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寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选
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作者 刘云霞 田明尧 +5 位作者 哈卓 曹亮 郭丹丹 孙文超 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1135-1139,共5页
选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋... 选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P<0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。 展开更多
关键词 新型佐剂 寨卡病毒 ME蛋白 DNA疫苗
寨卡病毒DNA疫苗新型佐剂的筛选
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作者 刘云霞 秦宇豪 +7 位作者 张聪 曹亮 汪伟 郭丹丹 孙文超 鲁会军 田明尧 金宁 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期253-256,263共5页
目的以卡波姆971p辅以国产白喉、百日咳、破伤风灭活疫苗及Poly(I:C)配制成新型佐剂,与DNA疫苗pVAX-Zika-E联合免疫BALB/c小鼠,观察新型卡波姆佐剂对DNA疫苗抗原的适应性及免疫应答能力。方法 PCR扩增ZIKA E蛋白基因,连接到pVAX-1载体上... 目的以卡波姆971p辅以国产白喉、百日咳、破伤风灭活疫苗及Poly(I:C)配制成新型佐剂,与DNA疫苗pVAX-Zika-E联合免疫BALB/c小鼠,观察新型卡波姆佐剂对DNA疫苗抗原的适应性及免疫应答能力。方法 PCR扩增ZIKA E蛋白基因,连接到pVAX-1载体上,构建表达ZIKA E蛋白的DNA疫苗。将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与表达ZIKA E蛋白的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠。通过淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果 Western blot结果显示所构建的DNA疫苗pVAX-ZIKA-E表达56×103目的蛋白。用重组疫苗做动物试验,免疫35 d时佐剂组淋巴细胞增殖刺激组刺激指数是无佐剂对照组的1.30~1.55倍,特异抗体水平(A450值)是无佐剂组对照组的1.27~1.50倍。结论 pVAX-ZIKA-E DNA疫苗辅以新型卡波姆佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。 展开更多
关键词 佐剂 寨卡病毒 DNA疫苗
广西3株牛源PCV2全基因组克隆与序列分析
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作者 孙文超 汪伟 +8 位作者 辛佳亮 张世亨 黄海鑫 曹亮 郑敏 张红云 韦显凯 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2019年第10期1897-1901,共5页
为研究广西地区牛源PCV2流行毒株基因组特性和遗传进化情况,运用PCR技术对广西地区采集的210份牛血清进行检测,结果其中35份样品为PCV2阳性。将3份阳性样品进行全基因组克隆与序列分析,分别命名为PCV2/GX-B2(1 769 nt)、PCV2/GX-B131(1 ... 为研究广西地区牛源PCV2流行毒株基因组特性和遗传进化情况,运用PCR技术对广西地区采集的210份牛血清进行检测,结果其中35份样品为PCV2阳性。将3份阳性样品进行全基因组克隆与序列分析,分别命名为PCV2/GX-B2(1 769 nt)、PCV2/GX-B131(1 768 nt)、PCV2/GX-B132(1 767 nt)。同源性显示与猪DK1980PMWS-free株同源性最低(94%),与牛源的Buffalo2株同源性最高(98.6%)。遗传进化分析,3株牛源PCV2毒株均属于PCV2d基因型。本研究报道了PCV2在我国广西地区牛群中的感染情况,并发现广西地区牛群中PCV2的主要流行基因亚型为PCV2d。 展开更多
关键词 PCV2 进化分析
非典型猪瘟病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 曹亮 田明尧 +7 位作者 孙文超 郭丹丹 汪伟 鲁会军 刘云霞 郑敏 钱爱东 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期622-626,共5页
参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模... 参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法C_t值与标准品在1.49×10~1~1.49×10~(10) copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R~20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。 展开更多
关键词 非典型猪瘟 仔猪先天震颤 荧光定量PCR
猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立
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作者 孙文超 汪伟 +13 位作者 赵翠青 赵海洋 刘立明 孟娟 王茂鹏 陈征 曹亮 陆依婷 夏秀秀 孙迪菲 宋璟子 郑敏 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期393-396,共4页
