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百日咳毒素的研究进展 被引量:1
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作者 李鑫 张新创 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第2期215-219,224共6页
百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)是鲍特菌属百13咳杆菌产生的一种主要毒力因子,具有多种生物学活性,其为引起百日咳众多临床症状的主要因素,同时也是无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)唯一不受争议的抗原成... 百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)是鲍特菌属百13咳杆菌产生的一种主要毒力因子,具有多种生物学活性,其为引起百日咳众多临床症状的主要因素,同时也是无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)唯一不受争议的抗原成分。本文就PTX的分子结构、生物学活性及其在疫苗中的应用作一综述。 展开更多
关键词 百日咳毒素 百日咳 生物学活性
百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究 预览
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作者 李鑫 高晶晶 +4 位作者 罗树权 李燕婷 乔瑞洁 刘方蕾 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2018年第5期21-27,共7页
目的提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性。方法通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1%冰醋酸水解获得寡糖... 目的提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性。方法通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1%冰醋酸水解获得寡糖(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PAGE及核磁共振氢谱(^1H NMR)鉴定。OS的羟基经1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化后,与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH))共价结合,制备多糖蛋白结合物,经Sephacryl S-300层析柱纯化后收集结合物原液,并对结合物的理化性质、抗原性进行分析,采用两种剂量(2.5μg/剂和5.0μg/剂)免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性。结果纯化后LOS纯度〉90%,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留。制备的结合物抗原性未发生改变,经3针免疫后,两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P〈0.05),且两者差异无统计学意义(P〉0.05)。结论将百日咳杆菌OS与TTAH结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径,并且结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。 展开更多
关键词 百日咳鲍特菌 脂寡糖 结合物 免疫原性
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百日咳小鼠呼吸道感染模型的建立与应用 预览 被引量:1
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作者 高晶晶 李鑫 +4 位作者 乔瑞洁 李燕婷 刘方蕾 罗树权 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2018年第5期28-35,共8页
目的模拟自然感染方式建立百日咳小鼠模型,并初步应用于疫苗评价。方法通过对小鼠品系、周龄,感染用菌株、菌液浊度,感染时间等进行比较,确定动物模型建立的相关参数。然后借助该模型比较全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫后的小... 目的模拟自然感染方式建立百日咳小鼠模型,并初步应用于疫苗评价。方法通过对小鼠品系、周龄,感染用菌株、菌液浊度,感染时间等进行比较,确定动物模型建立的相关参数。然后借助该模型比较全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫后的小鼠肺部百日咳杆菌的清除情况。程序为第0、2、4周免疫,第6周进行呼吸道感染,感染后2 h、3 d、7 d、14 d、21 d取样,对小鼠肺部菌落进行计数。结果在菌液浊度至少为109CFU/m L时,用Tohama I株对4~10周龄BALB/c小鼠雾化感染30 min,小鼠肺部百日咳杆菌分离培养的阳性率可达100%。用于疫苗评价后发现,免疫全细胞百日咳疫苗的小鼠在感染后7 d检测不到肺内的百日咳杆菌,而免疫无细胞百日咳疫苗的小鼠在感染后21 d还可分离出少量百日咳杆菌。结论通过动物发病、肺部细菌分离培养和感染曲线等对动物模型进行分析,证明通过呼吸道感染途径可成功建立百日咳小鼠模型,并且该模型可应用于百日咳疫苗的评价,为百日咳疫苗的有效性评价奠定重要基础。 展开更多
