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通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法
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作者 李秋月 小柯 +3 位作者 张亚飞 孙珍珠 江东 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期3274-3282,共9页
CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167... CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。 展开更多
关键词 gRNA设计 CRISPR/Cas9 体外检测 基因编辑
侵染红肉火龙果的蟹爪兰X病毒贵州分离物基因组分析
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作者 郑乾明 小柯 +1 位作者 马玉华 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期219-225,共7页
通过高通量测序和RT-PCR扩增,克隆并分析蟹爪兰X病毒(Zygocactus virus X,ZyVX)贵州分离物ZyVX-GZ基因组序列。对表现病毒病症状的红肉火龙果植株进行高通量测序,获得4条ZyVX相关contig。RT-PCR扩增并拼接获得ZyVX-GZ基因组,全长为6 567... 通过高通量测序和RT-PCR扩增,克隆并分析蟹爪兰X病毒(Zygocactus virus X,ZyVX)贵州分离物ZyVX-GZ基因组序列。对表现病毒病症状的红肉火龙果植株进行高通量测序,获得4条ZyVX相关contig。RT-PCR扩增并拼接获得ZyVX-GZ基因组,全长为6 567 nt,5’-UTR和3’-UTR分别为60nt和70nt。含有5个ORF,分别编码复制酶蛋白、TGB1、TGB2、TGB3蛋白和外壳蛋白。ZyVX-GZ与P39和B1分离物基因组序列一致性均为91%。TGB1-3、外壳蛋白基因与大多数分离物核苷酸和推导的氨基酸序列一致性分别为95%~99%和96%~100%;复制酶基因的核苷酸和推导的氨基酸序列一致性分别为80%~89%和92%~97%。系统进化分析表明,ZyVX群体的遗传分化与寄主种类、地理分布不存在相关性。本研究结果丰富了ZyVX群体的基因组序列信息,为ZyVX的监测和防控提供了基础。 展开更多
关键词 复制酶 外壳蛋白 核苷酸 序列一致性
浅析小学数学提高学生口算能力的研究 预览
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作者 小柯 《新教育时代电子杂志(学生版)》 2019年第11期0028-0028,0023共2页
口算能力是最基本的数学能力,口算也就是心算,是不学生通过思维直接算出结果的一种计算方法。
关键词 小学数学 学生口算能力
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柠檬和宽皮柑橘果肉的氨基酸组成特征分析 预览
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作者 李文云 罗怿 +2 位作者 柏自琴 小柯 李金强 《贵州农业科学》 CAS 2019年第7期100-104,共5页
为柠檬生产栽培、营养评价和综合利用提供理论依据,比较分析柠檬和宽皮柑橘果肉中氨基酸组成差异,采用GC-MS检测3个柠檬品种(尤力克柠檬、四季柠檬、阿特摩柠檬)和2个宽皮柑橘品种(对照,牛肉红朱橘和朱红橘)果肉中的氨基酸含量,并对其... 为柠檬生产栽培、营养评价和综合利用提供理论依据,比较分析柠檬和宽皮柑橘果肉中氨基酸组成差异,采用GC-MS检测3个柠檬品种(尤力克柠檬、四季柠檬、阿特摩柠檬)和2个宽皮柑橘品种(对照,牛肉红朱橘和朱红橘)果肉中的氨基酸含量,并对其组成特征进行分析。结果表明:5个品种中共检测到9种氨基酸,其中脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量较高,含量为0.31~3.20mg/g;缬氨酸含量极低,且仅在3个柠檬品种中检测到;除5-焦谷氨酸外,其他8种氨基酸在3个柠檬品种中的平均含量均显著高于2个宽皮柑橘;柠檬果肉中各呈味氨基酸含量显著高于宽皮柑橘,其中,甜味氨基酸和鲜味氨基酸是宽皮柑橘的1.86倍和4.40倍。综合评价,柠檬果肉中氨基酸种类和含量高于宽皮柑橘,是导致其生物学活性和风味不同于宽皮柑橘的原因之一。 展开更多
关键词 柠檬 宽皮柑橘 果肉 氨基酸 风味
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贵州武陵山地区19份柚资源的遗传多样性 预览
