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菜豆再生体系及遗传转化体系研究进展 预览
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作者 王焕丽 刘大军 +4 位作者 冯国军 刘畅 杨晓旭 范有君 闫志山 《中国农学通报》 2019年第16期69-76,共8页
菜豆分子育种及功能基因组学分析需要高效稳定的再生体系和遗传转化体系。归纳了近年来国内外菜豆再生体系及遗传转化体系的研究进展。首先阐述了菜豆再生方法及研究现状,其中包括基于器官发生和体细胞胚发生不同途径菜豆再生体系的建... 菜豆分子育种及功能基因组学分析需要高效稳定的再生体系和遗传转化体系。归纳了近年来国内外菜豆再生体系及遗传转化体系的研究进展。首先阐述了菜豆再生方法及研究现状,其中包括基于器官发生和体细胞胚发生不同途径菜豆再生体系的建立和相关的影响因素。其次概括了农杆菌介导法在菜豆遗传转化方面的研究进展,并分析了影响农杆菌介导遗传转化效率的主要因素,包括受体外植体类型和外植体损伤、农杆菌菌株及菌液浓度、共培养条件(时间、温度、光照时间)、乙酰丁香酮浓度等。然后叙述了有关基因枪介导菜豆遗传转化的研究进展。最后对目前菜豆再生体系和遗传转化体系存在的难题进行了总结,同时对今后研究的方向和思路做出了比较可靠的趋向预测,以期为建立高效稳定的菜豆再生体系和遗传转化体系提供参考依据。 展开更多
关键词 菜豆 再生 杆菌介导转化 基因枪介导转化
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棘白菌素B高产菌株Aspergillus delacroxii转化体系的构建与优化
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作者 闵涛玲 高苹 +2 位作者 熊磊 陈昌发 胡海峰 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期981-986,共6页
Aspergillus delacroxii SIPI-W15是棘白菌素B的高产菌株,目前尚缺少相关遗传操作信息,极大地限制了其代谢机制和分子机制的研究。本研究考察了Asp. delacroxii SIPI-W15 转化过程中的主要影响因素,建立了高效的遗传转化体系: Agrobacte... Aspergillus delacroxii SIPI-W15是棘白菌素B的高产菌株,目前尚缺少相关遗传操作信息,极大地限制了其代谢机制和分子机制的研究。本研究考察了Asp. delacroxii SIPI-W15 转化过程中的主要影响因素,建立了高效的遗传转化体系: Agrobacterium tumefaciens AGL-1作为介导菌株、新鲜孢子浓度1×10^6cuf/ml、农杆菌浓度OD600 0.7、24 ℃共转化3d。在最佳转化体系下,转化效率可达96个转化子(以10^6个分生孢子计),外源基因可以稳定遗传。基于上述遗传转化技术,获得棘白菌素B产量提高22%的转化子(产量达到2468mg/L),为进一步研究棘白菌素B 生物合成的功能基因和提高其产量提供了有力手段。 展开更多
关键词 棘白菌素B ASPERGILLUS delacroxii 杆菌介导转化
希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体表型筛选及其特性分析 预览
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作者 周鹏 顾琼楠 +1 位作者 黄俊斌 郑露 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期33-39,共7页
以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株... 以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。 展开更多
关键词 希金斯刺盘孢 杆菌介导转化 突变体 致病性 插入位点
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金针菇G蛋白偶联受体基因的CRISPR/Cas9基因组编辑载体构建及转化研究
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作者 林金德 杨雪琴 +4 位作者 魏韬 郭丽琼 林俊芳 陈韵声 黄诗诗 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期349-361,共13页
通过氨基酸同源比对(Blast P)以及金针菇冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段的转录组数据分析,获得了金针菇中的两个假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2。对获得的金针菇假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、 Fvgpcr2构建了基因组编辑(CRISPR/... 通过氨基酸同源比对(Blast P)以及金针菇冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段的转录组数据分析,获得了金针菇中的两个假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2。