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拉达克轮丝菌TGase在大肠杆菌中的分子改造
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作者 王玉 付丽红 +2 位作者 王丽敏 于波 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1320-1326,共7页
【背景】谷氨酰胺转氨酶是一种能够催化酰基转移反应的酶,催化各种蛋白质分子之间或之内发生交联反应,在食品、化妆品、医药等领域具有重要的潜在价值。【目的】克隆来自拉达克轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum) B1的谷氨酰胺转氨... 【背景】谷氨酰胺转氨酶是一种能够催化酰基转移反应的酶,催化各种蛋白质分子之间或之内发生交联反应,在食品、化妆品、医药等领域具有重要的潜在价值。【目的】克隆来自拉达克轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum) B1的谷氨酰胺转氨酶(TGase)基因并对其进行分子改造,使其在大肠杆菌中获得高效异源表达。【方法】分别克隆来自拉达克轮丝菌谷氨酰胺转氨酶的自身前导肽(pro)和除前导肽以外的成熟谷氨酰胺转氨酶(TGase)基因,以pET-22b为表达载体构建pro、TGase共表达和融合表达两种表达模式,在这两种表达模式的基础上进一步用定点突变的方法对成熟TGaseN端前4个氨基酸进行改造,检测不同表达模式以及突变对酶活的影响。【结果】当采用前导肽与TGase共表达时,可以直接得到活性形式的TGase,比酶活达到37.71 U/mg。在融合表达的基础上,将TGaseN端前3个氨基酸DSD突变为AAA,比酶活达到14.04U/mg,相较于原始表达模式提高了14.05%。【结论】前导肽与TGase共表达可以直接产生活性TGase,对于融合表达模式,合适位点的突变有利于提高TGase酶活。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转氨酶 表达模式 定点突变 酶活
铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶的酶学特性及菌株检测 预览
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作者 牛晓平 韩卿卿 +2 位作者 何广正 徐书景 《河北师范大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第1期67-75,共9页
铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌... 铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌;根据同源蛋白的核苷酸序列设计菌株6-3中丙氨酸消旋酶的扩增引物,通过PCR从6-3菌株中克隆获得了丙氨酸消旋酶基因(alrPa),基因序列与P. aeruginosa PAO1中丙氨酸消旋酶AlrPAO1的氨基酸同源率为98.9%,存在4个不一致的氨基酸位点;经原核表达、Ni-NTA亲和层析法纯化获得了蛋白PaAlr,酶学特性分析表明,重组蛋白PaAlr的最适反应温度为40℃,最适反应pH=10.0;最适底物是L-Ala,具有严格的底物特异性,Km,L-Ala=10.96mmol/L,Vmax,L-Ala=1 562μmol/(L·min),Km,D-Ala=8.45mmol/L,Vmax,D-Ala=881.9μmol/(L·min),其最大反应速率约为AlrPAO1的7倍;以铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶为检测对象,以PCR和Western-blotting 2种方法对铜绿假单胞菌进行检测,实验发现,在目的基因序列已知的前提下,采用PCR法具有较好的检测灵敏性和专一性. 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 丙氨酸消旋酶 16S RRNA基因 菌株检测
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腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶底物通道氨基酸位点的功能
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作者 何广正 韩卿卿 +2 位作者 徐书景 赵宝华 《微生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第8期1397-1406,共10页
【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性... 【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。【结果】通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15°C,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降。【结论】丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。 展开更多
关键词 丙氨酸消旋酶 底物通道 保守氨基酸位点 定点突变 酶学特性
雾霾中库克菌属细菌的分离鉴定及药物敏感性分析
4
作者 李亚子 李丽婕 +3 位作者 徐保红 白萍 吕国平 《环境与健康杂志》 北大核心 2017年第9期835-837,F0003共4页