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作者 小柯 郑乾明 +3 位作者 罗怿 李文云 柏自琴 李金强 《贵州农业科学》 CAS 2019年第2期75-80,共6页
为保护野生和地方柚品种资源、挖掘优良性状,采集贵州武陵山地区19份柚样品,提取总DNA,利用Illumina HiSeq 4000PE150测序,构建GBS(Genotyping-by-Sequencing)文库;使用Samtools软件进行SNP(SingleNucleotidePolymorphism)检测;基于SNP... 为保护野生和地方柚品种资源、挖掘优良性状,采集贵州武陵山地区19份柚样品,提取总DNA,利用Illumina HiSeq 4000PE150测序,构建GBS(Genotyping-by-Sequencing)文库;使用Samtools软件进行SNP(SingleNucleotidePolymorphism)检测;基于SNP基因分型结果采用邻接法构建系统进化树,对19份柚资源进行遗传多样性分析。结果表明:19份柚资源测序总碱基数5.61Gbp且测序质量较高,平均测序深度10.67,与柚参考基因组的平均比对匹配率为98.47%。共获得79825个高质量的SNP位点,所有SNP位点在柚基因组9条染色体上基本均匀分布。系统进化树显示19份样品被聚为3个主要的类群且遗传差异较小。 展开更多
关键词 单核苷酸多态性 核苷酸多样性 遗传多样性
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柠檬成熟果实可溶性糖和有机酸积累特征分析
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作者 李文云 罗怿 +3 位作者 柏自琴 小柯 李金强 徐娟 《中国南方果树》 北大核心 2019年第4期21-24,共4页
利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对贵州惠水栽培的3个柠檬品种(尤力克柠檬、四季柠檬、阿特摩柠檬)和2个地方特色宽皮柑桔品种(牛肉红朱桔和朱红桔)成熟果实(取果肉)的可溶性糖和有机酸进行了检测。结果表明,共检测到蔗糖、果糖、葡萄... 利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对贵州惠水栽培的3个柠檬品种(尤力克柠檬、四季柠檬、阿特摩柠檬)和2个地方特色宽皮柑桔品种(牛肉红朱桔和朱红桔)成熟果实(取果肉)的可溶性糖和有机酸进行了检测。结果表明,共检测到蔗糖、果糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、木糖醇、半乳糖苷、吡喃葡萄糖苷、麦芽糖和核糖等10种可溶性糖,以及柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、草酸、棕榈酸、酒石酸、硬脂酸、2-酮戊二酸、甘油酸和D-葡萄糖酸等10种有机酸。柠檬和宽皮柑桔果肉中可溶性糖和有机酸的组分类似,差异主要在含量上,宽皮柑桔可溶性糖含量远高于柠檬,柠檬有机酸含量远高于宽皮柑桔。果肉中主要的可溶性糖为蔗糖、果糖和葡萄糖,这3种主要可溶性糖在宽皮柑桔中的平均含量(以干重计)为467.35、234.34和170.16 mg/g,均明显高于柠檬,分别是柠檬的4.51、2.18和1.68倍。柠檬酸是柑桔果肉中最主要的有机酸,柠檬果肉中柠檬酸平均含量为399.78 mg/g,是宽皮柑桔的12.18倍。可溶性糖和有机酸含量反映了柑桔品种的种质特征,与果实风味和口感一致。 展开更多
关键词 柠檬 风味 可溶性糖 有机酸
‘惠水金橘’的叶绿体基因组特征分析 预览
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作者 小柯 郑乾明 +4 位作者 罗怿 柏自琴 李文云 李金强 蔡永强 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期257-265,共9页
【目的】分析贵州地方柑橘品种‘惠水金橘’的叶绿体基因组特征及分子标记,为研究该品种的系统进化关系、丰富柑橘类果树叶绿体分子标记奠定基础。【方法】提取‘惠水金橘’成熟叶片总DNA,构建小片段插入文库并测序,以甜橙叶绿体基因组... 【目的】分析贵州地方柑橘品种‘惠水金橘’的叶绿体基因组特征及分子标记,为研究该品种的系统进化关系、丰富柑橘类果树叶绿体分子标记奠定基础。【方法】提取‘惠水金橘’成熟叶片总DNA,构建小片段插入文库并测序,以甜橙叶绿体基因组为参考,筛选叶绿体基因组相关序列组装,开展SSR(simple sequence repeat,简单重复序列)预测、SNP(single nucleotide polymorphisms,单核苷酸多态性)/InDel(insertion-deletion,插入缺失)分析以及聚类分析。【结果】组装后获得叶绿体基因组全长为160 698 bp,GC含量为38.42%,共有117种基因被注释;检测到92个SSR位点,大部分的SSR位点都偏向于A/T组成;检测到417个SNPs位点、149个InDels位点、InDel的标记密度约为每kb 0.927个。进化树显示该品种与其他宽皮柑橘聚为一大类。【结论】利用高通量测序技术挖掘柑橘叶绿体基因组DNA分子标记是可行的。 展开更多