关键词 小鼠模型 呼吸道感染 百日咳疫苗 疫苗评价
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6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立
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作者 刘爱萍 任珍芸 +5 位作者 刘倩 罗树权 陈晓航 李献 杜娇 谢贵 《中国新药杂志》 CSCD 北大核心 2017年第24期2937-2942,共6页
目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖.破伤风类毒素结合物(PS6B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证。方法:采用脱氧胆酸钠.盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1%NaDC溶液混匀,离心后用... 目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖.破伤风类毒素结合物(PS6B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证。方法:采用脱氧胆酸钠.盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1%NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮.硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的最佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证。结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg·mL^-1以下;选择终浓度0.3mol·L^-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25%及0;游离糖添加试验回收率均在90%~100%;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10%以下。结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量。 展开更多
关键词 肺炎多糖蛋白结合物 破伤风类毒素 游离多糖 脱氧胆酸钠
NMR法测定A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量 被引量:1
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作者 李阿妮 袁菲 +3 位作者 马钰 王晶 孔素娟 谢贵 《中国新药杂志》 CSCD 北大核心 2017年第20期2417-2423,共7页
目的:采用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术检测A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖(groups A,C,Y,W135 Neisseria meningococcal capsular polysaccharides,GAMP,GCMP,GYMP,GWMP)氧乙酰基含量。方法:对A,C,Y和W135群... 目的:采用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术检测A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖(groups A,C,Y,W135 Neisseria meningococcal capsular polysaccharides,GAMP,GCMP,GYMP,GWMP)氧乙酰基含量。方法:对A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖样品进行溶解,离心,转移等处理步骤,采用核磁共振谱仪检测,并对检测参数D1,NS和计算标准进行优化使其满足定量检测要求。结果:确定的检测条件:D1值GAMP为18,GCMP,GYMP和GWMP为20;NS值均为128次,计算标准GAMP采用H-3和H-4与H1积分面积之比,GCMP采用H-7和H-8与H-3e积分面积之比,GYMP和GWMP采用H-7和H-9与H-3e积分面积之比。结论:NMR法简便、快速、准确,可用于检测A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量。 展开更多
关键词 A C Y和W135群脑膜炎球菌 荚膜多糖 氧乙酰基含量 核磁共振(NMR)
百日咳呼吸道感染模型的研究进展 预览 被引量:2
6
作者 高晶晶 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2017年第5期78-82,共5页