为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩... 为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 二重PCR方法 PCV3 PCV2
乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗对猪体的免疫效果
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作者 肖朋朋 刘昊 +7 位作者 靖杰 韩继成 曹亮 李成辉 张金勇 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期244-249,共6页
重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型... 重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE对猪体的免疫效果。经2次仔猪免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组的IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.5倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05),而且rVTT-JEVE组的中和抗体效价达到SA-14-14-2组的1.7倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。rVTT-JEVE组的T淋巴细胞刺激指数为SA-14-14-2组的1.6倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。本研究结果显示,rVTT-JEVE候选疫苗组和SA-14-14-2商品疫苗组JEV病毒载量均显著低于PBS对照组(P<0.05),均可有效保护仔猪感染JEV。 展开更多
关键词 重组痘苗病毒rVTT-JEVE 仔猪 乙型脑炎病毒 免疫评价
重组PCV3 Cap蛋白植物乳杆菌的构建与表达验证
7
作者 付婷婷 李昌 +5 位作者 王茂鹏 许汪 韩继成 马彬尧 秦爱建 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1052-1057,共6页
构建3型猪圆环病毒(PCV3)Cap蛋白的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因(PCV3D),使用无缝克隆技术连接到pSIP411载体中,电转入克隆宿主乳球菌NZ3900中,提取测序结果正确的重组表达质粒NZ39... 构建3型猪圆环病毒(PCV3)Cap蛋白的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因(PCV3D),使用无缝克隆技术连接到pSIP411载体中,电转入克隆宿主乳球菌NZ3900中,提取测序结果正确的重组表达质粒NZ3900:pSIP411-PCV3D再次电转入植物乳杆菌Lp12,制备重组菌并验证其表达。结果显示:成功扩增出目的条带为789 bp的经过修饰和优化的PCV3 Cap基因(PCV3D)片段,重组表达质粒电转入植物乳杆菌Lp12,成功构建重组植物乳杆菌Lp12:pSIP411-PCV3D。Western blot、流式细胞术等方法检测重组蛋白表达,获得阳性结果,阳性率为47.9%;免疫荧光进一步表明重组蛋白能够在细胞中表达。本试验成功构建了1株表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌,为PCV3口服候选疫苗的开发研究提供依据。 展开更多
关键词 PCV3 CAP蛋白 植物乳杆菌 构建与表达
信息技术助力课程游戏化研究 预览
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作者 金宁 《好家长》 2019年第12期12-13,共2页
游戏是幼儿的天性和最主要的学习方式。课程游戏化增强了教学活动的趣味性,促进了幼儿的探索性,使课程成为幼儿自主、自发参与的活动。而信息技术的辅助,更能生动展现课程的生动意趣。两者将协作促进幼儿在课程中的愉悦体验,增强通过游... 游戏是幼儿的天性和最主要的学习方式。课程游戏化增强了教学活动的趣味性,促进了幼儿的探索性,使课程成为幼儿自主、自发参与的活动。而信息技术的辅助,更能生动展现课程的生动意趣。两者将协作促进幼儿在课程中的愉悦体验,增强通过游戏式学习的效益。可以从以下几个方面进行结合研究:课程游戏化的'游戏'是什么,信息技术怎样介入游戏化课程,操作中教师的作用和幼儿的主体体现。 展开更多
关键词 信息技术 课程游戏化 课程目标 强化与淡化
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蓝舌病毒RT-PCR检测方法的建立及对云南省库蠓蓝舌病流行病学检测
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作者 李成辉 肖朋朋 +11 位作者 赵冠宇 张克龙 李卓昕 南福龙 陈竞 张涵 马彬尧 韩继成 金鑫 田明尧 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期821-825,共5页
建立蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病(BT)流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱... 建立蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病(BT)流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱市澜沧县的BT传播媒介库蠓共25万余只,进行研磨后,用建立的RT-PCR方法检测样本。筛选出1对引物BTVS10-F和BTVS10-R作为蓝舌病毒RT-PCR检测引物,敏感度达到102.5 TCID50/0.1 mL,通过对BTV16型的阳性病毒检测,证实该方法的可行性。 展开更多