关键词 柑橘 叶绿体基因组 高通量测序 SSRS SNP/InDels
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杂柑“甘平”在重庆北碚的引种表现及栽培技术 被引量:1
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作者 江东 孙珍珠 +3 位作者 小柯 刘小丰 冉志林 《中国南方果树》 北大核心 2017年第1期32-33,36共3页
2012年从韩国济州引进杂柑品种“甘平”至重庆北碚试栽,连续3年进行了引种观察。该品种幼树直立生长性较强,结果后树姿开张,以有叶花序枝的着果率较高。在引种地表现出果实大、糖度高、果皮薄、易裂果的固有特征。果实儿月中旬转色... 2012年从韩国济州引进杂柑品种“甘平”至重庆北碚试栽,连续3年进行了引种观察。该品种幼树直立生长性较强,结果后树姿开张,以有叶花序枝的着果率较高。在引种地表现出果实大、糖度高、果皮薄、易裂果的固有特征。果实儿月中旬转色,翌年1月上旬成熟,可溶性固形物达15.0%。单果质量240g,果皮橙红,果肉浓橙色,肉质细嫩化渣,汁多味甜,品质优良,香气较浓,果实完全无核,混栽会产生少量种子。生产中,防裂果是难点,主要措施有选用香橙砧、适时均衡供水、增施钾肥、叶面喷施赤霉素和三十烷醇等。此外,需注意通过促放秋梢的数量来调控载果量,以提高果实整齐度和避免大小年。 展开更多
关键词 柑桔 甘平 引种 重庆
宽皮柑橘种质资源表型多样性分析及综合评价 预览 被引量:4
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作者 孙珍珠 李秋月 +6 位作者 小柯 赵婉彤 薛杨 冯锦英 刘小丰 刘梦雨 江东 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第22期4362-4372,共11页
【目的】分析宽皮柑橘的表型多样性和遗传变异规律,探讨柑橘种质资源的综合评价方法。【方法】本研究利用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数及方差分析对239份宽皮柑橘的18种表型性状进行多样性分析和性状差异分析,用SPSS进行聚类分析... 【目的】分析宽皮柑橘的表型多样性和遗传变异规律,探讨柑橘种质资源的综合评价方法。【方法】本研究利用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数及方差分析对239份宽皮柑橘的18种表型性状进行多样性分析和性状差异分析,用SPSS进行聚类分析,通过主成分、相关性以及回归分析对宽皮柑橘种质资源进行综合评价和评价指标筛选。【结果】对239份宽皮柑橘表型多样性分析,变异系数结果表明种子数、固酸比、可滴定酸含量及单果重的性状变异比较丰富,果形指数、囊瓣数及可溶性固形物含量的遗传特性相对稳定。遗传多样性指数结果表明,单果重、横径、纵径、囊瓣数、叶柄长、叶长、叶宽、还原糖含量及转化糖含量在每一级分布比较均匀,果皮光滑度、种子数及固酸比分级较少,且在每个表现型上的分布不均匀。对5个不同地理来源的宽皮柑橘资源进行方差分析,结果显示来源于美国的宽皮柑橘品种可溶性固形物和转化糖的含量平均值高于其他地理来源;来源于日本的宽皮柑橘单果重、横径和纵径大于其他地理来源,种子数显著少于其他地理来源;来源于长江流域的宽皮柑橘品种的果型、可溶性固形物、转化糖及还原糖含量大于珠江流域,但固酸比显著低于珠江流域。对野生品种、地方品种、选育品种3种不同类型的宽皮柑橘性状作方差分析,选育品种呈现果型大、果皮光滑、种子少、酸度低、糖度高等特点。系统进化树和主成分分析图均表明不同地理来源、不同类型的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显差异,中国小果资源可作为一个独立类群,青皮蜜橘是一份独特的柑橘资源。主成分分析发现,前9个主成分的累计贡献率达81.94%,表明这9个主成分包含了宽皮柑橘表型性状的大部分信息。表型性状的综合评价分析表明,239份宽皮柑橘综合评价F值均值为0.480,来 展开更多
关键词 宽皮柑橘 表型多样性 不同地理来源 综合评价