百日咳呼吸道感染模型是研究百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)致病机制及百日咳疫苗评价的重要手段。人是百日咳鲍特菌的唯一自然宿主,由于受伦理学限制及志愿者重症感染等风险,使人百日咳呼吸道感染模型研究受限。近年来,百日咳... 百日咳呼吸道感染模型是研究百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)致病机制及百日咳疫苗评价的重要手段。人是百日咳鲍特菌的唯一自然宿主,由于受伦理学限制及志愿者重症感染等风险,使人百日咳呼吸道感染模型研究受限。近年来,百日咳呼吸道感染动物模型取得了明显进展。目前,应用于百日咳研究的动物模型主要包括小鼠、小型猪和狒狒等。现就百日咳呼吸道感染模型在百日咳疫苗临床前研究及有效性评价的进展作一概述。 展开更多
关键词 动物模型 呼吸道感染 百日咳鲍特菌 百日咳疫苗
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细菌内毒素检查法在肺炎球菌结合疫苗研制中的应用及验证
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作者 吴兵 刘方蕾 +8 位作者 李燕婷 罗树权 毛睿 范锋锋 于旭博 胡浩 沈荣 赵志强 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第11期1182-1190,共9页
目的应用细菌内毒素检查法(动态浊度法)检测13价肺炎球菌结合疫苗中细菌内毒素含量,并对该方法进行验证。方法用《中国药典》三部(2010版)载录的动态浊度法检查疫苗原辅材料、疫苗过程产物及疫苗细菌内毒素含量,并进行肺炎球菌结合... 目的应用细菌内毒素检查法(动态浊度法)检测13价肺炎球菌结合疫苗中细菌内毒素含量,并对该方法进行验证。方法用《中国药典》三部(2010版)载录的动态浊度法检查疫苗原辅材料、疫苗过程产物及疫苗细菌内毒素含量,并进行肺炎球菌结合疫苗原液和成品的细菌内毒素含量检测,验证方法的可行性及准确性。结果 13价肺炎球菌结合疫苗生产使用试剂、相关原辅材料和磷酸铝佐剂对细菌内毒素检查无影响;该方法线性、专属性、准确性、精密度、耐用性良好,检定范围初步定为0.08-10 EU/ml,定量限度暂定为0.03 EU/ml;可准确测定疫苗原液和成品中细菌内毒素含量,重复性和准确性良好。结论动态浊度法检测13价肺炎球菌结合疫苗中细菌内毒素含量,结果准确、稳定,符合方法验证的要求,可为该疫苗的质量控制提供稳定可靠的检测方法。 展开更多
关键词 细菌内毒素检查 动态浊度法 肺炎球菌结合疫苗 方法验证
PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株 预览
8
作者 杨英英 罗树权 +7 位作者 于旭博 乔瑞洁 冯宜扬 刘方蕾 吴兵 谭小梅 赵志强 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2017年第1期18-21,共4页
目的 用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法 用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移... 目的 用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法 用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。 展开更多
关键词 B群脑膜炎奈瑟菌 菌种鉴定 唾液酸转移酶基因 聚合酶链反应
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6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究 预览 被引量:1
9
作者 罗树权 杨英英 +10 位作者 张钰奇 李献 杜娇 胡浩 刘佳 刘月萍 李阿妮 任珍芸 刘爱萍 侯亚莉 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2017年第6期1-8,共8页
目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR... 目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。 展开更多
关键词 6A型肺炎球菌荚膜多糖 水解物 结合物 免疫原性
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伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性研究 预览
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作者 刘月萍 周海飞 +4 位作者 罗树权 许博 冯宜扬 谢贵 谭小梅 《微生物学免疫学进展》 2017年第2期42-48,共7页
目的 评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2-8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要... 目的 评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2-8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要评价指标(多糖含量、结合物含量、相对分子质量、鉴别试验)进行检测,评估疫苗原液的稳定性。结果 伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液于2-8℃放置22个月,(25±2)℃放置52 w,(37±2)℃放置24 w时,各项主要评价指标均符合其质量标准的要求。结论 伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性良好,在2-8℃可稳定存放22个月。 展开更多