对获得的金针菇假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、 Fvgpcr2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)的pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr1-sgRNA1/sgRNA2、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr2-sgRNA1/sgRNA2等4个表达载体。通过农杆菌介导(ATMT)将表达载体pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA转化金针菇菌丝体,采用潮霉素和头孢毒素低浓度初筛和高浓度复筛,经两段筛选获得金针菇拟转化子。经对拟转化子进行PCR鉴定、RT-qPCR检测和Western杂交验证,结果显示表达载体pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA成功整合进金针菇基因组中,FvCas9蛋白正常表达,但未得到Fvgpcr基因敲除突变体。本研究利用农杆菌介导转化法在金针菇中构建了CRISPR/Cas9敲除体系,对后续目标基因的敲除有着重要意义。 展开更多
关键词 金针菇 CRISPR/Cas9 G蛋白偶联受体 杆菌介导转化
无缝克隆方法构建玉米多基因表达载体
5
作者 赵兴彦 卢凌霄 +5 位作者 董建军 于洋 王银月 高珊 丛方志 李成军 《种子世界》 2018年第7期109-110,共2页
本实验使用无缝克隆方法构建以除草剂(GR79)作为筛选标记的抗虫(Cry1Ac)、耐旱(GhABF2)高效表达载体,通过农杆菌介导转化玉米幼胚,初步鉴定外源基因表达情况。
关键词 克隆方法 基因表达载体 玉米 无缝 杆菌介导转化 高效表达载体 外源基因表达 筛选标记
枣黑斑病菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建 预览
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作者 王廷松 王鹏程 +1 位作者 郭俊玲 王兰 《塔里木大学学报》 2018年第2期7-11,共5页
以枣黑斑病菌和含有双元载体根癌农杆菌为材料,对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌液浓度、菌株共培养时间、共培养温度等条件进行优化,筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。以农杆菌介导枣黑斑病菌最佳的遗传转化体系为基础,进行GFP标记... 以枣黑斑病菌和含有双元载体根癌农杆菌为材料,对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌液浓度、菌株共培养时间、共培养温度等条件进行优化,筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。以农杆菌介导枣黑斑病菌最佳的遗传转化体系为基础,进行GFP标记实验室保存枣黑斑病菌的菌落,继代培养后,通过观察菌落生长形态,生长速度以及致病力测定筛选获得遗传相对稳定、与野生枣黑斑病菌相比性状没有发生明显变化的荧光蛋白标记菌株。挑取单菌落于10 ml的LB液体培养基(含100μg·ml~(-1)卡那霉素)中,28℃震荡(180 r/min)培养48 h,吸取400μl培养液于20 ml含有200μmol·L-1的AS(乙酰丁香酮,acetosyringone)、100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM液体培养基中,28℃震荡(180 r/min)培养5~6 h共培养。将Alternaria alternata菌株所产的孢子洗下,制成浓度为1.0×106个/ml的悬浮液。分别取上述农杆菌液与孢子悬浮液各100μl均匀混合,涂布于含有200μmol·L-1AS和100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM平板上的硝酸纤维化膜(NC膜)表面,在25℃下黑暗共培养60 h,然后将NC膜转到含有潮霉素B的PDA平板上4~7天,获得约200个转化子,获得GFP标记的菌株。 展开更多
关键词 枣黑斑病菌 杆菌介导转化 绿色荧光蛋白
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高产柠檬酸工业Aspergillus niger菌株转化体系构建及衣康酸发酵 预览
7
作者 谢慧 马钦元 +1 位作者 魏东芝 王风清 《南京工业大学学报:自然科学版》 北大核心 2018年第6期40-50,共11页
柠檬酸高产菌株Aspergillus niger YX 1217无法成功建立遗传转化体系,极大地限制了其代谢机制和分子机制的研究。对该菌株进行遗传改造,最终建立了一种农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的遗传转化体系:农杆菌AGL-1作为介导菌株、A.... 柠檬酸高产菌株Aspergillus niger YX 1217无法成功建立遗传转化体系,极大地限制了其代谢机制和分子机制的研究。对该菌株进行遗传改造,最终建立了一种农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的遗传转化体系:农杆菌AGL-1作为介导菌株、A.niger YX-1217孢子密度为1×10^7 mL-1、孢子与农杆菌的体积比为1∶9、乙酰丁香酮浓度为300μmol/L。在最佳转化体系下获得25±1个转化子(以10^7个分生孢子计)。基于上述遗传转化技术,对A.niger YX-1217产柠檬酸的应用进行拓展,通过引入乌头酸脱羧酶cadA基因构建衣康酸的合成途径,基于搅拌转速三阶段控制利用补料分批发酵生产衣康酸,质量浓度最高达到4.21 g/L,最大产率为0.040 g/(L·h),从而延伸原有柠檬酸的代谢通路来实现衣康酸的生产。 展开更多