目的 对雾霾中分离的库克细菌进行种属鉴定和药敏实验,研究环境中库克菌属细菌的分布状态、生化特性和耐药特征。方法 于2016年冬季雾霾环境下使用空气撞击法收集距地面10~15 m的空气微生物,将分离的细菌纯化培养后进行革兰染色、16S r ... 目的 对雾霾中分离的库克细菌进行种属鉴定和药敏实验,研究环境中库克菌属细菌的分布状态、生化特性和耐药特征。方法 于2016年冬季雾霾环境下使用空气撞击法收集距地面10~15 m的空气微生物,将分离的细菌纯化培养后进行革兰染色、16S r DNA序列分析、生化鉴定和耐药性分析。结果 8株细菌经16S r DNA测序分析确定为库克菌属细菌,为革兰阳性球菌;经VITEK 2革兰阳性细菌鉴定卡分析,8株菌鉴定为玫瑰色库克菌;其对青霉素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、丙酰胺类、四环素类、安沙霉素类等6类药物有不同程度的敏感,个别菌株对氟喹诺酮类、头孢类、大环内酯类、林可霉素类药物的耐药性表现为中介,未发现耐药株。结论 雾霾空气中存在少量的条件致病菌玫瑰色库克菌,该菌对大部分抗生素敏感。 展开更多
关键词 玫瑰色库克菌 雾霾 16SrDNA 耐药性
外源精氨酸对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖胁迫下生长和发酵特性的影响
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作者 吕红芳 王浩 +2 位作者 徐宁 刘君 《微生物学通报》 CSCD 北大核心 2017年第11期2539-2546,共8页
【目的】探究外源添加不同氨基酸和相容性溶质对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)在高糖胁迫环境下生长的影响及可能的作用机理。【方法】通过在培养基中外源添加各种氨基酸和相容性溶质,研究其对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖和... 【目的】探究外源添加不同氨基酸和相容性溶质对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)在高糖胁迫环境下生长的影响及可能的作用机理。【方法】通过在培养基中外源添加各种氨基酸和相容性溶质,研究其对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖和高蔗糖胁迫下生长的影响,并分析添加精氨酸对高葡萄糖胁迫下菌株糖转运和代谢途径中关键酶转录水平的影响,以及对菌株发酵产氨基酸的影响。进一步探究了碱性氨基酸在其它棒状杆菌属中抵御高葡萄糖胁迫的潜在作用。【结果】在高葡萄糖胁迫条件下,外源添加赖氨酸、精氨酸和组氨酸后谷氨酸棒杆菌的生物量分别提高54.7%、50.0%和37.6%;而在高蔗糖胁迫条件下,添加脯氨酸和四氢嘧啶后菌株生物量增加20%以上。进一步研究表明,在高葡萄糖胁迫下,外源添加精氨酸后谷氨酸棒杆菌的葡萄糖利用速率提高约2.5倍,谷氨酸的发酵产量也增加了127.5%。此外,碱性氨基酸对其它4种棒状杆菌也具有一定的渗透保护效应。【结论】精氨酸对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖胁迫下具有良好的渗透保护作用,可能归因于其能促进葡萄糖的转运和代谢能力,同时发现碱性氨基酸的渗透保护效应对棒状杆菌属具有一定的普遍性。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 高糖胁迫 精氨酸 发酵
反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及表达 预览 被引量:1
6
作者 张琳琳 张庆 +3 位作者 李莉 徐书景 张金秀 《河北师范大学学报:自然科学版》 CAS 2017年第4期341-347,共7页
L-羟脯氨酸用途非常广泛,具有较好的应用价值,利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶能将L-脯氨酸通过生物转化法生成反式-4-羟基-L-脯氨酸.对指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及蛋白可溶性表... L-羟脯氨酸用途非常广泛,具有较好的应用价值,利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶能将L-脯氨酸通过生物转化法生成反式-4-羟基-L-脯氨酸.对指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及蛋白可溶性表达条件进行了探索.基因p4hy的GC摩尔百分含量由73.63降至61.45;在23℃下,加入1mmol/L IPTG及分子伴侣pG-KJE8后可溶性蛋白的含量明显增多;密码子优化后的酶蛋白P4HY具有较好的催化生产羟脯氨酸的能力,反应40h后转化率达到72.8%. 展开更多
关键词 反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶 密码子优化 指孢囊菌 羟脯氨酸
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猪肺炎支原体168弱毒菌株P65-DnaKc融合蛋白的表达及免疫原性 被引量:2
7
作者 刘思远 刘东 +2 位作者 关婉怡 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1463-1467,共5页