关键词 伤寒Vi 结合疫苗 原液 稳定性 温度
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多型调理吞噬试验方法的长期稳定性 预览
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作者 乔瑞洁 戈钰雯 +5 位作者 王浩 刘佳 王欣茹 罗树权 沈荣 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2017年第6期22-27,共6页
目的通过对2010—2016年间09CS针对13个型别的肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体滴度的分析,探讨调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assays,MOPA)的长期稳定性。方法统计2010—2016年检测人肺炎链球菌质量控制血清... 目的通过对2010—2016年间09CS针对13个型别的肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体滴度的分析,探讨调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assays,MOPA)的长期稳定性。方法统计2010—2016年检测人肺炎链球菌质量控制血清(质控血清)09CS中针对1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13个血清型的OPKA滴度,分别计算2010、2011、2012、2013、2014—2016年09CS针对各个型别的OPKA滴度的GMT值及其95%可置信区间;统计09CS针对13个血清型的OPKA滴度在质量控制范围之内的比率;计算2010—2016年09CS针对13个血清型各型别的OPKA滴度CV值。结果从OPKA滴度来看,2010年普遍较低,而2011年、2012年、2013年、2014—2016年这几年间的09CS针对13个血清型的滴度结果稳定。2011—2016年期间检测结果在质控血清滴度范围的比率:2010年最低值是4%,均值为30%;2011年最低值是65%,均值为80%;2012年最低值是73%,均值为85%;而2013年最低值为77%,均值为94%;2014—2016年最低值为71%,均值为90%。2010—2016年09CS针对13个血清型的OPKA滴度各型别CV:各年份的平均值分别为:125%、64%、47%、41%和39%。结论充分证明了从2011年起本实验室建立的MOPA稳定性良好。 展开更多
关键词 调理吞噬杀菌试验 多型调理吞噬杀菌试验 长期稳定性 质量控制血清
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13价肺炎球菌多型调理吞噬试验方法的建立及验证 被引量:2
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作者 乔瑞洁 刘佳 +6 位作者 王浩 戈钰雯 王欣茹 范锋锋 史晓玲 谭小梅 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第10期1073-1079,共7页
目的建立标准化的针对肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体的多型调理吞噬试验(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)方法,并进行验证。方法参照有关组织研究和发布的MOPA实验操作规范(UAB-MOPA),通过菌种鉴定、HL60细胞分... 目的建立标准化的针对肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体的多型调理吞噬试验(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)方法,并进行验证。方法参照有关组织研究和发布的MOPA实验操作规范(UAB-MOPA),通过菌种鉴定、HL60细胞分化规律的确定、补体筛选、质控血清质控范围的确定,建立本实验室的MOPA实验方法,并对方法进行特异性、线性、精密性、准确性以及耐受性验证。结果工作菌种的所有指标均符合UAB-MOPA操作规范的要求;HL60细胞在分化后3-6 d均可作为工作细胞使用;27531和84321N两批补体可作为工作补体使用;建立了09CS、QC2、B、C和F 5个质控血清的质控范围。方法的特异性、线性、精密性、准确性及耐受性均符合预定指标。结论成功建立了标准化的13价肺炎球菌多型MOPA方法,并进行了验证。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 荚膜多糖 调理吞噬试验 验证
1型肺炎球菌多糖结合化学特性及结合物免疫原性探究 被引量:1
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作者 胡浩 朱学喆 +6 位作者 李献 罗树权 李阿妮 刘佳 刘爱萍 赵志强 谢贵 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期410-417,424共9页
