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基于脂蛋白P80的滑液支原体抗体ELISA检测方法的建立及应用
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作者 王宇 李浩然 +6 位作者 温政 尚原冰 刘婷 丁铲 高崧 祁晶晶 于圣青 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期512-524,共13页
【目的】研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用。【方法】对MS P80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫... 【目的】研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用。【方法】对MS P80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫反应性以及与其他禽病原血清的交叉反应性;运用纯化的MS P80表达蛋白作为包被抗原建立了MS血清抗体的间接ELISA检测方法,对其敏感性和重复性进行检测;比较检测了与美国爱德士检测试剂盒对50份临床血清样品的阳性符合率。【结果】生物信息学分析预测MS P80蛋白为脂蛋白且含有信号肽,其在MS种内同源性高达98%−100%,与其他种属P80蛋白同源性在25%−34%之间,成功表达和纯化了MS P80重组蛋白(rMS P80);Western blotting分析表明纯化的rMS P80具有良好的免疫反应性和特异性;运用rMS P80建立的MS血清ELISA抗体检测方法可对不同株MS阳性血清进行抗体效价检测,而对其他禽病原阳性血清均无交叉反应性;该检测方法的批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好;与美国IDEXX检测试剂盒比较,本文建立的ELISA抗体检测方法敏感性更高,阳性符合率为75%,阴性符合率为89.47%,总样本符合率为86%。【结论】MS P80具有较好的免疫反应性、种内保守性和种间特异,并且可用作MS抗体检测的靶标抗原。 展开更多
关键词 脂蛋白 滑液支原体 免疫反应 间接ELISA
梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453-Gpd的表达及免疫性研究 预览
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作者 韩雪 崔勇青 +4 位作者 胡子颖 魏仙萍 黄亚辉 孔令保 郑义 《安徽大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第4期91-95,共5页
人工合成梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453-Gpd基因,转入大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,表达的重组蛋白分子量为64kD.重组蛋白镍柱纯化后作为抗原,检测人血清样本.结果显示,梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组存在非常显著差别,说明重组蛋白... 人工合成梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453-Gpd基因,转入大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,表达的重组蛋白分子量为64kD.重组蛋白镍柱纯化后作为抗原,检测人血清样本.结果显示,梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组存在非常显著差别,说明重组蛋白可被梅毒抗体特异性识别,有良好免疫反应性,可作为梅毒诊断试剂新抗原.同时,利用该重组蛋白免疫新西兰兔3次,兔血清中可持续检测到高滴度梅毒抗体,显示该重组蛋白有较强免疫原性,可作为梅毒基因工程蛋白疫苗候选蛋白。 展开更多
关键词 梅毒螺旋体 重组蛋白 表达 免疫反应 免疫
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猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析
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作者 陈静梅 李瑾 +4 位作者 孙慧 肖婷 魏庆宽 贾凤菊 黄炳成 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期161-164,共4页
目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH... 目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪囊尾蚴 Ts8B2 原核表达 免疫反应
刚地弓形虫滑行相关蛋白45的克隆、表达与免疫反应性检测
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作者 李润花 关丽 殷国荣 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期563-567,共5页
