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非洲猪瘟病毒CP204L基因的生物信息学分析、载体构建及蛋白表达 认领
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作者 鲁中爽 许会会 +5 位作者 蔡维北 武悦 杨莲花 王泽宇 王楠 徐一鸣 《广东农业科学》 CAS 2020年第7期128-136,共9页
【目的】非洲猪瘟病(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)导致的,能引起猪高度致死的急性传染病。采用生物学手段制备检测试剂能更快、更有效地监测疫情,对ASF疫情的防控尤为重要。【方法】... 【目的】非洲猪瘟病(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)导致的,能引起猪高度致死的急性传染病。采用生物学手段制备检测试剂能更快、更有效地监测疫情,对ASF疫情的防控尤为重要。【方法】根据ASFV的CP204L基因CDS区序列设计特异性引物并进行PCR扩增,将目的基因片段与p EASY-T5连接构建克隆载体,利用生物信息学软件对蛋白进行生物信息学分析,用T4连接酶构建重组载体pET-32a(+)-CP204L,将成功构建的重组表达载体质粒转入感受态Rosetta(DE3)中,用1 mmol/L IPTG、37℃诱导表达8 h后进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达。【结果】生物信息学分析结果表明,P30蛋白是一种主要由无规卷曲α螺旋和β折叠组成的亲水和稳定蛋白,PCR扩增及测序比对结果证明成功构建了重组表达载体,SDS-PAGE电泳验证了在24.3 ku处有潜在的P30蛋白表达。【结论】通过生物信息学软件在分子层面分析了P30蛋白的理化性质及蛋白结构,P30蛋白的表达为制备ASFV血清学诊断试剂及诊断技术奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 生物信息学 表达载体 诱导表达
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褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析 认领
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作者 王正亮 朱杭锋 +1 位作者 潘海波 俞晓平 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期779-787,共9页
【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用... 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 褐飞虱 金龟子绿僵菌 丝氨酸蛋白酶抑制剂 基因克隆 时空表达 诱导表达
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水稻OsRZFP34基因逆境表达特征及其启动子的克隆与分析 认领
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作者 邹杰 刘媛 《湖南农业大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期670-678,共9页
采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42℃)、低温(4℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列... 采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42℃)、低温(4℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列进行顺式作用元件分析;构建OsRZFP34pro::GUS表达载体并转化水稻;通过组织化学染色和GUS酶活性检测,分析在不同胁迫处理条件下OsRZFP34启动子驱动GUS基因表达的活性。qRT–PCR分析结果表明,上述5种处理均能不同程度地诱导OsRZFP34的表达,其中高温胁迫对其表达的诱导程度最强,而ABA对其表达只有微弱的诱导。顺式作用元件分析结果表明,该启动子上包含有多个与逆境响应、激素响应以及Ca^2+信号转导相关元件。GUS组织化学染色和荧光分析结果显示,OsRZFP34基因启动子的活性受到高温、低温、PEG、盐和ABA的调控,表明该启动子是受多种逆境诱导的诱导型启动子。 展开更多
关键词 水稻 OsRZFP34基因 逆境诱导 表达特征 启动子 顺式作用元件
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白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答 认领
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作者 张道伟 康奎 +4 位作者 余亚娅 匡富萍 潘碧莹 陈静 唐斌 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第15期3108-3119,共12页
【目的】酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱(Sogatella furcifera)3条PPO序列的基础上,通过分析... 【目的】酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱(Sogatella furcifera)3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2079、999、2070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱(Nilaparvata lugens)的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌� 展开更多
