c DNA模板,PCR扩增FCV遗传标记片段并进行XbaⅠ酶切鉴定分析,表明拯救的病毒为FCV重组病毒。而且拯救的病毒生长动力学与亲本病毒无明显差异。本实验为进一步研究FCV的生物学特性和致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 猫杯状病毒 反向遗传 RT-PCR
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第2.3.2.1分支H5亚型禽流感变异株候选疫苗株的构建及免疫效力试验 预览
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作者 蒋文明 李金平 +5 位作者 侯广宇 王素春 袁万哲 孙文博 彭程 陈继明 《中国动物检疫》 CAS 2017年第9期79-82,共4页
第2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒(AIV)抗原性目前已发生显著变异。为应对变异株可能引发的流行,利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N1亚型AIVA/duck/JS/ZJ/2016(H5N1)(ZJ,第2.3.2.1... 第2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒(AIV)抗原性目前已发生显著变异。为应对变异株可能引发的流行,利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N1亚型AIVA/duck/JS/ZJ/2016(H5N1)(ZJ,第2.3.2.1d分支)、A/Chicken/SD/YT/2015(H5N1)(YT,第2.3.2.1e分支)的基因组为模板,扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行修饰,去除裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征,成功构建了第2.3.2.1分支H5N1亚型AIV疫苗候选株rZJ和rYT。抗原性分析显示,rZJ和rYT与Re-6疫苗株之间的抗原性已有显著差异。免疫效力试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗免疫21d的平均HI抗体效价分别达到8.8log2和8.9log2,说明重组疫苗具备良好的免疫原性。免疫攻毒保护试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源H5N1病毒100%的保护,而针对第2.3.2.1分支的Re-6疫苗仅能提供大约40%和30%的保护。利用反向遗传技术构建的rZJ和rYT重组候选疫苗株为该分支病毒的防控提供了技术支持。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5 第2.3.2.1分支 变异株 反向遗传 疫苗
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表达不同致病型S基因重组鸡传染性支气管炎病毒的细胞嗜性研究 被引量:1
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作者 姜逸 周生 +3 位作者 俞燕 唐梦君 程旭 赵秀美 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期738-744,共7页
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气... 鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气管环以及原代鸡肾细胞(CK)上培养时组织细胞的嗜性差异进行了比较,结果发现rIBYZ与rH120在CK上的亲嗜性存在显著差异。在此基础之上,课题组借助前期建立的IBV反向遗传操作系统,将H120疫苗株和IBYZ株的S基因进行交叉替换,成功拯救获得2株重组病毒rH120-S/YZ和rIBYZ-S/H120。通过比较不同毒株感染CK细胞后的病变、特异性免疫荧光的强度以及病毒的增殖曲线,表明刺突蛋白(S)在IBV适应CK细胞过程中发挥决定性作用。本文揭示了S蛋白对细胞嗜性的影响,为进一步探索IBV适应细胞的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒(IBV) 刺突蛋白(S) 细胞嗜性 反向遗传
轮状病毒反向遗传系统构建策略研究进展 预览 被引量:1
14
作者 闻晓波 《现代畜牧兽医》 2017年第3期52-57,共6页
反向遗传学技术在病毒的蛋白功能、基因表达调控、致病机制以及疫苗开发等诸多研究工作中具有无可比拟的优势,并且已成为常规手段。目前对于人类或者动物病毒,尤其是RNA病毒,反向遗传学技术早已经用于开展基础研究和疫苗开发。但是,对... 反向遗传学技术在病毒的蛋白功能、基因表达调控、致病机制以及疫苗开发等诸多研究工作中具有无可比拟的优势,并且已成为常规手段。目前对于人类或者动物病毒,尤其是RNA病毒,反向遗传学技术早已经用于开展基础研究和疫苗开发。但是,对于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员,反向遗传操作系统的构建进展缓慢。目前,轮状病毒的反向遗传操作多借助于辅助病毒和筛选系统来实现单一片段的修饰和替换,尚无真正意义上的反向遗传系统报道。本文就轮状病毒反向遗传操作系统的构建策略及应用的研究进展作一简要综述。 展开更多