目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物... 目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体、人抗弓形虫血清或小鼠抗弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白免疫反应性。结果刚地弓形虫GAP45基因的cDNA开放式阅读框全长为738 bp,PCR扩增结果显示,在750 bp处有一条特异性扩增条带(带His标签),与预期大小相符。菌落PCR、双酶切以及测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45构建成功。SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,诱导表达的蛋白为带His标签的重组蛋白,可分别被His标签抗体、人抗弓形虫血清和小鼠抗弓形虫STAg血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgGAP45基因片段可在原核表达系统中高效可溶性表达,该重组蛋白rTgGAP45具有免疫反应性。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 滑行相关蛋白45 基因克隆 原核表达 免疫反应
梅毒螺旋体多表位融合抗原的表达及免疫性研究 预览
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作者 韩雪 魏仙萍 +2 位作者 黄亚辉 郑义 孔令保 《湖南师范大学自然科学学报》 北大核心 2018年第5期24-28,共5页
设计梅毒螺旋体多表位融合抗原,该融合抗原含外膜蛋白Tp0453,Tp0435,Tp1038,Tp0868和Tp0965重要抗原表位,人工合成该多表位融合抗原基因,转入大肠杆菌中IPTG诱导表达,镍柱亲合层析纯化.利用多表位融合抗原检测人血清中梅毒特异... 设计梅毒螺旋体多表位融合抗原,该融合抗原含外膜蛋白Tp0453,Tp0435,Tp1038,Tp0868和Tp0965重要抗原表位,人工合成该多表位融合抗原基因,转入大肠杆菌中IPTG诱导表达,镍柱亲合层析纯化.利用多表位融合抗原检测人血清中梅毒特异性抗体,梅毒患者样本组与非患者样本组检测结果存在极其显著性差异,说明多表位融合抗原可被梅毒抗体特异性识别,有较好免疫反应性,可作为梅毒诊断试剂新抗原.利用多表位融合抗原免疫新西兰兔,兔血清中可持续检测到高滴度梅毒抗体,显示该多表位融合抗原有较强免疫原性,是梅毒基因工程疫苗候选蛋白. 展开更多
关键词 梅毒螺旋体 融合抗原 免疫反应 免疫
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鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达 预览
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作者 刘志科 张秋雨 +8 位作者 杨宁宁 徐锦凤 徐明国 荆明龙 吴文星 曹旭东 任艳 石峰 陈创夫 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2018年第8期9-15,共7页
【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的... 【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门氏菌 invA基因 原核表达 生物信息学分析 免疫反应
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血液灌流联合血液透析对慢性肾脏病矿物质与骨异常患者血磷免疫反应性甲状腺激素水平的影响 预览
7
作者 陈亚然 《山西医药杂志》 CAS 2018年第15期1820-1822,共3页
慢性肾脏病是对人类生命安全危害极强的疾病,具有发病率高、致死率高等特点,据流行病学研究结果显示,全球范围内慢性肾脏病患病率高达10%,随着现代医学技术的不断提升,医用设备的不断更新完善,针对慢性肾脏病终末期的治疗已经获得极大... 慢性肾脏病是对人类生命安全危害极强的疾病,具有发病率高、致死率高等特点,据流行病学研究结果显示,全球范围内慢性肾脏病患病率高达10%,随着现代医学技术的不断提升,医用设备的不断更新完善,针对慢性肾脏病终末期的治疗已经获得极大突破。慢性肾脏病矿物质及骨异常是该病主要并发症,对患者生存质量有着严重影响,慢性肾脏病患者因肾功能衰减,机体将出现各种骨代谢异常及矿物质异常,从而引发血管钙化、肾性骨病、继发性甲状旁腺功能亢进等疾病,严重降低患者生活质量,死亡风险大大增加。 展开更多
关键词 肾脏病 血液灌流联合血液透析 骨代谢异常 甲状腺激素水平 矿物质 免疫反应 患者 继发甲状旁腺功能亢进
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卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL表位预测及鉴定 预览
8
作者 陆梅燕 黄再铭 阳志军 《中国癌症防治杂志》 CAS 2018年第3期198-204,共7页
目的 预测并筛选免疫反应性较强的四跨膜蛋白超家族成员1(transmembrane 4 L6 family member 1,TM4SF1)人类白细胞抗原A2(human leukocyte antigen A2,HLA-A2)限制性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)表位肽。方法联合4种软件... 目的 预测并筛选免疫反应性较强的四跨膜蛋白超家族成员1(transmembrane 4 L6 family member 1,TM4SF1)人类白细胞抗原A2(human leukocyte antigen A2,HLA-A2)限制性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)表位肽。方法联合4种软件(BIMAS、SYFPEITHI、IEDB、PROPRED I)对TM4SF1的HLA-A2限制性CTL表位进行预测,并采用预培养法酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assy,ELISOPT)、直接法ELISOPT对所测得表位肽的免疫反应性进行鉴定。