关键词 白背飞虱 酚氧化酶原 RNA干扰 实时荧光定量PCR 诱导表达 免疫应答
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虎皮鱼热激蛋白PtHsp70基因序列与低温表达分析 认领 被引量:1
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作者 刘丽丽 王晓雯 +3 位作者 朱建亚 张蓉 朱华 田照辉 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期774-782,共9页
通过同源克隆和cDNA末端快速克隆技术扩增获得狭温热带鱼类虎皮鱼热激蛋白70(PtHsp70)基因的cDNA序列,BLAST比对分析基因序列同源性,预测其编码氨基酸序列和结构,实时荧光定量PCR技术分析虎皮鱼PtHsp70基因组织特异性表达谱和低温胁迫下... 通过同源克隆和cDNA末端快速克隆技术扩增获得狭温热带鱼类虎皮鱼热激蛋白70(PtHsp70)基因的cDNA序列,BLAST比对分析基因序列同源性,预测其编码氨基酸序列和结构,实时荧光定量PCR技术分析虎皮鱼PtHsp70基因组织特异性表达谱和低温胁迫下PtHsp70基因的表达模式。研究结果表明,PtHsp70基因cDNA序列全长2317 bp,其中5′非编码区120 bp,3′非编码区266 bp,编码区1932 bp,对应的开放阅读框为121~2052 bp,预测编码643个氨基酸。PtHsp70基因mRNA在成年虎皮鱼不同组织中表达水平依次为肝脏>肌肉>鳃>脑,其中肝脏PtHsp70基因本底表达水平显著高于其他组织(P<0.01),表明其在肝脏中具有重要的生物学功能。而随温度降低,肝脏PtHsp70基因表达水平呈先降后升的趋势,表明肝脏PtHsp70基因参与虎皮鱼应对低温胁迫的过程;随温度降低,虎皮鱼脑、鳃和肌肉组织PtHsp70基因mRNA水平显著上调(P<0.01),说明低温胁迫诱导PtHsp70基因mRNA表达。本研究克隆并鉴定了PtHsp70基因序列和组织表达谱,分析了低温胁迫下PtHsp70基因表达模式,研究结果显示,狭温热带鱼类虎皮鱼的PtHsp70基因具有组织特异性和温度诱导型表达特征。研究发现,PtHsp70基因在响应低温胁迫过程中具有重要作用,具有作为虎皮鱼低温胁迫分子标志物的潜能。 展开更多
关键词 狭温热带鱼 PtHsp70 诱导型表达 组织特异性表达 低温胁迫
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小鼠核糖核酸酶抑制剂异源高效可溶性表达、纯化及活性研究 认领
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作者 付大伟 孙莹莹 徐伟 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第10期174-178,183共6页
为获得高效可溶性表达的小鼠核糖核酸酶抑制剂(MRNI),本文通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,利用MagNi磁珠检测及电泳分析MRNI... 为获得高效可溶性表达的小鼠核糖核酸酶抑制剂(MRNI),本文通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,利用MagNi磁珠检测及电泳分析MRNI的表达状况,并对其培养温度及时间进行优化,同时,与其他公司核糖核酸酶抑制剂(RI)活性进行对比。结果表明,重组菌BL21(DE3)(pNBEII-MRNI)诱导表达的可溶性融合蛋白IF2-MRNI的产量最高,最适诱导条件为37℃,诱导培养6 h,20℃培养24 h。磁珠纯化后获得的融合蛋白IF2-MRNI浓度为3621.3 mg/L,检测其酶活性约为40 U/μL。该酶具有抑制RNase A活性,防止RNA被降解的作用,为RI的生产及应用提供理论基础。 展开更多
关键词 核糖核酸酶抑制剂 融合标签 诱导表达 磁珠纯化
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表达载脂蛋白L1稳定细胞系的构建 认领
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作者 曹观华 曹广进 +4 位作者 刘舒宁 程晓敏 仇艺娴 李凌 朱利 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第4期401-405,共5页
目的利用Cumate系统实现APOL1基因在293T细胞内的可诱导稳定表达。方法通过查询NCBI数据库,设计APOL1基因编码区全长引物,克隆至Cumate慢病毒质粒。嘌呤霉素筛选包装慢病毒感染的293T细胞,阳性细胞扩大培养后用不同浓度的Cumate诱导表达... 目的利用Cumate系统实现APOL1基因在293T细胞内的可诱导稳定表达。方法通过查询NCBI数据库,设计APOL1基因编码区全长引物,克隆至Cumate慢病毒质粒。嘌呤霉素筛选包装慢病毒感染的293T细胞,阳性细胞扩大培养后用不同浓度的Cumate诱导表达,利用Real-time PCR和Western blot验证APOL1的表达情况。结果构建的293T细胞系可被Cumate诱导表达APOL1,且不同浓度的Cumate对细胞表达载脂蛋白L1有不同的影响。Real-time PCR和Western blot均证明在诱导48 h后,随着诱导剂浓度的增加,APOL1表达增多,在Cumate为50μg/ml时APOL1达到最高值。结论成功构建了可诱导表达APOL1基因的293T细胞系,为研究APOL1在EV71感染人体细胞过程中的作用机制提供了稳定的实验材料。 展开更多
关键词 可诱导表达 载脂蛋白L1 慢病毒 细胞系构建
褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析 认领 被引量:2
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作者 陈静 张道伟 钱正敏 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期44-51,共8页