关键词 蓝舌病 RT-PCR 库蠓 检测
双特异性溶瘤腺病毒通过调节活性氧引起人肺癌细胞凋亡
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作者 白冰 张冬娜 +6 位作者 蒋本春 房金波 马艺珍 朱羿龙 朱光泽 李霄 金宁 《长春中医药大学学报》 2019年第1期1-5,共5页
目的探讨双特异性溶瘤腺病毒ATV引起人肺癌A549细胞凋亡与活性氧含量之间的关系。方法应用本实验室构建的双特异性溶瘤腺病毒ATV,通过CCK-8法检测ATV对A549细胞增殖的抑制作用;通过Hoechst和Annexin V-FITC/PI流式检测法检测A549细胞的... 目的探讨双特异性溶瘤腺病毒ATV引起人肺癌A549细胞凋亡与活性氧含量之间的关系。方法应用本实验室构建的双特异性溶瘤腺病毒ATV,通过CCK-8法检测ATV对A549细胞增殖的抑制作用;通过Hoechst和Annexin V-FITC/PI流式检测法检测A549细胞的凋亡情况;通过人活性氧Elisa试剂盒测定A549细胞内活性氧水平。结果 CCK-8法检测结果表明,ATV感染剂量为10 MOI和50 MOI作用时间为48 h和72 h时,对A549细胞具有显著性的抑制作用。Hoechst染色结果显示,感染ATV的A549细胞呈现核碎裂典型的浓染和边集现象,具备细胞凋亡的典型特征;Annexin V-FITC/PI流式检测结果表明ATV在12、24、48、72 h均能诱导A549细胞不同程度的凋亡,并且凋亡率随时间增长而提高;胞浆活性氧检测结果表明,ATV感染A549细胞12、24、48、72 h,A549细胞活性氧水平随时间的增长而提高,具有时间效应。结论 ATV对A549细胞有抑制作用且该作用具有明确的时效与剂效关系;ATV通过使A549细胞内活性氧含量增加引起细胞凋亡进而发挥对A549细胞的抑制作用。 展开更多
关键词 溶瘤腺病毒 活性氧 A549 凋亡
人IFN-λ1的克隆表达及其在不同种属细胞中的抗病毒活性分析
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作者 陈竞 许汪 +6 位作者 宋利娜 郝鹏飞 姜宇航 付婷婷 金鑫 金宁 李昌 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第10期1166-1170,共5页
目的测定IFN-λ1在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等4种不同种属来源细胞中的抗病毒活性。方法利用RT-PCR技术从人结直肠腺癌细胞(CaCo2)中扩增获得人IFN-λ1 (HuIFN-λ1)基因,然后克隆至真核表达载体pCDNA3.1-Flag-HA中,通过质粒转化、阳... 目的测定IFN-λ1在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等4种不同种属来源细胞中的抗病毒活性。方法利用RT-PCR技术从人结直肠腺癌细胞(CaCo2)中扩增获得人IFN-λ1 (HuIFN-λ1)基因,然后克隆至真核表达载体pCDNA3.1-Flag-HA中,通过质粒转化、阳性菌落筛选、质粒提取及测序,获得重组质粒pCDNA3.1-HuIFN-λ1;利用脂质体将其转染293细胞,48 h后通过Western blot检测HuIFN-λ1瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等四种不同种属来源细胞进行HuIFN-λ1抗病毒活性分析。结果从人结直肠腺癌细胞中扩增获得HuIFN-λ1基因,大小为600 bp,并在293细胞内成功表达HuIFN-λ1,表达产物能抑制VSVG在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK中的增殖,流式细胞仪检测经HuIFN-λ1处理的上述细胞荧光率分别为73.69%、80.12%、71.73%、69.47%。结论重组表达的人IFN-λ1蛋白对4种不同种属来源的细胞均存在一定的抗病毒活性,为研究人IFN-λ1在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机制及其应用奠定了基础。 展开更多
关键词 人IFN-λ1 人结直肠腺癌细胞 抗病毒活性
重组猪源 IFN-λ1 植物乳杆菌的构建与表达验证 预览
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作者 付婷婷 马彬尧 +6 位作者 王茂鹏 韩继成 许汪 陈竞 姜宇航 金宁 李昌 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期35-39,43共6页
为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表... 为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表达宿主植物乳杆菌Lp18获得重组植物乳杆菌;制备重组植物乳杆菌并验证其表达。结果显示,成功扩增出650bp目的条带,电转入植物乳杆菌Lp18中成功构建重组Lp18:pSIP-pIFN-λ1。WesternBlot、免疫荧光和流式细胞分析等方法验证重组蛋白pIFN-λ1的表达,获得阳性结果,阳性率为22.96%,且进一步证明其展示并锚定在植物乳杆菌表面。本试验成功构建了1株能稳定表达猪源IFN-λ1蛋白的重组植物乳杆菌,为猪源IFN-λ1的开发应用研究提供理论基础。 展开更多
关键词 3型干扰素 植物乳酸菌 构建与表达
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PCV3Cap基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定
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作者 姜宇航 +6 位作者 许汪 杜寿文 宋利娜 陈竞 郝鹏飞 金宁 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2112-2117,2128,共7页
