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家蚕微孢子虫极管蛋白2(NbPTP2)的表达、纯化和定位特征 预览
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作者 易敏 吕青 +4 位作者 刘柯柯 王礼君 吴玉娇 周泽扬 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1830-1838,共9页
[目的]微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nos... [目的]微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白 2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。[方法]克隆家蚕微孢子虫 NbPTP2。利用 Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0 和 NetPhos 3.1 Server 等在线软件对 NbPTP2 的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用 MEGA 7.0 软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白 2 的系统进化树。通过克隆 NbPTP2,将其与原核表达载体 pET32a(+)连接,构建 pET32a(+)-NbPTP2 重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta 中,IPTG 诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测 NbPTP2 在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析 NbPTP2 在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。[结果]成功克隆并获得长为 834 bp 的 NbPTP2基因序列,该蛋白编码 278 个氨基酸残基,理论分子质量为 30.9 kD,等电点为 9.39,无跨膜结构域,N 端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫 NbPTP2 与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫 NcPTP2 的亲缘关系最近。Western blot 结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为 39 kD。IFA 定位特征分析结果显示,NbPTP2 能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。[结论]明确了 NbPTP2 与其他微孢子虫极管蛋白 2 的亲缘关系,NbPTP2 在成熟家蚕微孢子虫中有表达, 展开更多
关键词 家蚕 家蚕微孢子虫 极管蛋白 2 原核表达 定位分析
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家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰 被引量:1
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作者 谭瑶瑶 +4 位作者 刘柯柯 吴玉娇 吕青 潘国庆 周泽扬 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2018年第9期1460-1468,共9页
极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其... 极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其插入带有V5和His标签的真核表达载体pMT/Bip/V5-His A中,成功构建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重组质粒,经转染果蝇S2细胞后,发现NbPTP1基因能在果蝇细胞中高效表达。此外,Lectin blotting和β-消除反应分析结果表明:果蝇S2细胞内表达的NbPTP1具有O-糖基化修饰特征。以上结果为研究NbPTP1的糖基化修饰特征与其功能之间的关系提供了基础,有助于揭示微孢子虫侵染机制,建立可行有效的微孢子虫病诊断和防治措施。 展开更多
关键词 极管蛋白1 果蝇S2细胞 糖基化 家蚕微孢子虫
家蚕C-型凝集素11基因BmCTL11的克隆及表达分析
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作者 季小存 李春峰 +7 位作者 孙滨 郑容 李致宏 陈洁 李田 潘国庆 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期627-635,共9页