为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens(St錶)酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1(GenBank No.:ALE32751)和NlPPO2(GenBank No.:ALE32752)全长序列,褐飞虱NlPPO1... 为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens(St錶)酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1(GenBank No.:ALE32751)和NlPPO2(GenBank No.:ALE32752)全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。 展开更多
关键词 褐飞虱 酚氧化酶原 特性 表达模式 诱导表达
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诱导表达人IFITM3的293细胞株的建立及其对H1N1型流感病毒侵染作用 认领
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作者 侯志飞 蒋栋 +1 位作者 赵学森 曾辉 《中华实验和临床感染病杂志(电子版)》 CAS 2018年第2期198-203,共6页
目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。方法构建IFITM3/pc DNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用... 目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。方法构建IFITM3/pc DNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹(Western blot)和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测。结果建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%(t=38.08、P〈0.001),使水泡性口炎假病毒(VSVpp)感染率下降68%(t=54.56、P〈0.001),而阴性对照组小鼠白血病假病毒(MLVpp)感染率(t=1.282、P=0.2208)和拉沙假病毒(LASVpp)感染率(t=0.4814、P=0.6377)无显著影响。结论 IFITM3蛋白诱导表达细胞株可以显著抑制H1N1型流感病毒感染,为进一步深入研究IFITM3抑制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础。 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3 H1N1型流感病毒 假病毒 诱导表达 防御分子
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修饰的pfu酶与T7ssb蛋白在聚合酶链式反应中的应用 认领
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作者 刘明珠 秦中强 +3 位作者 杨天华 陈勇 李永海 李正红 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期2220-2227,共8页
表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因... 表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因组DNA,以该基因组DNA为模板,利用pfu酶扩增c-met基因;同时从A549中提取总RNA,经过逆转录反应后,以逆转录产物c DNA为模板,分别利用pfu酶和pfu-sso7d酶扩增PD-L1基因,对比两种酶的DNA扩增效率;从MC38细胞中提取鼠的基因组DNA,以此基因组DNA为模板,分别用pfu-sso7d和pfu-sso7d联合T7ssb蛋白扩增Trp53基因,对比两种PCR反应体系的扩增效率。我们成功的将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,并成功的诱导表达并纯化了这三种蛋白;用pfu酶成功的扩增出c-met基因;对比pfu酶,pfu-sso7d表现出较高的DNA扩增效率;在扩增Trp53基因的PCR反应体系中,同单独使用pfu-sso7d酶相比,pfu-sso7d联合T7ssb蛋白在PCR反应体系中可以提高PCR产物的量,约1.7倍。本次研究表明,利用纯化的pfu-sso7d蛋白和T7ssb蛋白,我们构建了优化的PCR反应体系。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 PFU DNA聚合酶 T7单链结合蛋白 重组蛋白诱导表达 蛋白纯化
黑曲霉单宁酶基因在毕赤酵母中的表达 认领
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作者 唐佳代 周罗娜 +3 位作者 邱树毅 吴鑫颖 胡娜 王艳 《食品科技》 CAS 北大核心 2018年第9期47-55,共9页
单宁酶(EC3.1.1.20)在食品、化工及医药等领域应用广泛,期望通过单宁酶在毕赤酵母中的表达来提高单宁酶的产量。以经室温常压等离子体诱变技术诱变得到的较高产单宁酶的黑曲霉B1401的总DNA为模板,PCR扩增获得单宁酶基因(tan)后构建... 单宁酶(EC3.1.1.20)在食品、化工及医药等领域应用广泛,期望通过单宁酶在毕赤酵母中的表达来提高单宁酶的产量。以经室温常压等离子体诱变技术诱变得到的较高产单宁酶的黑曲霉B1401的总DNA为模板,PCR扩增获得单宁酶基因(tan)后构建重组表达载体pPIC9K-tan,通过电转化至毕赤酵母GS115,利用甲醇诱导培养重组菌获得单宁酶。单宁酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为5.0,最高酶活力可达到34.25 U/g,相较于黑曲霉B1401产单宁酶活力提高了1.38倍,Ca^2+、Fe^3+、Mn^2+等金属离子对重组单宁酶酶活力影响不大。实验结果表明实现了单宁酶在毕赤酵母中的高效表达。 展开更多
关键词 单宁酶 黑曲霉 毕赤酵母 诱导表达 酶学性质