关键词 柠檬酸 A.niger 杆菌介导转化 衣康酸
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过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性 预览
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作者 牛陆 赵倩倩 +4 位作者 杨静 邢国杰 张伟 贺红利 杨向东 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第2期217-225,共9页
【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累... 【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体p CAMBIA3300中,构建植物表达载体p CAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子Ca MV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂(500 mg·L-1 Basta)喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T2和T3代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用q RT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦(5 mg·L-1)大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T1—T3代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照(非转基因大豆)植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1—2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的 展开更多
关键词 大豆 大豆花叶病毒 PAC1 杆菌介导转化 抗性
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花生组培再生及农杆菌介导遗传转化研究进展 预览 被引量:3
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作者 苗利娟 黄冰艳 +6 位作者 张新友 董文召 刘娟 秦利 张俊 齐飞艳 石磊 《中国农学通报》 2017年第32期15-20,共6页
农杆菌介导法是花生遗传转化最常用的转化方法,近年来,花生农杆菌介导转化技术日渐成熟,但仍存在再生体系不完善,以及转化效率低和基因型限制等难题。为了建立高效的再生和遗传转化体系,本文归纳了近十几年来国内外花生组织培养及... 农杆菌介导法是花生遗传转化最常用的转化方法,近年来,花生农杆菌介导转化技术日渐成熟,但仍存在再生体系不完善,以及转化效率低和基因型限制等难题。为了建立高效的再生和遗传转化体系,本文归纳了近十几年来国内外花生组织培养及农杆菌介导转化方法,分析了不同方法的诱导效率和转化效果,认为花生体胚转化体系可以提高外源基因的遗传稳定性,并克服嵌合体等问题。在现有的组培再生基础上,对花生体胚诱导再生进一步优化,建立高频的花生体胚再生体系,进一步提高花生的转化效率,建立标准化、规模化、工厂化以及可重复的安全高效转化体系,是花生遗传转化的发展趋势。 展开更多
关键词 花生 组织培养 再生 杆菌介导转化
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土壤中盾壳霉双标记平板计数法的建立及应用 预览
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作者 杨秀超 俞文静 +4 位作者 段作营 夏森玉 沈志松 金坚 李华钟 《植物保护》 CSCD 北大核心 2017年第5期134-142,共9页
盾壳霉是一种重要的生防菌,其在土壤中的存活数量直接关系到防治病害的效果。然而目前没有对土壤中盾壳霉直接计数的方法,构建一种简单易行的土壤中盾壳霉计数方法对研究盾壳霉在土壤中的存活动态具有重要意义。本研究利用农杆菌转化法... 盾壳霉是一种重要的生防菌,其在土壤中的存活数量直接关系到防治病害的效果。然而目前没有对土壤中盾壳霉直接计数的方法,构建一种简单易行的土壤中盾壳霉计数方法对研究盾壳霉在土壤中的存活动态具有重要意义。本研究利用农杆菌转化法构建了潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因标记的双标记盾壳霉菌株,并测定转化子的生长速度、产孢量和菌核致腐能力,初步分析了该方法计数土壤盾壳霉的有效性和可行性。结果显示,潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因可以稳定地遗传和表达,并且部分转化子生长速度、产孢量和菌核致腐能力与出发盾壳霉菌株JNCM没有显著差异。加入土壤中的盾壳霉转化子可以在含潮霉素(50μg/mL)、氯霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的PDA平板培养,杂菌得到充分抑制,呈现绿色荧光的盾壳霉转化子被有效检出,检出限达到2×103个/g土。本研究所构建的计数方法能有效检出施入土壤中的盾壳霉并进行活菌计数,可以用于盾壳霉JN-CM产品在土壤中的定殖、生长、繁殖和存活情况的研究。应用双标记平板计数法研究了不同温度、湿度、接种量和添加菌核等条件下盾壳霉JN-CM在土壤中的存活规律。结果显示,在含有核盘菌菌核的土壤中,盾壳霉JN-CM可以通过重寄生维持一段时间(12周)的数量增长,在长达半年左右(24周)的时间里其存活率仍然可以维持在65%左右。在不含菌核的土壤中,在一般土壤温度(10~20℃)范围内,无论土壤水分含量高低,其半年存活率也可以维持在50%左右。因此,可以预测,连续施用盾壳霉JN-CM生防制剂,可以使其数量在土壤中长期维持在一定的水平范围,达到长效防治效果。 展开更多