结果 4种不同软件共预测出10条表位多肽,对其中4条(P1、P2、P8、P10)进行免疫反应性验证。多肽活化CTL能力结果显示,预培养法ELISPOT产生斑点形成细胞(spvt forming cell,SFC)的净值T明显高于直接法ELISPOT:[(阳性对照肽:322±8 vs 169±22,P〈0.05)、(多肽P1:114±10 vs 39±7,P〈0.05)、(多肽P10:156±31 vs 52±8,P〈0.05)]。单个活化CTL细胞分泌INF-γ因子的水平检测结果显示,预培养法ELISPOT产生斑点的平均大小明显大于直接法ELISPOT[(阳性对照肽:21.91±2.45 vs 13.80±1.76,P〈0.05)、(多肽P1:12.90±0.88 vs 8.31±1.40,P〈0.05)、(多肽P10:17.50±3.85 vs 11.96±0.61,P〈0.05)]。表位多肽P1、P10均具有免疫原性,P10的免疫活性更高。结论 预培养法ELISPOT检测多肽的免疫反应性较直接法ELISPOT灵敏性更高,多种软件联合ELISPOT预培养法可有效筛选出免疫反应性更强的卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL优势表位,其中P10的免疫活性最高。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制CTL表位 免疫反应
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人血清淀粉样蛋白A的重组表达及免疫学检测标准品的初步研究 被引量:1
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作者 周齐洋 张小燕 +1 位作者 朱婷婷 牛英波 《药物生物技术》 CAS 2018年第1期21-25,共5页
构建人SAA1原核表达载体,建立SAA1蛋白大肠杆菌表达条件和纯化工艺,评价重组SAA1蛋白在制备免疫学检测标准物质中的应用前景。采用同源重组的方法构建表达载体,在N端加入6×His和SUMO标签帮助SAA1蛋白的可溶性表达和纯化;在小量体... 构建人SAA1原核表达载体,建立SAA1蛋白大肠杆菌表达条件和纯化工艺,评价重组SAA1蛋白在制备免疫学检测标准物质中的应用前景。采用同源重组的方法构建表达载体,在N端加入6×His和SUMO标签帮助SAA1蛋白的可溶性表达和纯化;在小量体系中评价SUMO-SAA1蛋白的可溶性表达后,用镍亲和柱和阴离子交换层析方法纯化蛋白,用蛋白酶切除SUMO标签后再通过镍亲和柱层析方法获得高纯度人SAA1重组蛋白;用西门子N-Latex SAA试剂评价重组蛋白的免疫反应性和稳定性,并与SAA国际标准物质进行比较研究。结果表明SUMO-SAA1在大肠杆菌中大部分为可溶性表达且表达量高,产物纯度可达90%以上,稳定性良好并与SAA国际标准物质具有类似的免疫反应性。利用SUMO标签的助溶作用,成功在大肠杆菌中表达了人SAA1重组蛋白,该蛋白适合作为制备SAA1免疫检测的参考标准物质的原材料。 展开更多
关键词 血清淀粉样蛋白A 融合表达 可溶 蛋白纯化 标准物质 稳定 免疫反应
新疆部分地区牛轮状病毒VP6基因的原核表达与免疫反应性分析 预览
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作者 陆亚冬 刘贤侠 陈创夫 《中国兽医杂志》 北大核心 2018年第4期41-44,I0003共5页
为了原核表达牛轮状病毒VP6蛋白,检测该蛋白的反应原性,对牛轮状病毒内衣壳蛋白VP6保守区设计并合成引物,表达牛轮状病毒VP6蛋白,应用Western Blot分析该蛋白的反应原性。结果显示,利用PCR方法成功扩增出目的基因,经过测序与酶切鉴定,... 为了原核表达牛轮状病毒VP6蛋白,检测该蛋白的反应原性,对牛轮状病毒内衣壳蛋白VP6保守区设计并合成引物,表达牛轮状病毒VP6蛋白,应用Western Blot分析该蛋白的反应原性。结果显示,利用PCR方法成功扩增出目的基因,经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体pET-32a-VP6,SDS-PAGE电泳显示表达产物在60 k D表达重组蛋白。表明经过Western Blot检测,该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白作为诊断抗原奠定了基础。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 VP6 免疫反应
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猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析 被引量:2
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作者 李瑾 肖婷 +3 位作者 孙慧 魏庆宽 贾凤菊 黄炳成 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第5期480-483,488共5页
目的将猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因进行原核表达,分析重组蛋白的免疫反应性。方法根据Ts8B3基因序列设计引物,以囊尾蚴RNA反转录的cDNA为模板PCR扩增Ts8B3基因,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1,将重组质... 目的将猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因进行原核表达,分析重组蛋白的免疫反应性。方法根据Ts8B3基因序列设计引物,以囊尾蚴RNA反转录的cDNA为模板PCR扩增Ts8B3基因,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。纯化重组蛋白,以囊虫病人血清为一抗,采用Western blot分析其免疫反应性。结果 PCR扩增Ts8B3基因片段为201bp,双酶切和测序显示重组表达质粒构建成功。重组质粒转化BL21后经IPTG诱导4h,以包涵体的形式表达相对分子质量单位(Mr)为33×103的目的蛋白。纯化的重组蛋白能被囊虫病患者血清识别。结论成功构建Ts8B3基因重组质粒,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪囊尾蚴 Ts8B3 原核表达 免疫反应