研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株融合蛋白P65-DnaKc免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株p65和dnaKc基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28α-P65,pET-28α-DnaKc以及p... 研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株融合蛋白P65-DnaKc免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株p65和dnaKc基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28α-P65,pET-28α-DnaKc以及pET-28α-P65-DnaKc,经原核表达并纯化获得的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验,记录分析试验结果。经间接ELISA试验证明单蛋白P65、DnaKc以及融合蛋白P65-DnaKc均具有良好的免疫原性,血清效价分别为:1∶12 800、1∶51 200和1∶204 800,融合蛋白的血清抗体效价明显高于单蛋白;攻毒试验证明,P65-DnaKc重组蛋白疫苗的保护率可达90%。融合蛋白P65-DnaKc具有良好的优于P65和DnaKc单蛋白的免疫原性。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 P65基因 dnaKc基因 融合蛋白
假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶的晶体制备及X-射线衍射研究 被引量:1
8
作者 杨江丽 王青青 +4 位作者 徐书景 关婉怡 赵宝华 董辉 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1468-1474,共7页
【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及x-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni—NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,2... 【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及x-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni—NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100K下通过x-射线衍射仪(Rigaku MicroMax-007HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白却EctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5mg/mL及含有0.2mol/LMgCl2·6H2O,0.1mol/LBis—TrispH6.5,25%(W/V)聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360μm×240μm×60μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40A,空间群为三斜晶系Pl,晶胞参数为a=45.18°A,b=58.87°A,c=68.81°A,a=77.48°,β=86.03°,y=66.97°,每个不对称单位中含有2个BpEctD单体,马修斯系数为2.44°A3/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌0F4四氢嘧咛粹化酶三维结构的解析奠定了前期某础.将有助于阐明四氡嘧啶粹化酶的催化机制。 展开更多
关键词 假坚强芽孢杆菌OF4 四氢嘧啶羟化酶 结晶 X-射线衍射
巨大芽孢杆菌WSH-002丙氨酸脱氢酶066晶体制备及X-射线衍射分析
9
作者 胡平雄 王青青 +3 位作者 关婉怡 董辉 徐书景 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1071-1076,共6页
丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸,在氨基酸和酮酸的合成及代谢中至关重要.本研究通过PCR从巨大芽孢杆菌WSH-002中克隆并构建了丙氨酸脱氢酶基因(aldBM066)的原核表达载体,经原核表达后,采用Ni-NTA亲和层析法和阴离子交换色... 丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸,在氨基酸和酮酸的合成及代谢中至关重要.本研究通过PCR从巨大芽孢杆菌WSH-002中克隆并构建了丙氨酸脱氢酶基因(aldBM066)的原核表达载体,经原核表达后,采用Ni-NTA亲和层析法和阴离子交换色谱法纯化获得蛋白AldBM066,在289 K下以座滴法进行晶体生长条件筛选和制备.通过对蛋白质结晶条件的筛选,最终在蛋白质浓度为15 mg/mL及含有0.1 mol/L乙酸钠(p H 5.0)和2.4 mol/L甲酸钠的缓冲液中获得了理想的蛋白质晶体,晶体大小约为210μm×180μm×150μm,X-射线衍射数据显示,该蛋白质晶体衍射分辨率为2.88,空间群为三方晶系,晶胞参数为a=b=118.71,c=150.51,α=β=90°,γ=120°,每个不对称单位中含有1个AldBM066单体,马修斯系数为2.623/Da,溶剂含量约为53.02%.衍射数据的成功收集为解析巨大芽孢杆菌WSH-002中丙氨酸脱氢酶的三维结构奠定了前期基础,将有助于阐明以单体存在的丙氨酸脱氢酶的催化机制. 展开更多
关键词 丙氨酸脱氢酶 结晶 巨大芽孢杆菌WSH-002 X-射线衍射
原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性 被引量:2
10
作者 冯利伟 郭姣洁 +3 位作者 李辉欣 徐书景 赵宝华 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期897-904,共8页