关键词 生物防治 盾壳霉 杆菌介导转化 平板计数
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Transient Expression Alga Haematococcus of VHB and GLUT1 in the Green pluvialis Using Agrobacterium- mediated Transformation 预览
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作者 Jinfei YAN Zhaokai WANG +1 位作者 Zhiwei YI Runying ZENG 《农业生物技术:英文版》 CAS 2016年第2期27-30,33共5页
The first successful Agrobacterium-mediated transformation of the green alga Haematococcus pluvialis using the vectors hosting the genes coding for VHB(Vitreoscilla hemoglobin) and GLUT1(glucose transporter 1) is repo... The first successful Agrobacterium-mediated transformation of the green alga Haematococcus pluvialis using the vectors hosting the genes coding for VHB(Vitreoscilla hemoglobin) and GLUT1(glucose transporter 1) is reported here.The greenish yellow fluorescence of EGFP was observed when the zeocin-resistant cells were viewed with a fluorescent microscope.The functional expression of EGFP showed that the Agrobacterium-mediated transformation could efficiently transfer the exogenous gene into H.pluvialis.RT-PCR was used to successfully amplify the mRNA of VHB and GLUT1 genes from transformed cells,while Southern blots indicated the integration of VHB and GLUT1 genes into the genome of H.pluvialis.Transferring VHB and GLUT1 genes into this alga would pave the way for manipulation of many important pathways relevant to the food,pharmaceutical,and nutraceutical industries. 展开更多
关键词 杆菌介导转化 葡萄糖转运蛋白 雨生红球藻 绿球藻 瞬时表达 Southern杂交 杆菌介导 RT-PCR
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不同大豆基因型对大豆遗传转化效率的影响及外源T-DNA插入分析
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作者 杨静 邢国杰 +4 位作者 杜茜 隋丽 郭东全 牛陆 杨向东 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期562-567,共6页
大豆通常被认为是较难转化的豆科作物之一,大豆基因型是影响大豆转化效率的重要因素。采用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法,对2个国外大豆品种和9个国内品种进行转化研究,对转化再生植株进行BAR试纸条和PCR检测。结果表明:不同大豆... 大豆通常被认为是较难转化的豆科作物之一,大豆基因型是影响大豆转化效率的重要因素。采用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法,对2个国外大豆品种和9个国内品种进行转化研究,对转化再生植株进行BAR试纸条和PCR检测。结果表明:不同大豆品种再生率及转化效率存在显著差异。国外品种Jack和Bert,南方大豆品种华春6号和东北大豆品种沈农9号具有较高的再生率和转化效率,转化效率分别达到6.45%、3.80%、3.24%和2.86%。对来源于沈农9号的PCR阳性植株进行Southern杂交检测,结果表明:外源基因已导入受体大豆品种,该受体品种实际转化效率为2.14%。对外源T-DNA插入结构进一步分析表明:低拷贝(1-2个)T-DNA插入比例为75%。本研究筛选了4个转化效率较高的大豆品种,为开展高效大豆遗传转化研究提供依据;同时,作为大豆主栽品种,利用华春6号和沈农9号作为受体品种开展转基因研究,对于加快转基因大豆新品种培育研究也具有重要的参考价值。 展开更多