目的:研究1型肺炎球菌多糖的氨基、羧基和羟基的结合反应活性,制备1型肺炎球菌多糖-蛋白质结合物,并研究其抗原性和免疫原性。方法:将天然多糖降解,用EDAC直接缩合法验证多糖分子上氨基的反应活性。采用EDAC缩合法,利用降解多糖分子... 目的:研究1型肺炎球菌多糖的氨基、羧基和羟基的结合反应活性,制备1型肺炎球菌多糖-蛋白质结合物,并研究其抗原性和免疫原性。方法:将天然多糖降解,用EDAC直接缩合法验证多糖分子上氨基的反应活性。采用EDAC缩合法,利用降解多糖分子上的羧基与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)的氨基和肼基缩合,以CDAP活化降解多糖的羟基,并与破伤风类毒素(TT)或TTAH直接结合,纯化结合物并对结合物抗原性和免疫原性进行分析。结果:天然多糖重均相对分子质量由4.175×105g·mol-1降为8.917×104g·mol-1,其结构、特异基团含量和抗原性未改变;降解多糖与EDAC混合后,相对分子质量未增加;3种方法制备的结合物,其多糖抗原性未发生变化,免疫原性显著高于天然多糖(P〈0.05),3针免疫后Ig G抗体水平均有剂次加强效应,呈T细胞依赖型免疫应答。不同方法制备的结合物,免疫原性无显著差异。结论:采用本研究的方法,可降解1型肺炎球菌多糖并保留天然多糖特性;多糖分子上的氨基无结合反应活性,羧基和羟基有结合反应活性;EDAC缩合法与CDAP活化法所制备结合物,赋予了多糖典型的T细胞依赖型抗原的特征,不同方法及制备的结合物免疫原性无显著差异。间隔剂在本研究中对结合物免疫原性无影响。 展开更多
关键词 1型肺炎球菌荚膜多糖 结合化学 免疫原性
a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法的建立及验证 被引量:1
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作者 苗鑫 于旭博 +7 位作者 范锋锋 谭小梅 王晶 胡浩 罗树权 周海飞 赵志强 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第6期623-627,631共6页
目的建立a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证。方法利用脱氧胆酸钠(Na DC)盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量。通过检测Na DC盐酸法沉淀破伤风类毒素(t... 目的建立a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证。方法利用脱氧胆酸钠(Na DC)盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量。通过检测Na DC盐酸法沉淀破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、TT ADH衍生物(ADH derivative of TT,TTAH)及TT琥珀酰化衍生物(succinic anhydride derivative of TT,TTSA)的最大能力以及沉淀多糖降解物(depolymerized polysaccharide,de-PS)或降解多糖ADH衍生物(ADH derivative of de-PS,de-PSAH)与相应载体蛋白质混合物的最佳离子强度,并利用最佳离子强度检测混合物中多糖与蛋白质质量的最小比例,以确定Hia结合物游离多糖含量的测定条件。通过添加回收试验验证方法的准确度,多次测定结合物的游离多糖含量验证方法的精密度。结果 Na DC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响;Na DC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力分别为402.8、352.5和691.0μg/ml;在0.6 mol/L NaCl的离子强度下,Na DC盐酸法沉淀多糖与蛋白质混合物,当de-PS与TT或TTAH的质量比≥1∶2、dePSAH与TT的质量比≥1∶4、de-PSAH与TTSA的质量比≥1∶5时,多糖回收率均在95%以上。向结合物添加6、12、35和56μg/ml的de-PS或de-PS_(AH)时,多糖回收率均在80%-100%之间;游离多糖含量检测结果的CV值均在10%以内。结论建立的方法适用于不同结合方法制备的Hia结合物游离多糖含量的测定。 展开更多
关键词 a型流感嗜血杆菌 多糖蛋白质结合物 脱氧胆酸钠 游离多糖
离子色谱法测定ACYW135群脑膜炎球菌结合物中Y群及W135群多糖含量 预览
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作者 王晶 于旭博 +6 位作者 赵阳 孔素娟 刘爱萍 袁菲 吴兵 谭小梅 谢贵 《微生物学免疫学进展》 2016年第5期7-14,共8页
目的:利用离子色谱法即高效阴离子交换柱层析—脉冲安培检测法( HPAEC-PAD),测定ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖含量的方法,并加以验证。方法将ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖用三氟乙酸( TF... 目的:利用离子色谱法即高效阴离子交换柱层析—脉冲安培检测法( HPAEC-PAD),测定ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖含量的方法,并加以验证。方法将ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖用三氟乙酸( TFA)水解为特异性单糖(葡萄糖、半乳糖),并去除水解液中残留的TFA,用HPAEC-PAD分析检测,用PA10糖分析柱分离单糖,电化学检测器测定葡萄糖及半乳糖含量,用Chrome-leon色谱工作站记录并分析数据。