【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用Qui... 【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明,ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为D-Phe外,其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数kcat/Km表示,对于底物D-Met或D-Phe,ApDAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上。【结论】ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值。 展开更多
关键词 原玻璃蝇节杆菌 D-氨基酸氧化酶 定点突变 二级表观常数
四氢嘧啶羟化酶的研究进展 预览 被引量:1
11
作者 张庆 王青青 +1 位作者 徐书景 《生物技术通讯》 CAS 2014年第5期719-722,733共5页
作为相容性物质,5-羟化四氢嘧啶不仅可以调节渗透压,还可以稳定蛋白结构,在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景。四氢嘧啶羟化酶属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族,主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶。我们简要介... 作为相容性物质,5-羟化四氢嘧啶不仅可以调节渗透压,还可以稳定蛋白结构,在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景。四氢嘧啶羟化酶属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族,主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶。我们简要介绍了四氢嘧啶羟化酶的基因来源、活性检测、蛋白结构、催化机理及活性中心等方面的研究进展。 展开更多
关键词 四氢嘧啶羟化酶 四氢嘧啶 5-羟化四氢嘧啶
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采用钠盐调酸发酵生产D-乳酸的工艺研究 预览 被引量:1
12
作者 李媛 徐书景 +4 位作者 张庆 王丽敏 于波 赵宝华 《河北师范大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2014年第3期296-300,共5页
对芽孢乳杆菌CASD采用钠盐调酸发酵生产D-乳酸的工艺进行了探索.以廉价花生粕为唯一氮源,采用氢氧化钠为中和剂,D-乳酸的发酵质量浓度达到118.2g/L,糖酸转化率为89.1%,光学纯度达到99.3%,满足乳酸聚合要求.钠盐调酸适用于... 对芽孢乳杆菌CASD采用钠盐调酸发酵生产D-乳酸的工艺进行了探索.以廉价花生粕为唯一氮源,采用氢氧化钠为中和剂,D-乳酸的发酵质量浓度达到118.2g/L,糖酸转化率为89.1%,光学纯度达到99.3%,满足乳酸聚合要求.钠盐调酸适用于电渗析分离纯化乳酸工艺,该研究为开发新型的连续发酵-分离耦合生产D-乳酸工艺提供了技术基础. 展开更多
关键词 D-乳酸 氢氧化钠 芽孢乳杆菌 高光学纯
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大类培养模式下《食品工艺学》理论教学改革探索 预览 被引量:4
13
作者 徐书景 王会然 《安徽农业科学》 CAS 2014年第12期3772-3773,3776共3页
结合该校实际与自己的教学经验,依托《食品工艺学》从教学内容、教学方法和考核方式3个方面进行了教学改革探索,以期为同类应用性课程的教学改革提供参考.
关键词 大类培养 食品工艺学 教学改革
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D-氨基酸检测方法研究进展 预览 被引量:1
14
作者 李辉欣 +1 位作者 张琳琳 徐书景 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期68-72,共5页
自然界中存在20种基本氨基酸,除甘氨酸外都有两种互成镜像的对映体D-型和L-型。长期以来,人们认为D-氨基酸仅存在于微生物中,参与构成细胞壁肽聚糖层。但随着分析方法的发展,人们相继在多种生物体中(包括人体)发现了多种D-氨基酸... 自然界中存在20种基本氨基酸,除甘氨酸外都有两种互成镜像的对映体D-型和L-型。长期以来,人们认为D-氨基酸仅存在于微生物中,参与构成细胞壁肽聚糖层。但随着分析方法的发展,人们相继在多种生物体中(包括人体)发现了多种D-氨基酸,D-氨基酸才引起人们的高度重视,并意识到它们在医药、农药和食品等的组成中起着重要作用。D-氨基酸检测方法还需要不断发展与完善,以便更好地分析和认识D-氨基酸的重要作用。主要介绍酶法、气相层析法、高效液相法及生物传感器等检测方法。 展开更多
关键词 D-氨基酸检测 高效液相 生物传感器
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D-氨基酸氧化酶结构的研究进展 预览 被引量:1
15
作者 赵冉冉 冯利伟 +2 位作者 张金秀 徐书景 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期27-35,共9页
D-氨基酸氧化酶氧化D-氨基酸生成相应的α-酮酸和氨,还原型黄素被氧化生成过氧化氢。D-氨基酸氧化酶在精神分裂症的病理、生理学研究和D-氨基酸检测等方面都发挥着关键的作用。主要就结构已解析的几个D-氨基酸氧化酶的序列同源性、结... D-氨基酸氧化酶氧化D-氨基酸生成相应的α-酮酸和氨,还原型黄素被氧化生成过氧化氢。D-氨基酸氧化酶在精神分裂症的病理、生理学研究和D-氨基酸检测等方面都发挥着关键的作用。主要就结构已解析的几个D-氨基酸氧化酶的序列同源性、结构组成、活性中心、抑制剂以及与辅酶FAD结合能力等方面进行介绍。 展开更多
关键词 D-氨基酸氧化酶 结构组成 活性位点 抑制剂 FAD