试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒... 试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTM上(含有双启动子),获得含有2个PCV3Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-BacTM感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 重组杆状病毒 CAP蛋白 表达
牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立
14
作者 马海彬 刘云霞 +9 位作者 张必凯 韩继成 孙文超 解长占 靖杰 肖朋朋 张萍 尹逊哲 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期678-682,694共6页
为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水... 为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28~185、221~455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221~455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221~455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。 展开更多
关键词 牛支原体 P48蛋白 原核表达 蛋白纯化 间接ELISA
猪源IFN-λ3的克隆、表达及抗病毒活性分析 预览
15
作者 陈竞 许汪 +6 位作者 宋利娜 郝鹏飞 姜宇航 付婷婷 金鑫 金宁 李昌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期32-37,共6页
为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通... 为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析pIFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行pIFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。 展开更多
关键词 猪IFN-λ3 猪肺巨噬细胞 抗病毒活性
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寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定 被引量:1
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作者 张涵 曹亮 +6 位作者 鲁会军 田明尧 孙文超 郭丹丹 汪伟 金宁 李太元 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期681-684,690共5页
目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZI... 目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因,用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a,构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,并对最适IPTG诱导浓度进行优化。结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确。用重组质粒转化DE3,当加入IPTG终浓度为2mmol/L,成功表达出分子质量单位(Mr)为56×103重组ZIKV E蛋白,与理论分子质量相符合。Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别。结论成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 寨卡病毒 E蛋白 原核表达 鉴定
Asia 1 FMDV重组鸡痘病毒在豚鼠体内免疫原性和体内分布
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作者 金明兰 霍晓伟 +5 位作者 鲁会军 朱战波 刘存霞 南文龙 马鸣潇 金宁 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期127-132,141共7页
为检测Asia1口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)重组病毒免疫原性和安全性,将构建表达Asia1型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)3C基因、P1—2A基因和猪白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)基因的重组鸡痘病毒r... 为检测Asia1口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)重组病毒免疫原性和安全性,将构建表达Asia1型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)3C基因、P1—2A基因和猪白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)基因的重组鸡痘病毒rFPV-P1—2A-3C和rFPV-3C—P1—2A-IL-18间隔2周免疫豚鼠3次,进行特异性抗体、中和抗体、淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚类数量、IFN—γ、攻毒保护以及体内分布研究。重组鸡痘病毒可有效刺激豚鼠产生特异性抗体、中和抗体、T淋巴细胞亚类数量、IFN-γ分泌均显著高于对照组;重组鸡疽病毒rFPV-3C-P1—2A—IL-18的T淋巴细胞亚类数量、T淋巴细胞转化和IFN-γ分泌高于重组病毒rFPV-P1—2A-3C免疫组;2个重组病毒的攻毒保护率分别为4/5、3/5。2个重组病毒在接种最早12h可检测到重组病毒的基因,最晚7d可检测到重组病毒的基因。结果表明重组鸡痘病毒rFPV—P1—2A-3C和rFPV-3C-P1—2A—IL-18具有良好的免疫原性,可以有效抵御病毒的攻击,体内残留时间短,对免疫动物安全,为开发、应用新型FMDV疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 rFPV-P1—2A-3C rFPV-3C-P1~2A—IL-18 免疫原性 攻毒保护 体内分布