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利用GBS技术研究240份宽皮柑橘的系统演化 预览 被引量:7
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作者 小柯 江东 孙珍珠 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第9期1666-1673,共8页
【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。... 【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。【方法】选用国家柑橘种质重庆资源圃保存的具有广泛遗传多样性和地理起源的240份宽皮柑橘作为材料,利用Eco R I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库;然后进行Illumina HiSeqPE150二代测序获得短读序列,通过BWA软件将序列映射到克里曼丁参考基因组上,再利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果,采用邻近法构建系统演化树,并进行主成分分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对240份宽皮柑橘进行测序,共获得96.3 Gb的测序数据,平均每个样本测序数据为401.26 Mb,经过测序深度为4X、Miss0.2、次要等位基因频率(MAF)〉0.01的筛选条件过滤,最后共获得了114 200个高质量的SNP位点。主成分分析结果显示240份宽皮柑橘被分为4大类,其中温州蜜柑亚群、野生宽皮柑橘亚群可明显区分于其他宽皮柑橘。利用系统演化树可将240份宽皮柑橘划分到11个类群中。系统演化树和主成分分析都揭示了不同地理来源和特定形态的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显的差异,比如来源于日本的温州蜜柑、欧美的克里曼丁橘及其杂种后代,以及中国南方的野生宽皮柑橘由于地理分布不同而形成了较为独特的类型,彼此间能够相互区分开。进化树结果表明中国南、北不同地域的宽皮柑橘可能存在不同的演化路径,南岭山脉及南方地区的野生宽皮柑橘、酸橘和目前南方地区栽培的砂糖橘存在较近的起源演化联系,而北方宽皮柑橘的演化却与宽皮柑橘中的古老地方品种存在紧密联系。人工杂交育种、长期的人工选择和驯化形成了不同类型的宽皮� 展开更多
关键词 GBS 宽皮柑橘 系统演化 品种鉴定
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45份宽皮柑桔野生和地方资源遗传多样性分析 预览 被引量:5
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作者 高恒锦 储春荣 +5 位作者 小柯 陈绍彬 晏承泉 闫树堂 孙珍珠 江东 《中国南方果树》 北大核心 2016年第2期1-9,共9页
利用SSR、InDel及来自于lncRNA的分子标记对不同地区的45份野生、半野生及地方宽皮柑桔资源进行了遗传多样性分析。31对引物共获得81个多态性标记位点,多态性标记位点的平均香农多样性指数为0.725,平均期望杂合度为0.413。群体遗传结构... 利用SSR、InDel及来自于lncRNA的分子标记对不同地区的45份野生、半野生及地方宽皮柑桔资源进行了遗传多样性分析。31对引物共获得81个多态性标记位点,多态性标记位点的平均香农多样性指数为0.725,平均期望杂合度为0.413。群体遗传结构、主坐标轴和聚类分析均表明,莽山野柑是一类原始、独特的柑桔种质;起源于南岭山脉的野生宽皮柑桔,如悬崖野桔、道县野桔、江永野桔-1、莽山桔、崇义野桔和江永野桔-5等构成了一类相对独特的原始野生类群;古老栽培柑桔中的皱皮柑类型,包括旺苍皱皮柑、皱皮柑、藏桔等构成了另一个原始古老类群,现代栽培柑桔城固冰糖桔中具有典型皱皮柑基因的渗入;宽皮柑桔中的一些育成品种及杂柑资源,具有较丰富的遗传多样性。本研究证实了起源于南岭山脉一带的野生宽皮柑桔在遗传背景上较为接近,其多样性也低于现代栽培宽皮柑桔,缺乏人为驯化和外源基因渗入,为南岭山脉是我国宽皮柑桔的起源中心这一论断提供了科学依据。由于长期的人为驯化和外源基因的渗入,宽皮柑桔的演化伴随着遗传多样性水平由低向高逐渐演变的过程。 展开更多
关键词 宽皮柑桔 莽山野柑 遗传多样性
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26份椪柑资源遗传多样性分析 预览 被引量:3
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作者 高恒锦 小柯 +3 位作者 张琰 闫树堂 孙珍珠 江东 《中国南方果树》 北大核心 2016年第4期11-17,共7页