关键词 大豆基因型 杆菌介导转化 转化效率 T-DNA插入
一种遗传转化方法在海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中的应用
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作者 孙文怡 张素芳 +1 位作者 林心萍 栾雨时 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期81-86,共6页
海洋红酵母作为一种产油微生物富含油脂和类胡萝卜素,但由于没有合适的遗传操作方法,无法对细胞反应器进行理性改进,阻碍了它的进一步发展。首先利用农杆菌介导转化成功构建了海洋红酵母的遗传操作平台。参考完成基因注释的圆红冬孢酵... 海洋红酵母作为一种产油微生物富含油脂和类胡萝卜素,但由于没有合适的遗传操作方法,无法对细胞反应器进行理性改进,阻碍了它的进一步发展。首先利用农杆菌介导转化成功构建了海洋红酵母的遗传操作平台。参考完成基因注释的圆红冬孢酵母基因组信息,分离其甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子,以基于圆红冬孢酵母密码子优化的潮霉素作为筛选标记,构建载体转化至农杆菌AGL1中,利用农杆菌介导转化成功得到潮霉素抗性表型正确的转化子,通过表型验证,基因型验证以及Western blot在蛋白水平验证,鉴定了hyg基因的有效表达,证明了外源抗性基因成功导入海洋红酵母菌株中,实现了海洋红酵母新的转化方法的建立。 展开更多
关键词 海洋红酵母 杆菌介导转化 潮霉素
Efficient Regeneration Transformation of Brassica and Agrobacterium-mediated napus Cultivar Qingza No. 5 预览
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作者 Yajing XIE Aihua WU Xianjin LIU 《农业生物技术:英文版》 CAS 2016年第3期48-53,56共7页
Using the hypocotyl and cotyledon explants of Brassica napus L. cultivar Qingza No. 5 as receptors,hormone combinations in bud differentiation medium,bud growth medium and rooting medium were optimized to establish an... Using the hypocotyl and cotyledon explants of Brassica napus L. cultivar Qingza No. 5 as receptors,hormone combinations in bud differentiation medium,bud growth medium and rooting medium were optimized to establish an efficient plantlet regeneration system of B. napus cultivar Qingza No. 5. The results showed that the highest differentiation efficiency of hypocotyls of B. napus cultivar Qingza No. 5 reached about 90%,which was three times that of cotyledons. The appropriate differentiation medium was MSB + 5 mg/L thidiazuron( TDZ) + 7. 5 mg/L AgNO3+ 0. 1 mg/L NAA + 2 mg/L proline( L-pro) + 250 mg/L casein acid hydrolysate( CH) + 3% sucrose; the appropriate growth medium was 1 /2 MSB + 1 mg/L IBA + 2 mg/L L-pro + 250 mg/L CH + 1. 5% sucrose; the appropriate rooting medium was 1 /2 MSB + 0. 2 mg/L IAA + 1. 5% sucrose. On this basis,a binary expression vector harboring insect resistance gene B12 was constructed and introduced into B. napus hypocotyls by Agrobacterium-mediated transformation. Positive plants were screened using hygromycin and carbenicillin.Transgenic plants were verified by PCR and GUS histochemical staining. The results showed that insect resistance gene B12 was successfully integrated into the nuclear genome of B. napus plants and could be expressed normally. Leaves of transgenic plants with high expression levels were collected for indoor inoculation test with Plutella xylotella larvae to evaluate insect resistance of transgenic plants. 展开更多