对上述方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的检出限和定量限。结果 Y群和W135群多糖在TFA2.5 mol/L(终浓度)、90℃、4 h可完全水解为葡萄糖、半乳糖。对照品葡萄糖及半乳糖在0.10-60.00μg/mL 范围内,质量浓度和色谱峰面积呈较好的线性关系, r 均大于0.99,回收率为87.94%-109.80%,相对标准偏差(RSD)为1.00%-2.00%,检出限为0.05μg/mL(信噪比3∶1),定量限为0.10μg /mL(信噪比10∶1)。结论离子色谱法可同时检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群糖含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对相关疫苗生产过程中的质量控制。 展开更多
关键词 脑膜炎球菌多糖蛋白结合物 高效阴离子交换柱层析-脉冲安培检测法( HPAEC-PAD) 多糖含量
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重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证
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作者 范锋锋 李燕婷 +7 位作者 金鑫 冯宜扬 夏莲坤 刘月萍 朱衍志 赵志强 谢贵 谭小梅 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第6期632-636,共5页
目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA)含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋... 目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA)含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为(102.32±4.18)%、(102.77±4.94)%和(95.04±16.41)%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。 展开更多
关键词 重组铜绿假单胞菌外毒素A SDS-PAGE 收率
W135群脑膜炎球菌结合物的制备及其在小鼠体内的免疫原性 被引量:2
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作者 王晶 张海红 +6 位作者 孔素娟 袁菲 李阿妮 刘爱萍 刘芳蕾 吴兵 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第11期1121-1125,1131共6页
目的比较不同活化试剂、不同载体蛋白质及不同免疫程序对W135群脑膜炎球菌结合物在小鼠体内的免疫原性的影响。方法分别采用溴化氰(CNBr)和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶-四氟硼酸盐(CDAP)为活化试剂,以己二酸二酰肼(ADH)为连接臂制备W... 目的比较不同活化试剂、不同载体蛋白质及不同免疫程序对W135群脑膜炎球菌结合物在小鼠体内的免疫原性的影响。方法分别采用溴化氰(CNBr)和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶-四氟硼酸盐(CDAP)为活化试剂,以己二酸二酰肼(ADH)为连接臂制备W135群脑膜炎球菌多糖(group W135 meningococcal polysaccharide,PSW135)衍生物;以碳二亚胺(EDAC)作为缩合剂,将多糖衍生物分别与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)3种蛋白质共价结合,制备6种PSW135蛋白质结合物;比较4针免疫程序(0、2、4、8周)和3针免疫程序(0、4、8周)对结合物在小鼠体内免疫原性的影响。结果两种活化试剂均能对多糖进行有效活化,且不会破坏多糖的抗原性;制备的6种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,且具有显著的剂次加强效应;采用间隔2周的3针免疫程序和2.5μg/只的免疫剂量,不同类型的活化试剂和载体蛋白质对结合物的免疫原性无显著影响,但以DT为载体蛋白质的结合物的免疫加强效应要弱于以TT和r EPA为载体的结合物;延长免疫间隔时间可显著提高结合物在小鼠体内的免疫原性。结论初步建立了适用于W135群脑膜炎球菌结合疫苗的结合工艺,并为结合物在小鼠体内的免疫原性研究提供了一种新的候选免疫程序。 展开更多
关键词 W135群脑膜炎球菌结合物 活化试剂 免疫程序
测定唾液酸含量的改良间苯二酚-盐酸法的建立及验证 被引量:1
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作者 袁菲 于旭博 +5 位作者 孔素娟 王晶 王欣茹 吴兵 刘方蕾 谢贵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第10期1087-1093,共7页