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假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性 被引量:2
16
作者 马宁 +3 位作者 赵冉冉 刘景伟 徐书景 赵宝华 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期363-371,共9页
【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni... 【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】乙醛脱氢酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,酶蛋白的活力为979.6 U/mg,其稳定性在25℃和35℃下比45℃稍好;尽管由于乙醇脱氢酶的表达量低而未能纯化获得酶蛋白,但通过双基因共表达及乙醇耐受性实验发现乙醇脱氢酶也具备较高的催化活性。【结论】成功地从假坚强芽胞杆菌OF4中克隆获得了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因,二者共同作用能够较大提高宿主对乙醇的耐受性。 展开更多
关键词 假坚强芽胞杆菌 乙醛脱氢酶 乙醇脱氢酶 乙醇耐受性 共表达
酶工程教学经验探索 预览 被引量:3
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作者 薛张伟 +1 位作者 徐书景 赵宝华 《教育教学论坛》 2012年第9期 139-141,共3页
在经济全球化背景下,随着生物技术的发展,酶工程技术作为当前世界各国优先发展的高新技术领域之一,正在迅猛发展。而今,《酶工程》课程在我国各类生物学专业的教学中已经普及。为了提升自身教学水平,提高酶工程的教学质量,作者总... 在经济全球化背景下,随着生物技术的发展,酶工程技术作为当前世界各国优先发展的高新技术领域之一,正在迅猛发展。而今,《酶工程》课程在我国各类生物学专业的教学中已经普及。为了提升自身教学水平,提高酶工程的教学质量,作者总结个人教学经验,抛砖引玉,以适应新形势下市场发展对酶工程技术人才培养工作的要求。 展开更多
关键词 酶工程 教学质量 自主授课 自主性设计试验
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嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶活性位点的确立 被引量:3
18
作者 徐书景 张彩凤 +3 位作者 薛张伟 何广正 赵宝华 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期66-74,共9页
【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶... 【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶蛋白活性。【结果】通过重叠PCR法成功构建了7个位点的突变体,其中第150和159位的氨基酸突变对活性改变甚少或几乎没有,而第151和231位谷氨酸的羧基基团的改变以及双位点突变体E2Q则导致其对各种底物催化活性的丧失,说明位于β4和β7折叠的C末端的E151和E231的羧基基团作为功能基团参与了催化反应。【结论】E151和E231分别是新型甘露聚糖酶AaManA的酸碱催化位点和亲核催化位点。 展开更多
关键词 甘露聚糖酶 定点突变 活性位点
丙氨酸消旋酶的研究进展 预览 被引量:2
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作者 张彩凤 徐书景 +4 位作者 李艳红 薛张伟 马宁 赵宝华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第15期 8836-8839,共4页
简要介绍了丙氨酸消旋酶的分类、结构特征和催化机制。
关键词 丙氨酸消旋酶 催化机制 D-丙氨酸 5'-磷酸吡哆醛
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丙氨酸脱氢酶研究概况 预览 被引量:1
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作者 何广正 徐书景 +2 位作者 马宁 刘东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期 27-32,共6页
丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,ALD,EC 1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶。丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨及NADH。丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢的重要酶类,其催化反应... 丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,ALD,EC 1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶。丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨及NADH。丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢的重要酶类,其催化反应的产物丙酮酸广泛应用于医药、农药和食品等领域,具有良好的发展前景。主要介绍丙氨酸脱氢酶的纯化及活力检测、酶空间结构(底物结合位点),以及催化反应机理等方面的研究。 展开更多
关键词 丙氨酸脱氢酶 催化机理 丙酮酸 烟酰胺腺嘌呤 脱氢酶
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