基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析 认领
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作者 曹婷婷 杜寿文 +11 位作者 许汪 邢彬 赵飞 王茂鹏 朱羿龙 白杰英 田宇飞 刘立明 赵翠青 周义发 李昌 金宁一 《高等学校化学学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期770-777,共8页
利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒p TRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒p LVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分... 利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒p TRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒p LVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/m L,诱导12 h时IFITM3+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础. 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3 干扰素刺激基因 诱导表达 病毒进入 抑制
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Molecular cloning and functional identification of sterol C24-methyltransferase gene from Tripterygium wilfordii 认领 被引量:2
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作者 Hongyu Guan Yujun Zhao +9 位作者 Ping Su Yuru Tong Yujia Liu Tianyuan Hu Yifeng Zhang Xianan Zhang Jia Li Xiaoyi Wu Luqi Huang Wei Gao 《药学学报:英文版》 CSCD 2017年第5期603-609,共7页
Sterol C24-methyltransferase(SMT) plays multiple important roles in plant growth and development. SMT1, which belongs to the family of transferases and transforms cycloartenol into 24-methylene cycloartenol, is involv... Sterol C24-methyltransferase(SMT) plays multiple important roles in plant growth and development. SMT1, which belongs to the family of transferases and transforms cycloartenol into 24-methylene cycloartenol, is involved in the biosynthesis of 24-methyl sterols. Here, we report the cloning and characterization of a cDNA encoding a sterol C24-methyltransferase from Tripterygium wilfordii(Tw SMT1). Tw SMT1(Gen Bank access number KU885950) is a 1530 bp cDNA with a 1041 bp open reading frame predicted to encode a 346-amino acid, 38.62 k Da protein. The polypeptide encoded by the SMT1 cDNA was expressed and purified as a recombinant protein from Escherichia coli(E. coli) and showed SMT activity. The expression of Tw SMT1 was highly up-regulated in T. wilfordii cell suspension cultures treated with methyl jasmonate(Me JA). Tissue expression pattern analysis showed higher expression in the phellem layer compared to the other four organs(leaf, stem, xylem and phloem), which is about ten times that of the lowest expression in leaf. The results are meaningful for the study of sterolbiosynthesis of T. wilfordii and will further lay the foundations for the research in regulating both the content of other main compounds and growth and development of T. wilfordii. 展开更多
枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的诱导及组成型表达 认领
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作者 朱颖 马晓强 +2 位作者 杨胜利 魏东芝 苏二正 《生物加工过程》 CAS 2017年第2期21-29,共9页