利用SSR和InDel分子标记对来自不同国家与地区的26份椪柑资源进行了遗传多样性分析。21对引物共获得62个标记位点,产生了105条多态性条带。多态性标记位点的平均PIC值为0.32,平均期望杂合度为0.30。群体遗传结构和主坐标分析均表明,椪... 利用SSR和InDel分子标记对来自不同国家与地区的26份椪柑资源进行了遗传多样性分析。21对引物共获得62个标记位点,产生了105条多态性条带。多态性标记位点的平均PIC值为0.32,平均期望杂合度为0.30。群体遗传结构和主坐标分析均表明,椪柑资源内部遗传多样性水平低,遗传变异较小。印度酸桔与椪柑遗传关系较远;Emperor、濑户见及早香等椪柑杂交后代,与椪柑存在明显遗传差异。采用筛选的分子标记组合(SSR14、SSR16、InDel2、InDel6、SSR5和SSR20)可有效鉴别椪柑材料。 展开更多
关键词 分子标记 椪柑 分类
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融合基因VH-mms13的构建及其蛋白表达鉴定 预览
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作者 杨柳青 孔登 +3 位作者 雪耘 晓红 孟丽 小柯 《中国生化药物杂志》 CAS 2015年第12期6-8,12共4页
目的构建原核表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,诱导表达后鉴定融合蛋白表达。方法分别扩增单克隆抗体基因的重链可变区VH基因和细菌磁小体膜蛋白基因mms13基因,采用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension,SOE-PCR)构建融合基... 目的构建原核表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,诱导表达后鉴定融合蛋白表达。方法分别扩增单克隆抗体基因的重链可变区VH基因和细菌磁小体膜蛋白基因mms13基因,采用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension,SOE-PCR)构建融合基因VH-linker-mms13,并将融合基因插入pET30a(+)载体,酶切、测序验证;将重组质粒导入大肠杆菌DE3中,0.4 mmol/L异丙基疏代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blot双重鉴定。结果 PCR鉴定构建的融合基因VH-mms13大小为738 bp,与理论值相符,测序结果表明序列无误;转入DE3经IPTG诱导,在包含体中检测到融合蛋白表达;Western blot结果显示该表达蛋白可与His-tag抗体特异性结合,蛋白大小符合融合蛋白理论预期。结论成功构建了融合基因VH-mms13的表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,且融合蛋白反应原性良好,为生物磁靶向药物的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 VH mms13 重叠延伸PCR 融合蛋白
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着眼于提高医学生综合能力的分子医学实验课程群建设 被引量:2
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作者 付玉荣 梁淑娟 +2 位作者 伊正君 杨利丽 小柯 《中华医学教育探索杂志》 2014年第10期988-991,共4页
潍坊医学院为适应当代医学对医务工作者更高的知识与技能要求,以培养医学生分子医学素养与综合能力为目标,以课程群建设为思路,打破学科界限,组建分子医学实验课程群。将分子医学知识融入到实验课程群教学中,合理整合与优化实验教... 潍坊医学院为适应当代医学对医务工作者更高的知识与技能要求,以培养医学生分子医学素养与综合能力为目标,以课程群建设为思路,打破学科界限,组建分子医学实验课程群。将分子医学知识融入到实验课程群教学中,合理整合与优化实验教学内容体系,组建高素质教学团队,搭建多层次实验教学平台,实施以学生为主体的教学,探索有利于医学生形成系统分子医学知识与能力结构的实验教学途径。 展开更多
关键词 分子医学 实验课程 课程群 医学生 综合能力
ScFv(3G11)-mms13融合基因克隆及表达载体构建 预览
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作者 纪国强 邢秋翠 +2 位作者 孔登 付新华 小柯 《潍坊医学院学报》 2013年第3期168-170,211共4页