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的新城疫病毒感染性克隆的构建及病毒拯救
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作者 张赫 南福龙 +7 位作者 鲁会军 解长占 张萍 张金勇 庄忻雨 田明尧 步志高 金宁 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期841-845,共5页
应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN—FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒L... 应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN—FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSVLV株ORF5序列,设计引物扩增0RF5片段,通过PBRN—FL质粒上P和M基因间的PmeI酶切住点插入目的片段,构建重组质粒LaSota—ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI—NP、PCI-P、PCI—L等3种辅助质粒共转染BSR—T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSVGP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 LASOTA GP5蛋白 病毒拯救
金刚烷胺抑制乙脑病毒感染引起小胶质细胞炎症反应的作用
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作者 庄忻雨 赵翠青 +9 位作者 赵海洋 肖朋朋 温树波 孙文超 解长占 张萍 张赫 南福龙 鲁会军 金宁 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1350-1354,1365共6页
目前金刚烷胺被(areantadine,Ama)用作一种抗病毒和抗帕金森药物,可抑制小胶质细胞的炎症激活。为验证金刚烷胺是否会抑制乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染小胶质细胞所引起的炎症反应.本试验利用Ama处理小鼠小... 目前金刚烷胺被(areantadine,Ama)用作一种抗病毒和抗帕金森药物,可抑制小胶质细胞的炎症激活。为验证金刚烷胺是否会抑制乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染小胶质细胞所引起的炎症反应.本试验利用Ama处理小鼠小胶质瘤BV-2细胞系后使用JEV感染细胞,测定细胞中炎性因子的表达,并与单独使用JEV处理BV-2细胞组进行对比分析。结果表明,Ama可以显著降低JEV感染引起的5种炎性因子的表达,MCP-1(62.17%)、IL-6(62.07%)、TNF-α(59.67%)、IL-18(63.16%)以及IL-10(34.24%)。本试验为流行性乙型脑炎的临床治疗提供了理论依据。 展开更多
关键词 乙脑病毒 小胶质细胞 金刚烷胺 炎性因子
用于活体成像裸鼠肺癌肿瘤模型的建立 被引量:2
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作者 范园园 李铁 +10 位作者 陈爽 荣凤君 李文杰 尹逊哲 韩继成 李善智 李敏 崔传信 李霄 金宁 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1177-1184,共8页
本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进... 本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进行稳定性和体外活体成像检测。测定A549-luc细胞和A549细胞的生长曲线、迁移、侵袭及细胞周期,确定转染前后细胞生物学特性变化。为检测A549-luc细胞在体内成瘤和发光情况,建立裸鼠皮下荷瘤模型并应用小动物活体成像系统观察。结果表明,通过G418一直加压筛选和荧光素酶活性检测,筛选出2株荧光素酶活性高的克隆Clone20和Clone28,并连续传至40代,每5代检测1次荧光素酶活性,最终保留荧光素酶活性和稳定性最高的Clone28,Clone28通过体外活体成像检测显示生物发光值与细胞数目呈正相关的线性关系(R^2=0.9948)。A549-luc细胞和A549细胞具有相似的生长特性、迁移和侵袭能力以及细胞周期。成功建立了裸鼠皮下荷瘤模型,其发光强度与肿瘤体积呈正相关的线性关系(R^2=0.9715)。本研究稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞的构建并成功建立裸鼠皮下荷瘤模型,可通过活体生物成像系统动态监测肿瘤的变化。 展开更多
关键词 A549细胞 荧光素酶 活体成像 裸鼠 肺癌肿瘤模型
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