昆虫的C-型凝集素参与先天免疫系统中细胞间的相互作用,家蚕C-型凝集素11(C-type lectins,CTL11)基因BmCTL11是经家蚕微孢子虫(Nb)感染诱导后在蚕体内持续高量表达的基因。用生物信息学方法分析BmCTL11基因编码有307个氨基酸的多肽... 昆虫的C-型凝集素参与先天免疫系统中细胞间的相互作用,家蚕C-型凝集素11(C-type lectins,CTL11)基因BmCTL11是经家蚕微孢子虫(Nb)感染诱导后在蚕体内持续高量表达的基因。用生物信息学方法分析BmCTL11基因编码有307个氨基酸的多肽,预测分子质量34.51 kD,等电点4.69,含2个串联的典型C-型凝集素糖识别结构域,与烟草天蛾的IML-1蛋白进化距离最近。RT-PCR检测BmCTL11基因在家蚕幼虫时期的转录水平较高,并在多个组织有转录。将灭活的家蚕病原细菌、真菌、微孢子虫、病毒等注射家蚕5龄幼虫后的24 h内,qRT-PCR检测BmCTL11基因在幼虫脂肪体和中肠组织内的转录水平均发生上调,说明该基因能够被多种病原微生物诱导。以家蚕5龄第3天幼虫脂肪体c DNA为模板克隆了BmCTL11基因,连接到p ET-32a载体,诱导表达后将纯化的融合蛋白免疫昆明鼠制备出效价为1∶102 400的BmCTL11多克隆抗体。Western blot分析结果显示,BmCTL11蛋白可能以二聚体形式主要分布于家蚕脂肪体、血浆、中肠、表皮等组织中,推测BmCTL11在家蚕识别病原微生物并介导引发进一步的先天免疫反应过程中有重要的作用。 展开更多
关键词 家蚕 C-型凝集素11 基因克隆 表达谱 微生物诱导 多克隆抗体
几种常见桑树病害的识别与防治 预览 被引量:3
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作者 徐伟芳 王爱印 +4 位作者 舒平 任慧爽 陈洁 谢洁 《蚕学通讯》 2015年第2期22-30,35共10页
桑树是蚕桑产业的重要物质基础。为确保桑树健康成长,促进产业发展,桑树病害的有效识别与及时防控尤为重要。真核微生物、原核微生物及非细胞类病毒中均存在能引发桑树传染性病害的病原微生物。其中由真核微生物引起的桑里白粉病与桑椹... 桑树是蚕桑产业的重要物质基础。为确保桑树健康成长,促进产业发展,桑树病害的有效识别与及时防控尤为重要。真核微生物、原核微生物及非细胞类病毒中均存在能引发桑树传染性病害的病原微生物。其中由真核微生物引起的桑里白粉病与桑椹菌核病,原核微生物引起的桑青枯病与桑疫病是爆发频繁、危害极大的桑树病害。本文就这四种桑树病害的病原、侵染循环、病害识别及防治方法等进行系统梳理,并简要介绍几种非细胞类微生物引起的桑树病害,以期为生产上防治相关病害提供参考。 展开更多
关键词 桑树病害 桑里白粉病 桑椹菌核病 桑青枯病 桑疫病 识别防治
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微孢子虫极管蛋白的研究进展 被引量:3
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作者 吴玉娇 +5 位作者 陈洁 潘国庆 李春峰 李田 陈果 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期917-923,共7页
微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核微生物,可以感染无脊椎动物、脊椎动物乃至人类,引发的微孢子虫病对人类健康或经济动物生产造成严重危害。所有微孢子虫都拥有一个特殊的侵染结构——极管。极管蛋白(polar tube protein,PTP)特异... 微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核微生物,可以感染无脊椎动物、脊椎动物乃至人类,引发的微孢子虫病对人类健康或经济动物生产造成严重危害。所有微孢子虫都拥有一个特殊的侵染结构——极管。极管蛋白(polar tube protein,PTP)特异定位于微孢子虫极管上,是组装极管的重要成分。本文综述了国内外有关微孢子虫极管蛋白的发现、分类、特征以及功能等方面的研究成果,重点介绍了3种主要极管蛋白PTP1、PTP2、PTP3的氨基酸组成特征、溶解特性和翻译后修饰特征,概述了ptp1、ptp2基因保守座位,PTP1、PTP2、PTP3蛋白之间的互作关系,以及极管蛋白在微孢子虫增殖与侵染宿主过程中发挥的生物学功能。微孢子虫极管蛋白的研究成果对于揭示微孢子虫侵染机制,准确诊断与有效防治微孢子虫病具有重要的理论和实用价值。 展开更多
关键词 微孢子虫 极管蛋白 生物学特征 功能
家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)的基因克隆及原核表达 被引量:4
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作者 吴玉娇 +5 位作者 陈洁 李治 李致宏 潘国庆 李田 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期258-264,共7页
极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和免脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO-7g0016。序列特征分析表明该基因编码富... 极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和免脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO-7g0016。序列特征分析表明该基因编码富含脯氨酸的409个氨基酸,预测蛋白质分子质量39.6kD,蛋白质序列的N端具有信号肽,有40个潜在的O-糖基化位点和17个磷酸化位点。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆NBO~7g0016基因,并构建插入该基因的重组质粒,转化E.coliBL21(DE3)进行原核表达,融合蛋白经亲和层析纯化后免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹实验证明该基因编码的蛋白质在成熟孢子中有表达,间接免疫荧光实验将蛋白质定位于家蚕微孢子虫的极管,确证该蛋白质为家蚕微孢子虫极管蛋白l(NbPTPl,GenBank登录号:EOBl5198.1)。初步推测家蚕微孢子虫极管蛋白1具有糖基化修饰特征。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 极管蛋白1 基因克隆 原核表达 免疫印迹分析 间接免疫荧光分析