关键词 轮状病毒 呼肠孤病毒 反向遗传 病毒拯救 双链RNA
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肠道病毒71型3D重组病毒的拯救
15
作者 白永娟 庄志超 +6 位作者 郝树彬 王莉鸿 李纯 鲁燕 赵丽 王志玉 温红玲 《山东大学学报:医学版》 北大核心 2017年第8期7-12,共6页
目的利用反向遗传技术将肠道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置换入强毒株SDLY107,拯救重组病毒,为EV71 3D蛋白的研究提供操作平台。方法利用重叠PCR的方法得到3D编码区的重组片段,T-A克隆插入p MDl9-T载体。通过双酶切、T4连接将... 目的利用反向遗传技术将肠道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置换入强毒株SDLY107,拯救重组病毒,为EV71 3D蛋白的研究提供操作平台。方法利用重叠PCR的方法得到3D编码区的重组片段,T-A克隆插入p MDl9-T载体。通过双酶切、T4连接将其置换到含有SDLY107株全长的质粒p MD19-T-107中。体外转录获得感染性RNA,转染Vero细胞,盲传3代得到重组病毒SDLY 107(1-3D),通过PCR和q RT-PCR对重组病毒进行鉴定。结果 PCR扩增得到大小为600、1 400和200 bp的3D区及其左右片段;重叠PCR扩增得到大小为2 100 bp的1-3D片段;双酶切鉴定重组质粒得到大小为7 400和2 700 bp的片段,测序结果证实3D区置换成功;感染性RNA转染Vero细胞后,接种至第3代时观察到细胞皱缩变圆,折光性增强;PCR鉴定重组病毒得到大小为226 bp的片段;q RT-PCR检测到细胞中病毒量于24 h开始缓慢增加,48 h后快速增多,至72 h后病毒量不再增长。结论成功拯救了重组病毒SDLY107(1-3D),为进一步研究3D蛋白的毒力和其在EV71致病机制中的作用提供基础。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 反向遗传 重组病毒 3D蛋白
H3N2犬流感病毒PB2 E^627K突变对小鼠致病性的影响 预览
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作者 黄三 曾伟杰 +4 位作者 张欣 郑运 王丽芳 周沛 李守军 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期346-350,355共6页
甲型流感病毒PB2蛋白627位点突变(E^627K)是影响流感病毒宿主适应性和致病性的重要因素之一。本实验室前期研究分离的H3N2亚型犬流感病毒(CIV)GD02株(A/canine/Guangdong/02/2011)PB2蛋白序列的627位点氨基酸为谷氨酸,为研究该病... 甲型流感病毒PB2蛋白627位点突变(E^627K)是影响流感病毒宿主适应性和致病性的重要因素之一。本实验室前期研究分离的H3N2亚型犬流感病毒(CIV)GD02株(A/canine/Guangdong/02/2011)PB2蛋白序列的627位点氨基酸为谷氨酸,为研究该病毒株PB2的E^627K突变对小鼠致病性的影响,本实验采用反向遗传操作技术获得r GD02,并利用定点突变技术拯救了PB2 627位点发生突变的r GD02-E^627K。通过接种小鼠比较r GD02和r GD02-E^627K对小鼠致病性的差异,评价PB2 E^627K突变对H3N2 CIV致病性的影响。结果显示,r GD02和r GD02-E^627K对小鼠均无致死性(MLD50〉10^6 EID50),对小鼠增重的影响差异均不显著,而且这两株病毒对小鼠的致病性也无明显差异。表明PB2 E^627K并未显著影响H3N2 CIV对小鼠的致病性,该研究建立的H3N2 CIV反向遗传操作平台和定点突变技术为该病毒后续的致病机理、基因功能研究及疫苗研制奠定了基础。 展开更多
关键词 犬流感 反向遗传 定点突变 E627K
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H3N2犬流感病毒PB2 D701N位点突变对小鼠致病性的影响
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作者 曾伟杰 黄三 +4 位作者 张欣 王丽芳 郑运 周沛 李守军 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第12期1528-1532,共5页
为探究PB2基因D701N突变对犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)H3N2的致病性影响,利用本实验室构建的CIV H3N2(A/canine/Guangdong/02/2011,C/GD/02)反向遗传系统和定点突变技术,获得了2株拯救病毒(原毒株:r C/GD/02,突变株:... 为探究PB2基因D701N突变对犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)H3N2的致病性影响,利用本实验室构建的CIV H3N2(A/canine/Guangdong/02/2011,C/GD/02)反向遗传系统和定点突变技术,获得了2株拯救病毒(原毒株:r C/GD/02,突变株:r C/GD/02-701N)。聚合酶活性试验结果显示,突变株的聚合酶活性显著强于原毒株(P〈0.05),说明PB2 D701N的突变能显著增强CIV H3N2聚合酶活性;病毒生长曲线显示,突变株比原毒株在MDCK细胞中的生长复制能力有所下降;小鼠致病性试验显示,两毒株均导致了小鼠的体重增长速率轻微下降,但毒株间无显著差异,且均未导致小鼠死亡。结果表明,PB2基因D701N的突变不会显著影响CIV H3N2对小鼠的致病性。 展开更多