目的建立测定脑膜炎球菌多糖、多糖衍生物及结合物中唾液酸含量的改良间苯二酚-盐酸法,并进行验证。方法以《中国药典》三部(2015版)测定多糖中唾液酸含量的间苯二酚-盐酸法为基础进行改良,去除有机相萃取步骤,优化方法中的检测波长(... 目的建立测定脑膜炎球菌多糖、多糖衍生物及结合物中唾液酸含量的改良间苯二酚-盐酸法,并进行验证。方法以《中国药典》三部(2015版)测定多糖中唾液酸含量的间苯二酚-盐酸法为基础进行改良,去除有机相萃取步骤,优化方法中的检测波长(300~900 nm)及煮沸时间(10、15、20、25、30、35和40 min);并对建立方法的线性范围、中间精密度及准确度进行验证。比较改良法与《中国药典》法对样品唾液酸含量及其层析分部产物中唾液酸含量测定结果的差异,同时检测乳糖对改良法测定唾液酸含量的影响。结果方法中最佳检测波长为569 nm,最佳煮沸时间为30 min。唾液酸对照品浓度在5~40μg/ml范围内与569 nm吸收值呈良好的线性关系,R2均〉0.999;3位实验人员在3个不同时间对样品中唾液酸含量测定9次结果的CV均〈3%;外加5、10、20μg/ml浓度的N-乙酰神经氨酸的回收率均在95%~105%之间。改良法与《中国药典》法检测的样品唾液酸含量差异无统计学意义(P〉0.05),且两种方法的层析分部图谱一致。乳糖溶液浓度超过100μg/ml时对唾液酸测定结果的干扰较大。结论本实验建立的改良唾液酸测定法具有良好的线性、精密度和准确度,可用于脑膜炎球菌多糖、多糖衍生物和结合物唾液酸含量的测定。 展开更多
关键词 间苯二酚-盐酸法 唾液酸含量
2种14型肺炎球菌多糖-蛋白结合物的制备及免疫原性比较
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作者 刘爱萍 任珍芸 +7 位作者 刘佳 王欣茹 王玺 李阿妮 李燕婷 胡浩 吴兵 谢贵 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第23期2714-2719,共6页
目的:以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)和己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)衍生的TT(TTAH)分别作为载体蛋白制备14型肺炎球菌多糖-蛋白结合物,比较2种结合物在小鼠体内的免疫原性。方法:以1-(3-二甲氨基丙基)-3-... 目的:以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)和己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)衍生的TT(TTAH)分别作为载体蛋白制备14型肺炎球菌多糖-蛋白结合物,比较2种结合物在小鼠体内的免疫原性。方法:以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)作为缩合剂,介导TT与ADH反应,制备TTAH衍生物,2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)法测定TTAH的-AH衍生率;将14型肺炎球菌多糖(PS14)水解并用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟化硼(CDAP)活化后直接与TT或TTAH结合,结合物经Sepharose 4 FF层析柱纯化后收集分配系数(KD)〈0.2的样品并除菌过滤作为结合物原液,并对其生化指标、血清学特异性和小鼠免疫原性进行检测。结果:2种结合物原液游离糖含量均在1%以内,多糖回收率分别为PS14-TT:33.80%及PS14-TTAH:29.15%。与A组(多糖组)相比,2种结合物B组(PS14-TT)和C组(PS14-TTAH)能够诱导更高的抗PS14抗体水平(P〈0.001)并具有剂次加强效应;与C组相比,B组能够诱导更高的抗PS14抗体水平且差异显著并具有统计学意义(P〈0.05);2组结合物免疫3针后C组抗TT抗体水平高于B组,但差异无统计学意义,B组无剂次加强效应,而C组有剂次加强效应。结论:PS14-TT在小鼠体内诱导了较高的抗PS14抗体水平及较低的抗TT抗体水平,是较理想的多糖蛋白结合疫苗。 展开更多
关键词 肺炎球菌 结合疫苗 破伤风类毒素 己二酸二酰肼 免疫原性
动态浊度法检测细菌内毒素含量在重组铜绿假单胞菌外毒素A制备中的应用
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作者 李燕婷 范锋锋 +5 位作者 毛睿 金鑫 冯宜扬 许博 谢贵 谭小梅 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第22期2590-2595,共6页
目的:应用动态浊度法监测重组铜绿假单胞菌外毒素A(r EPA)制备各阶段料液中的细菌内毒素含量,为其工艺优化和质量控制提供依据。方法:参考应用《中华人民共和国药典》2015年版三部载录的动态浊度法测定细菌内毒素含量,对该方法的专... 目的:应用动态浊度法监测重组铜绿假单胞菌外毒素A(r EPA)制备各阶段料液中的细菌内毒素含量,为其工艺优化和质量控制提供依据。方法:参考应用《中华人民共和国药典》2015年版三部载录的动态浊度法测定细菌内毒素含量,对该方法的专属性、精密度、重现性、准确性和标准曲线的可靠性进行了验证,并将该方法应用于r EPA制备各阶段料液中细菌内毒素含量的测定及细菌内毒素去除效果的评价。结果:该方法具有较好的专属性、精密度、重现性、准确性。结论:经方法验证显示该方法的专属性、精密度、重现性、准确性等技术参数达到了相关验证要求,结果稳定可靠。现有r EPA制备工艺能稳定、有效地去除细菌内毒素,纯化后r EPA中细菌内毒素含量较低。本研究为r EPA制备过程中细菌内毒素去除效果的评价提供了准确的参考数据。 展开更多
关键词 动态浊度法 细菌内毒素 方法验证 重组铜绿假单胞菌外毒素A
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