本研究构建了8种诱导型质粒和16种组成型质粒,试图实现枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)基因在大肠杆菌中的高效异源表达。经过筛选,最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL_3基因、trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒p B... 本研究构建了8种诱导型质粒和16种组成型质粒,试图实现枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)基因在大肠杆菌中的高效异源表达。经过筛选,最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL_3基因、trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒p B1-SIL_3-K为最佳表达质粒。将PB1-SIL_3-K转入Escherichia coli DH5α,重组菌在37℃发酵培养24 h,其OD值达到5.4,酶活达到了138.61 U/mL。进一步通过培养基组成、培养条件、放大过程等优化,在7 L发酵罐上,CAH最高酶活达到1 340 U/mL,为目前国内外文献报道最高水平。 展开更多
关键词 头孢菌素C脱乙酰基酯酶 诱导型表达 组成型表达 3'-脱乙酰基-7-氨基头孢烷酸
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藻胆蛋白在大肠杆菌中的重组表达及其光谱学性质与抗氧化活性研究 认领 被引量:1
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作者 朱晓文 陈华新 +3 位作者 齐宏涛 姜鹏 李富超 李荣贵 《现代食品科技》 北大核心 2017年第7期43-49,共7页
在大肠杆菌中进行了藻胆蛋白的重组表达,对重组藻胆蛋白进行了分离纯化,测定了重组藻胆蛋白的光谱学性质和抗氧化活性。结果表明,以IPTG为诱导物时,当菌液OD(600)为0.95时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG和5.0 mmol/L的5-氨基酮戊酸(... 在大肠杆菌中进行了藻胆蛋白的重组表达,对重组藻胆蛋白进行了分离纯化,测定了重组藻胆蛋白的光谱学性质和抗氧化活性。结果表明,以IPTG为诱导物时,当菌液OD(600)为0.95时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG和5.0 mmol/L的5-氨基酮戊酸(ALA),在18℃条件下诱导24 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达149.5 mg/L;以乳糖为诱导物时,当菌液OD(600)为1.2时,加入终浓度为1.0 g/L的乳糖和5 mmol/L的ALA,在18℃条件下诱导26 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达102.9 mg/L。重组藻胆蛋白最大吸收峰位于550 nm,最大荧光发射峰位于562 nm,相对于IPTG诱导表达的重组藻胆蛋白,经乳糖诱导表达重组藻胆蛋白,其550 nm处具有较强的光吸收,562 nm处具有较高荧光强度,同时也具有较高的羟基自由基和超氧阴离子的清除能力。 展开更多
关键词 藻胆蛋白 乳糖 IPTG 诱导表达 抗氧化活性
一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统 认领
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作者 周小玲 熊小芳 +1 位作者 谢庆东 孙平楠 《癌变.畸变.突变》 CAS CSCD 2017年第4期266-271,共6页
目的:建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响.方法:采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率.... 目的:建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响.方法:采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率.应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素(Dox)诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1(MTA1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)、上皮型钙黏附素1(CDH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)mRNA的表达水平.结果:重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1:1或2:1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%.应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达.其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组(不加Dox诱导)的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高(P均〈0.05),而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低(P均〈0.05).结论:成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础. 展开更多
关键词 HBX 人原代肝细胞 诱导表达 慢病毒载体
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枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达 认领 被引量:1