目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mmsl3并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mmsl3 ,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因体载。方根法据mmsl3基因和SeFv(3G11)基因的序列,设计以... 目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mmsl3并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mmsl3 ,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因体载。方根法据mmsl3基因和SeFv(3G11)基因的序列,设计以PCR引物,以克隆载体pMD18-mmsl3和pMDl8-ScFv为模板,采用SOE-PCR技术构建融合基因ScFv-Linker-mmsl3。进而将融合基因ScFv-mmsl3与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mmsl3,测序后应用软件DNAMAN进行分析。结果应用重叠延伸拼接PCR方法构建融合基因ScFv-linker-mmsl3(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFv-mmsl3。将融合基因ScFv-Linker-mmsl3插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mmsl3;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。结论通过SOE—PCR技术扩增了预先设计的长达1158bp的融合基因片段ScFv-Linker-mmsl3,并成功构建了重组质粒pMD18-ScFv-mmsl3及重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mmsl3,为磁小体用于肿瘤靶向治疗研究提供了实验材料。 展开更多
关键词 AMB-1 mms13 单链抗体 重叠延伸拼接PCR 融合基因
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融合蛋白ScFv(3G11)-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定 预览
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作者 邢秋翠 孔登 +3 位作者 纪国强 杨柳青 小柯 崔楠 《潍坊医学院学报》 2013年第6期407-410,共4页
目的:构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入... 目的:构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a(+)质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷( IPTG)诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a(+)-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0.2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a(+)-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。 展开更多
关键词 SCFV mms13 蛋白表达 SDS-PAGE WESTERNBLOT
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“梁主席”的幸福观 预览
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作者 薛书凯 小柯 《人大建设》 2013年第6期28-29,共2页
2003年,梁庆祥卸任方城县拐河镇人大副主席职务,带着满满一箩筐荣誉证书退休了。在此后的10年里,他骑着一辆旧自行车跑遍全镇35个行政村,为群众办实事、好事300多件。他德高望重,办事公道,是当地有名的"管事人";他一有空就走进中小学... 2003年,梁庆祥卸任方城县拐河镇人大副主席职务,带着满满一箩筐荣誉证书退休了。在此后的10年里,他骑着一辆旧自行车跑遍全镇35个行政村,为群众办实事、好事300多件。他德高望重,办事公道,是当地有名的"管事人";他一有空就走进中小学校,为同学们上德育课,被孩子们称为“最美爷爷”…… 展开更多