人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备 预览
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作者 何赛 廖旻晶 +8 位作者 靳晓瑞 邱义兰 李晓丹 郑姣 唐娜 罗焕 梁湘辉 郭向荣 刘如石 《生命科学研究》 CAS CSCD 2017年第1期16-22,共7页
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并... 人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体p ET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 k D;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒(HCMV) 包膜糖蛋白B(g B) 中和表位 单克隆抗体(m Ab) 酶联免疫吸附反应(ELISA) 免疫反应
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细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析
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作者 杨慧 赵殷奇 +5 位作者 李子华 赵嘉庆 王浩 王娅娜 朱明星 赵巍 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期559-562,共4页
目的 筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法 在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。... 目的 筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法 在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果 筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P〈0.05)。结论 筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。 展开更多
关键词 细粒棘球蚴 克隆 表达 免疫反应
血清4型禽腺病毒纤突蛋白的真核表达及其免疫反应性
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作者 王伟康 梁广成 +7 位作者 管雪冰 张俊 王萍 张建军 郑文铝 邵红霞 秦爱建 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2017年第23期14-17,共4页
研究对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)表面纤突蛋白基因F1及F2进行了克隆及真核表达载体的构建,分别命名为peDNA3.1-F1以及peDNA3.1-F2。间接免疫荧光以及Westernblot分析证明,所构建的表达载体表达的F1及F2均能与抗FAdV-4的阳性血清进... 研究对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)表面纤突蛋白基因F1及F2进行了克隆及真核表达载体的构建,分别命名为peDNA3.1-F1以及peDNA3.1-F2。间接免疫荧光以及Westernblot分析证明,所构建的表达载体表达的F1及F2均能与抗FAdV-4的阳性血清进行良好免疫反应。在间接免疫荧光试验中,转染pcDNA3.1-F1及peDNA3.1-F2的293T细胞内均可见特异性亮绿色荧光;在Westernblot中分别出现F1及F2特异性蛋白条带。纤突蛋白F1及F2真核表达载体构建、表达及其良好的免疫反应性,为进一步建立FAdV一4快速血清学诊断方法、探究纤突蛋白F1及F2在病毒感染致病中作用奠定了基础。 展开更多
关键词 血清4型禽腺病毒 纤突蛋白基因 克隆表达 免疫反应
刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定 被引量:1
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作者 王钊哲 许瑞 +9 位作者 洪炀 林矫矫 陆珂 李浩 陈兆国 石耀军 吴思敏 江嘉欣 李嘉静 朱传刚 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期575-579,共5页
目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形... 目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 抗原表位 重组序列 免疫反应
拟态弧菌溶血素VMH蛋白B细胞线性表位的预测与鉴定 被引量:1
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作者 曹际 陶会竹 +2 位作者 赵雨婷 肖宁 李槿年 《安徽农业大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期208-213,共6页