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作者 王东 钟涛 +4 位作者 孙荣 何周凤 唐自钟 布同良 陈惠 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2017年第3期906-910,共5页
本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组... 本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组体。在25℃,110r/min条件下,用IPTG诱导重组蛋白表达。表达蛋白用SDS.PAGE验证,并对酶活力进行测定。测序结果表明克隆序列与NCBI上的登录的序列同源性高达99%。SDS-PAGE结果表明诱导出的蛋白相对分子质量56.6kD,酶活力达到39U/mL。证明成功克隆得到枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶 基因的克隆 诱导表达
钙离子和水杨酸诱导灵芝多糖和三萜的合成 认领 被引量:15
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作者 叶丽云 林强 +1 位作者 刘梅 吴小平 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期220-228,共9页
灵芝多糖和三萜是灵芝主要的药理活性物质。如何提高液体发酵中灵芝多糖和三萜的含量是目前研究的热点。本研究以J‐7/AL‐2菌株为例,在灵芝的液体发酵中加入10mmol/L钙离子诱导,多糖含量比对照提高34%,三萜含量提高64%。在发酵液中加入... 灵芝多糖和三萜是灵芝主要的药理活性物质。如何提高液体发酵中灵芝多糖和三萜的含量是目前研究的热点。本研究以J‐7/AL‐2菌株为例,在灵芝的液体发酵中加入10mmol/L钙离子诱导,多糖含量比对照提高34%,三萜含量提高64%。在发酵液中加入150μmol/L水杨酸(SA)诱导,多糖含量提高57.54%,三萜含量提高37.19%。在灵芝的液体发酵第12天加入10mmol/L钙离子和150μmol/L水杨酸,三萜含量提高46.9%。在不同诱导条件下,三萜的高效液相图谱(HPLC)显示钙离子与对照的差异性比较大。灵芝三萜关键酶基因的表达也有所不同。水杨酸提高法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SQS)和羊毛兹醇合酶(LS)基因的表达量,而钙离子和钙离子与水杨酸共同处理提高3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A转录水平还原酶(HMGR)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SQS)和羊毛兹醇合酶(LS)6个三萜关键酶基因的表达量。在3种处理下,都是SQS的基因表达量提高最多,推测SQS基因是灵芝三萜合成过程中重要的基因。 展开更多
关键词 灵芝 多糖 三萜 诱导表达
可诱导性表达多种流感病毒HA蛋白稳定细胞系新型构建方法的研究 认领
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作者 张艳晶 韩连连 +2 位作者 郭丽 钟辉 王健伟 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2017年第2期157-161,共5页
目的 建立一条创新性的技术路线快速构建可诱导性表达多种甲型流感病毒(IAV)HA蛋白的细胞系.方法 将多种IAV的HA蛋白基因连接到含有PiggyBac转座子位点的Cumate诱导表达系统中,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293A细胞系,利用嘌呤霉素... 目的 建立一条创新性的技术路线快速构建可诱导性表达多种甲型流感病毒(IAV)HA蛋白的细胞系.方法 将多种IAV的HA蛋白基因连接到含有PiggyBac转座子位点的Cumate诱导表达系统中,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293A细胞系,利用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并用Cumate诱导相应病毒蛋白表达. 结果 流式细胞仪检测及Western blot检测结果均表明,加入诱导剂Cumate后,获取的细胞系中绝大部分细胞均开始表达相应的病毒蛋白.结论 利用PiggyBac转座子可以高效率的构建诱导性表达IVA HA蛋白的细胞系. 展开更多
关键词 流感病毒 PIGGYBAC转座子 诱导性表达 细胞系构建
斑马鱼IRF11基因的鉴定、亚细胞定位及表达特征 认领 被引量:1
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作者 熊亚玮 张义兵 桂建芳 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期1-8,共8页
早期的研究表明IRF11是鱼类特有的IRF家族成员。查询最近解析的斑马鱼第九版基因组时,发现斑马鱼IRF1和IRF11命名出现了混乱。通过对脊椎动物IRF1和IRF11基因位点进行同线型分析表明, IRF11与IRF1是两个不同的基因,不宜命名为IRF1b和IR... 早期的研究表明IRF11是鱼类特有的IRF家族成员。查询最近解析的斑马鱼第九版基因组时,发现斑马鱼IRF1和IRF11命名出现了混乱。通过对脊椎动物IRF1和IRF11基因位点进行同线型分析表明, IRF11与IRF1是两个不同的基因,不宜命名为IRF1b和IRF1a。系统进化树分析发现,在脊椎动物中IRF11基因比IRF1起源更早;两栖类以后的脊椎动物基因组只有IRF1,没有IRF11,其中原因可能是因为基因丢失。斑马鱼IRF11与脊椎动物IRF1一样,其表达蛋白定位在细胞核中。缺失分析揭示斑马鱼IRF11的DBD有一个能引导蛋白定位进入细胞核的序列。表达分析发现poly (I:C)能诱导斑马鱼IRF11的表达,但其表达水平低于IRF1。 展开更多
关键词 斑马鱼 IRF11 亚细胞定位 表达
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