关键词 幸福观 荣誉证书 中小学校 副主席 方城县 行政村 自行车 办实事
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五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 陈勇 李耀辉 +2 位作者 阎芳 邵建新 小柯 《现代生物医学进展》 CAS 2012年第7期 1342-1345,1368,共5页
目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B... 目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性。结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应。结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法。 展开更多
关键词 流感病毒 呼吸道合胞病毒 多重RT-PCR
氧因素对趋磁螺菌AMB-1磁小体形成及其相关基因表达的影响 预览 被引量:1
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作者 陈小丽 纪国强 +4 位作者 孔登 付新华 陈永 邢秋翠 小柯 《潍坊医学院学报》 2012年第1期 21-25,共5页
目的 观察氧因素对趋磁螺菌AMB-1生长量、磁小体形成及其相关基因表达的影响,为确定磁小体合成最适条件和研究磁小体形成机制提供实验依据.方法 在地磁有铁条件下,AMB-1经培养驯化接种,分别置于好氧和微好氧条件下培养.定时取样检测菌液... 目的 观察氧因素对趋磁螺菌AMB-1生长量、磁小体形成及其相关基因表达的影响,为确定磁小体合成最适条件和研究磁小体形成机制提供实验依据.方法 在地磁有铁条件下,AMB-1经培养驯化接种,分别置于好氧和微好氧条件下培养.定时取样检测菌液OD600和Cmag值来研究细胞生长量和磁性增长量;用透射电镜观察16h菌样的磁小体形态;qRT-PCR检测磁小体相关基因mms13,magA和mms6的表达.结果 有铁微氧种子转至好氧条件培养12h后,其OD600值较对照组显著升高,2.5h后Cmag值明显降低,磁小体链短而疏松.16h菌样mms13,magA,mms6基因表达无明显差异.有铁好氧种子转至微氧条件培养14h后,其OD600值较对照组显著降低,10h后Cmag值显著增高,磁小体呈紧密的长链分布,16h菌样mms13基因表达量增加6倍,magA和mms6明显增高.结论 好氧条件有利于AMB-1细胞的生长,微氧条件促进磁小体的形成,并明显影响mms13,magA和mms6基因表达. 展开更多
关键词 趋磁螺菌AMB-1 氧因素 磁小体 基因表达
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FOXL2酵母双杂交诱饵载体构建及检测 预览
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作者 张伟 黄旭东 +4 位作者 韩小波 任珊珊 小柯 李艳艳 唐胜建 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期 6-10,共5页
目的:用FOXL2编码区片段构建酵母双杂交诱饵质粒并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法:PCR扩增FOXl2编码区DNA片段,克隆入pGBKT7质粒,转化至DH-5ct大量扩增后提取质粒,经PCR、酶切和测序验证,再转化至Y187酵母菌株中用缺... 目的:用FOXL2编码区片段构建酵母双杂交诱饵质粒并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法:PCR扩增FOXl2编码区DNA片段,克隆入pGBKT7质粒,转化至DH-5ct大量扩增后提取质粒,经PCR、酶切和测序验证,再转化至Y187酵母菌株中用缺陷培养基筛选并进行自激活和毒性检测。结果:获得FOXL2基因1137bp片段,并成功将人类正常和一突变型FOXL2编码区克隆入pGBKT7中,经检测在SD/-Trp/X—a—Gal单缺培养基平板上无蓝色菌斑出现,在SD/-Ade/-Trp培养基平板无生长。同时在SD/-Trp/Kana(20μg/ml)培养24h后测得菌液0D600≥O.8,说明重组诱质粒无自激活活性和酵母毒性,满足作为诱饵质粒的条件。结论:成功构建了正常及突变型的FOXL2酵母杂交诱饵质粒;为进一步利用酵母双杂交技术研究与FOXL2相互作用的蛋白打下坚实基础。 展开更多
关键词 FOXL2 BPES 酵母双杂交
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