为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的B细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用ABCpred和BepiPred网络服务器综合分析预测VMH蛋白B细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14... 为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的B细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用ABCpred和BepiPred网络服务器综合分析预测VMH蛋白B细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14软件构建VMH蛋白的3D结构,并使用PyMol软件展示预测表位,确定其在3D结构中的位置。共预测出6个最有可能的B细胞线性表位,它们分别位于VMH蛋白N端P130-141、P192-203、P236-247、P281-292、P425-436和P464-475区域,且完全或大部分暴露于蛋白3D结构表面。人工合成6条预测表位肽,分别采用肽ELISA、肽抑制性免疫印迹反应和溶血活性试验进行鉴定。结果发现6个预测表位肽均能与兔抗VMH蛋白抗体发生结合反应;除预测表位P281-292外,其余5个预测表位肽能明显抑制兔抗VMH蛋白抗体与VMH蛋白间的免疫印迹反应,且具有溶血活性。结果表明,预测表位P130-141、P192-203、P236-247、P425-436和P464-475是拟态弧菌VMH蛋白的真正B细胞线性表位。 展开更多
关键词 拟态弧菌 VMH蛋白 B细胞线表位 免疫反应 溶血活
Neuroprotective effects of ischemic preconditioning on hippocampal CA1 pyramidal neurons through maintaining calbindin D28k immunoreactivity following subsequent transient cerebral ischemia 预览
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作者 In Hye Kim Yong Hwan Jeon +10 位作者 Tae-Kyeong Lee Jeong Hwi Cho Jae-Chul Lee Joon Ha Park Ji Hyeon Ahn Bich-Na Shin Yang Hee Kim Seongkweon Hong Bing Chun Yan Moo-Ho Won Yun Lyul Lee 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2017年第6期918-924,共7页
Ischemic preconditioning elicited by a non-fatal brief occlusion of blood flow has been applied for an experimental therapeutic strategy against a subsequent fatal ischemic insult. In this study, we investigated the n... Ischemic preconditioning elicited by a non-fatal brief occlusion of blood flow has been applied for an experimental therapeutic strategy against a subsequent fatal ischemic insult. In this study, we investigated the neuroprotective effects of ischemic preconditioning(2-minute transient cerebral ischemia) on calbindin D28k immunoreactivity in the gerbil hippocampal CA1 area following a subsequent fatal transient ischemic insult(5-minute transient cerebral ischemia). A large number of pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area died 4 days after 5-minute transient cerebral ischemia. Ischemic preconditioning reduced the death of pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area. Calbindin D28k immunoreactivity was greatly attenuated at 2 days after 5-minute transient cerebral ischemia and it was hardly detected at 5 days post-ischemia. Ischemic preconditioning maintained calbindin D28 k immunoreactivity after transient cerebral ischemia. These findings suggest that ischemic preconditioning can attenuate transient cerebral ischemia-caused damage to the pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area through maintaining calbindin D28k immunoreactivity. 展开更多