关键词 杆菌介导转化 甘蓝型油菜 高效再生体系 油菜品种 生根培养基 转基因植株 子叶外植体 双元表达载体
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一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化 预览 被引量:5
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作者 郭勇 王玉成 王智博 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期41-44,83共5页
利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的拟南芥瞬时转化体系影响因素来确定最佳转化条件。以生长15日龄的拟南芥幼苗为试验材料,以转化p CAMBIA1301空载体的根癌农杆菌EHA105为目的菌株进行瞬时转化。研究了吐温20、菌液OD... 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的拟南芥瞬时转化体系影响因素来确定最佳转化条件。以生长15日龄的拟南芥幼苗为试验材料,以转化p CAMBIA1301空载体的根癌农杆菌EHA105为目的菌株进行瞬时转化。研究了吐温20、菌液OD值、乙酰丁香酮(AS)及转化时间等对拟南芥瞬时转化效率的影响。结果表明:以体积分数为0.05%的吐温、菌液OD600值为1.0和120μmol/L的AS侵染拟南芥2.5 h后,再共培养72 h,能够得到高瞬时转化效果。 展开更多
关键词 拟南芥 GUS基因 瞬时表达 实时定量 杆菌介导转化
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dGFP-GUS基因标记新疆棉花黄萎病原菌的研究 预览 被引量:1
16
作者 孔德真 华东来 +3 位作者 王秀珍 刘步仓 祝建波 王爱英 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-8,共8页
【目的】研究棉花黄萎病原菌的入侵机理。【方法】以带有潮霉素抗性筛选基因的PUCCATPH载体以及pCAMBIA1304载体作为骨架,构建trpc启动子驱动的GFP-GUS基因的新疆棉花黄萎病菌表达载体1304-P-ORF,导入农杆菌GV3101和AGL-1中。通过农杆... 【目的】研究棉花黄萎病原菌的入侵机理。【方法】以带有潮霉素抗性筛选基因的PUCCATPH载体以及pCAMBIA1304载体作为骨架,构建trpc启动子驱动的GFP-GUS基因的新疆棉花黄萎病菌表达载体1304-P-ORF,导入农杆菌GV3101和AGL-1中。通过农杆菌介导(ATMT)法分别转入新疆棉花黄萎病原菌VD-1和VD-278中,对表达效果进行检测。【结果】筛选的潮霉素B浓度为30μg/m L,农杆菌AGL-1对黄萎病菌的转化效率比GV3101高40%。T0代经含有潮霉素B的PDA培养基筛选,获得了T1代转基因大丽轮枝菌VD-12株,VD-2 784株。通过GUS组织染色,在转基因VD-1和VD-278的菌丝和孢子中均可观察到GUS基因的表达。对转基因黄萎菌进行PCR分子检测,均可检测到GFP和潮霉素B基因。GUS-GFP和潮霉素B基因已成功转入新疆棉花黄萎菌VD-1和VD-278中。【结论】建立了新疆棉花黄萎菌的遗传转化体系,为进一步利用GFP-GUS基因研究新疆棉花黄萎菌对棉花侵染的过程奠定基础。 展开更多
关键词 trpc启动子 杆菌介导转化 GFP-GUS 棉花黄萎病菌
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抗蚜基因PPA遗传转化‘鲲旱2号’的研究 预览
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作者 张冠华 李朝炜 +3 位作者 闫素红 苏乐乐 郭蒙 魏景芳 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期117-121,共5页
以‘鲲旱2号’成熟胚为外植体,通过农杆菌介导法将抗虫基因PPA导入旱稻愈伤组织中,以期获得抗虫转基因旱稻植株。对影响愈伤组织诱导效果的2,4-D浓度进行了研究。结果表明:当2,4-D浓度为2mg/L时,愈伤组织诱导效果最佳。对获得的转化植... 以‘鲲旱2号’成熟胚为外植体,通过农杆菌介导法将抗虫基因PPA导入旱稻愈伤组织中,以期获得抗虫转基因旱稻植株。对影响愈伤组织诱导效果的2,4-D浓度进行了研究。结果表明:当2,4-D浓度为2mg/L时,愈伤组织诱导效果最佳。对获得的转化植株进行PCR检测证明PPA基因已成功整合到旱稻基因组DNA。对阳性植株的后代喷施0.8mg/mL除草剂检测表明,转基因植株后代具有良好的除草剂抗性。 展开更多
关键词 旱稻 杆菌介导转化 PPA基因
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农杆菌介导法转化金针菇不同受体的效率比较 预览 被引量:3