关键词 犬流感病毒 H3N2 定点突变 反向遗传 D701N
Clade2.3.2.1c H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建
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作者 刘开拓 高如一 +7 位作者 孙文强 李娟 刘东 胡娇 顾敏 王晓泉 刘晓文 刘秀梵 《中国家禽》 北大核心 2017年第4期17-21,共5页
近年来clade2.3.2.1c中的H5N1亚型禽流感病毒的抗原性发生了很大变化,Re-6疫苗并不能对其提供有效保护。为对该分支毒株进行有效防控,研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)毒株为内部基因供体,以clade2.3.2.1c的H5N1亚型毒株A/chicken/... 近年来clade2.3.2.1c中的H5N1亚型禽流感病毒的抗原性发生了很大变化,Re-6疫苗并不能对其提供有效保护。为对该分支毒株进行有效防控,研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)毒株为内部基因供体,以clade2.3.2.1c的H5N1亚型毒株A/chicken/Jiangsu/YB7/2015(YB7)的HA和NA基因作外部供体,并删除YB7株HA中裂解位点处的多个碱性氨基酸,通过反向遗传方法成功拯救出1株重组病毒r YB7。r YB7株病毒在鸡胚和MDCK细胞上均有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。本实验室在对毒株抗原性研究的基础上研发的疫苗候选株为防控变异的clade2.3.2.1c的禽流感病毒提供了良好的疫苗备选。 展开更多
关键词 H5N1 clade2.3.2.1c 反向遗传
麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立
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作者 张勇侠 李玫颖 +4 位作者 陈宗香 李竹石 杨小勇 范凤鸣 刘兰军 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期565-571,共7页
建立麻疹病毒沪191株(MV-_(S191))反向遗传系统。提取MV-_(S191)的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-_(S191)全长反基因组,并分别在其3′端和5′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头... 建立麻疹病毒沪191株(MV-_(S191))反向遗传系统。提取MV-_(S191)的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-_(S191)全长反基因组,并分别在其3′端和5′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头核酸酶序列(HamRZ),克隆到pT7-MCS载体,获得pT7MV_(S191)。在MV-_(S191)的P-M基因间区域插入绿色荧光蛋白(GFP),获得pT7MV_(S191)-ATU-GFP,同时构建表达麻疹病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的3个辅助质粒。将pT7MV_(S191)、pT7MV_(S191)-ATU-GFP分别与辅助质粒通过脂质体介导共转染BSRT7细胞,热休克3h。转染3d后,取上清,感染Vero-SLAM细胞。经RT-PCR、显微镜检测绿色荧光蛋白表达及合胞体形成,在该系统中成功拯救到两种有感染活性的病毒。成功建立了MV-_(S191)的反向遗传系统,为以麻疹病毒为载体进行新疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 MV-S191 反向遗传 T7RNA聚合酶 绿色荧光蛋白(GFP)
副黏病毒反向遗传研究进展 预览
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作者 冉旭华 刘阳阳 闻晓波 《现代畜牧兽医》 2016年第10期53-59,共7页
反向遗传学是对已知的生物基因序列进行适当的修饰和改造后并获取相应的表型,进而研究基因的变化对表型的影响等。副黏病毒属于单股负RNA病毒,其反向遗传研究对其病毒蛋白的功能、致病机理及重组病毒的开发利用具有重要的研究价值,... 反向遗传学是对已知的生物基因序列进行适当的修饰和改造后并获取相应的表型,进而研究基因的变化对表型的影响等。副黏病毒属于单股负RNA病毒,其反向遗传研究对其病毒蛋白的功能、致病机理及重组病毒的开发利用具有重要的研究价值,本文综述了副黏病毒反向遗传近年来的研究进展,为副黏病毒及单股负RNA病毒的深入研究提供参考。 展开更多
关键词 反向遗传 副黏病毒 致病机制 病毒拯救
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