关键词 海马CA1区 锥体神经元 缺血预处理 神经保护作用 免疫反应 钙结合蛋白 脑缺血 CALBINDIN
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蓝舌病1型病毒VP2蛋白的原核表达及免疫反应性分析 预览 被引量:1
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作者 宋建领 李华春 《中国畜牧兽医》 北大核心 2017年第7期2119-2125,共7页
试验旨在研究蓝舌病1型病毒(bluetongue virus serotype 1,BTV-1)VP2蛋白体外表达产物免疫反应性。根据已发表的BTV-1Y863毒株L2基因序列设计合成特异性BTV-1PCR引物,通过RT-PCR方法扩增L2基因,将纯化的L2基因克隆至pEASY-Blunt E1表... 试验旨在研究蓝舌病1型病毒(bluetongue virus serotype 1,BTV-1)VP2蛋白体外表达产物免疫反应性。根据已发表的BTV-1Y863毒株L2基因序列设计合成特异性BTV-1PCR引物,通过RT-PCR方法扩增L2基因,将纯化的L2基因克隆至pEASY-Blunt E1表达载体,对重组质粒进行鉴定,将阳性重组质粒L2克隆至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达,对获得的纯化的BTV-1 VP2重组蛋白进行Western blotting、ELISA、阻断ELISA分析。结果显示,BTV-1VP2蛋白在pEASY-Blunt E1载体上以包涵体形式表达,通过Ni-NTA亲和层析,160和200mmol/L咪唑是洗脱BTV-1VP2蛋白表达产物的最佳浓度。纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的BTV-1VP2重组蛋白,分子质量约105ku,Western blotting、ELISA、阻断ELISA结果显示,重组BTV-1VP2蛋白能与BTV-1型特异性抗体发生特异性结合,且此结合能被BTV-1阻断。本试验结果表明,通过原核表达载体pEASY-Blunt E1表达的BTV-1VP2重组蛋白具有良好的免疫反应性,为BTV-1VP2蛋白型特异性表位定位研究奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病 VP2蛋白 表达 免疫反应
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鸡白痢沙门菌外膜蛋白C的原核表达与免疫反应性分析
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作者 史瑞雅 马邯生 +2 位作者 刘彦威 刘娜 李博 《畜牧与兽医》 北大核心 2017年第10期91-94,共4页
利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30... 利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30a-C原核表达重组质粒,转化BL21表达菌后,通过IPTG诱导获得以包涵体形式存在的重组蛋白,重组蛋白纯化后免疫印迹检测显示具有良好的反应原性。本研究为鸡白痢基因工程抗原的制备及诊断试剂研究奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门菌 外膜蛋白C 原核表达 免疫反应
梅毒螺旋体Tp0259假定蛋白的原核表达、纯化及活性研究 被引量:1
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作者 谢亚锋 徐嫚 +2 位作者 李霞 肖勇健 刘卓然 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第2期128-131,共4页
目的 表达、纯化梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0259(rTp0259),鉴定其免疫原性,并探讨其在梅毒血清诊断中的价值。方法 PCR扩增tp0259基因,构建pET-28a(+)/Tp0259原核表达载体,转化至E.coli BL21中诱导表达。采用Ni-NTA亲和层析法纯... 目的 表达、纯化梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0259(rTp0259),鉴定其免疫原性,并探讨其在梅毒血清诊断中的价值。方法 PCR扩增tp0259基因,构建pET-28a(+)/Tp0259原核表达载体,转化至E.coli BL21中诱导表达。采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,并进行Western blot鉴定。以重组蛋白Tp0259为抗原,采用Western blot方法检测梅毒患者血清(一期梅毒患者血清21份,二期梅毒患者血清13份,潜伏梅毒患者血清6份,并与梅毒诊断金标准比较)。结果 PCR扩增获得600bp左右大小的目的基因片段并成功构建原核表达载体pET28a-Tp0259,经诱导高效表达分子质量单位为28ku的重组蛋白。Western blot证实该重组蛋白为Tp0259假定蛋白,能被梅毒患者血清识别。以Tp0259为抗原采用Western blot检测梅毒患者血清特异性抗体结果与梅毒诊断金标准(临床症状、病史结合血清学诊断方法)间的κ值为0.944,表明这两种方法检测结果的一致性较好。结论成功表达、纯化了可溶性rTp0259,该蛋白具有良好的免疫反应性并具有较高的血清学诊断价值。 展开更多
关键词 梅毒螺旋体 梅毒 Tp0259 重组抗原 免疫反应
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