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作者 刘建雨 徐珍 +3 位作者 张丹 王瑞娟 谭琦 尚晓冬 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2015年第3期7-12,共6页
以金针菇(Flammulina velutipes)单核体菌株Dan3和双核体菌株G1的菌丝碎片以及原生质体分别为转化受体,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为侵染菌株,潮霉素为筛选标记,绿色荧光蛋白编码基因(egfp)为外源基因,进... 以金针菇(Flammulina velutipes)单核体菌株Dan3和双核体菌株G1的菌丝碎片以及原生质体分别为转化受体,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为侵染菌株,潮霉素为筛选标记,绿色荧光蛋白编码基因(egfp)为外源基因,进行农杆菌介导转化金针菇。结果显示:金针菇双核体菌株G1的菌丝碎片作为受体时转化效率最高,为40.31%;单核体菌株Dan3的原生质体作为受体时转化效率最低,为21.87%。 展开更多
关键词 金针菇 杆菌介导转化 转化效率 阳性转化
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青杂5号甘蓝型油菜的高效再生及农杆菌侵染转化体系的建立 预览 被引量:2
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作者 谢雅晶 武爱华 刘贤金 《江苏农业科学》 北大核心 2015年第12期17-22,共6页
以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种青杂5号的子叶、下胚轴外植体为受体,分别对芽分化培养基、芽生长培养基、生根培养基进行激素组合优化研究,建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生系统。结果表明,青杂5号下胚轴分化率最高为子叶的3倍,可达... 以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种青杂5号的子叶、下胚轴外植体为受体,分别对芽分化培养基、芽生长培养基、生根培养基进行激素组合优化研究,建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生系统。结果表明,青杂5号下胚轴分化率最高为子叶的3倍,可达90%左右;优化的分化培养基为MSB+5 mg/L噻二唑苯基脲(thidiazuron,TDZ)+7.5 mg/L Ag NO3+0.1 mg/L NAA+2 mg/L脯氨酸(proline,L-Pro)+250 mg/L酸水解酪蛋白(casein acid hydrolysate,CH)+3%蔗糖;生长培养基为1/2 MSB+1 mg/L IBA+2 mg/L L-Pro+250 mg/L CH+1.5%蔗糖;生根培养基为1/2 MSB+0.2 mg/L IAA+1.5%蔗糖。在此基础上,构建模拟Bt的抗虫基因B12的双元表达载体,采用农杆菌介导的方法转化油菜下胚轴,并利用潮霉素及羧苄青霉素对再生植株进行筛选;通过对转基因植株叶片基因组DNA的PCR检测及叶片GUS组织化学染色的分析,发现抗虫基因已整合到油菜植株的细胞核基因组中,并能正常表达;通过小菜蛾接种试验对该抗虫基因进行杀虫效果评价。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 下胚轴高效再生 杆菌介导转化 抗虫基因 GUS染色 转基因植株
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一种新的大丽轮枝菌基因敲除载体的构建 预览 被引量:1
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作者 毛建才 张婷 +2 位作者 高云 宋雯 高峰 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1878-1883,共6页
【目的】研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体。【方法】通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP),连接到pMD18-T载体上,测序验证,利用限制性内切酶Hind... 【目的】研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体。【方法】通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP),连接到pMD18-T载体上,测序验证,利用限制性内切酶HindⅢ将目的片段切下,连接到敲除载体pRF—HU2的多克隆位点上。通过电击转化法将载体转化到农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法(ATMT)转化到大丽轮枝菌。【结果】成功得到一种新的携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体,通过GFP基因的筛选,T—DNA随机插入转化子在荧光显微镜下呈现绿色,相反敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色。【结论】构建了一种大丽轮枝菌基因新的高效敲除载体,利用该载体大大节省了筛选转化子所用的时间,为大丽轮枝菌功能基因的验证提供了技术平台。 展开更多
关键词 大丽轮枝菌 基因敲除 绿色荧光蛋白基因 杆菌介导转化
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