家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析 被引量:1
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作者 党晓群 林立鹏 +4 位作者 李春峰 潘国庆 李田 周泽扬 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期300-307,共8页
【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过... 【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N. bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a(+)载体中进行诱导表达。通过SDS-PAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列(GenBank登录号为EOB13854.1)全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 ADP ATP转运蛋白 原核表达 免疫印迹 亚细胞定位
浅谈蚕桑专业《发酵工程》课程教学改革 预览
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作者 谢洁 《蚕学通讯》 2014年第4期59-61,共3页
针对蚕桑专业新型人才培养的需要,从优化更新教学内容、完善教学方法手段、整合多种考核方法等方面对发酵工程课程进行了教学改革探索。以期提高教学质量,提升学生自主学习和创新能力,把学生培养成应用型、创新型人才,更好地为蚕桑产业... 针对蚕桑专业新型人才培养的需要,从优化更新教学内容、完善教学方法手段、整合多种考核方法等方面对发酵工程课程进行了教学改革探索。以期提高教学质量,提升学生自主学习和创新能力,把学生培养成应用型、创新型人才,更好地为蚕桑产业发展服务。 展开更多
关键词 蚕桑专业 发酵工程 课程改革 创新型人才
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家蚕微孢子虫蛋白水解酶的活性检测及质谱鉴定和序列分析 被引量:2
9
作者 党晓群 马强 +5 位作者 林立鹏 李春峰 李田 潘国庆 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期 281-287,共7页
微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶... 微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶类的活性。采用质谱法分析该类蛋白酶主要是锌离子依赖型的细胞质型亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶。细胞质型亮氨酰氨肽酶序列是由1 515个碱基编码的505个氨基酸组成,无信号肽,有2个潜在的锌离子结合部位,属于金属蛋白酶M17家族;丝氨酸蛋白酶具有肽酶S8结构域和跨膜域。通过序列比对发现在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中均有这2种酶,且相似度较高,其进化较为保守。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 蛋白水解酶 酶活性 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱 序列特征
家蚕微孢子虫总蛋白两条大分子量主带的LC—MS/MS分析 预览 被引量:1
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作者 周小伟 +4 位作者 陈洁 党晓群 李田 潘国庆 周泽扬 《蚕学通讯》 2012年第4期1-8,共8页
为了深入认识家蚕微孢子虫高分子量蛋白的主要组成,我们采用LC—MS/MS技术鉴定分析玻璃珠破碎法提取的家蚕微孢子虫总蛋白中85kD以上两条主要蛋白带。我们从H1带(位于150~200kD之间)中成功鉴定出16个蛋白,包括极管蛋白3(PTP3)... 为了深入认识家蚕微孢子虫高分子量蛋白的主要组成,我们采用LC—MS/MS技术鉴定分析玻璃珠破碎法提取的家蚕微孢子虫总蛋白中85kD以上两条主要蛋白带。我们从H1带(位于150~200kD之间)中成功鉴定出16个蛋白,包括极管蛋白3(PTP3)、极管蛋白2(PTP2)、真核蛋白翻译起始因子(eIF2C2)、延伸因子(EFlalpha、EF2)、肌动蛋白(actin)等。这暗示两种结构蛋白PTP3与PTP2以及蛋白翻译延伸因子(EFlalpha、EF2)与肌动蛋白(actin)可能各形成一个复合体。并且用SDS或B一巯基乙醇处理时,这两个复合物是稳定的,表明这些复合物的相互作用力不仅仅是通过二硫键。H2带(85~100kD)鉴定出主要集中在水解酶、蛋白合成与折叠、细胞结构、运动四个方面的20多个的蛋白。从两条蛋白带鉴定出PTP3与PTP2、三磷酸腺苷酶(ATPase)或过渡期内质网三磷酸腺苷酶(ATPaseTER94)、蛋白翻译因子(eIF2C、EFl一alpha、EF2)、HSP70、Actin、M1家族氨肽酶1(M1familyaminopeptidase)6类蛋白。基于蛋白分子质量分析,暗示在家蚕微孢子虫中,这6类蛋白都可能是以复合体形式呈现的。研究结果丰富家蚕微孢子虫高分子量蛋白的数据,同时,为研究非二硫键间的蛋白互作提供了有价值的研究线索。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 极管蛋白 蛋白互作 LC-MS MS
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