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贵阳地区351株幽门螺杆菌药物敏感性及pbp1多样性分析 预览
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作者 吴芳草 王琼 +10 位作者 朱键 胡越 潘科 蒋强 雷静静 刘芳 文学琴 糜孟衡 王彩霞 陈峥宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期587-593,共7页
目的了解贵阳地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对5种抗生素药物敏感性及阿莫西林耐药菌株pbp1突变特征。方法采用界值法检测351株幽门螺杆菌临床菌株对5种抗菌药物的敏感性,对各药物耐药率以χ^2检验进行比较。选取20株阿... 目的了解贵阳地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对5种抗生素药物敏感性及阿莫西林耐药菌株pbp1突变特征。方法采用界值法检测351株幽门螺杆菌临床菌株对5种抗菌药物的敏感性,对各药物耐药率以χ^2检验进行比较。选取20株阿莫西林耐药菌株及相等数量的敏感菌株,提取基因组DNA,PCR扩增pbp1基因功能区并测序,采用DNAStar软件将核苷酸序列转换为氨基酸序列后进行比对和分析。结果351株幽门螺杆菌临床菌株对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星和四环素5种药物的耐药率分别为71.56%、34.60%、13.27%、40.28%、17.06%。20株阿莫西林耐药和20株敏感菌株PBP1氨基酸序列分析结果显示,PBP1多样性复杂,在耐药菌株特有变异位点中,PBP1氨基酸的S543R变异频率最高,为75%,其次是N641D为60%。结论本研究中的幽门螺杆菌对5种抗生素均有不同程度耐药,其中阿莫西林和四环素耐药率较其他地区高,并且双重耐药与多重耐药在总体耐药中所占比例较大;阿莫西林耐药菌株PBP1氨基酸存在多位点多态性,可能与幽门螺杆菌阿莫西林耐药有关。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 耐药性 阿莫西林 青霉素结合蛋白
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以Real-time PCR方法检测耐药幽门螺杆菌中HefABC基因的表达
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作者 王琼 吴芳草 +10 位作者 郭长城 刘芳 潘科 许良碧 张永宏 熊妍 印琳 吴晓娟 张峥嵘 陈峥宏 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期1797-1803,共7页
为了探讨耐药幽门螺杆菌(Helicobacter. pylori)主动外排系统hefA、hefB、hefC基因表达与菌株克拉霉素耐药、阿莫西林耐药以及多重耐药的关系,随机选择H. pylori克拉霉素耐药株、阿莫西林耐药株、敏感株、多重耐药株各10株,利用Real-tim... 为了探讨耐药幽门螺杆菌(Helicobacter. pylori)主动外排系统hefA、hefB、hefC基因表达与菌株克拉霉素耐药、阿莫西林耐药以及多重耐药的关系,随机选择H. pylori克拉霉素耐药株、阿莫西林耐药株、敏感株、多重耐药株各10株,利用Real-time PCR方法检测HefABC系统的表达,以成组t检验法对敏感株与各耐药株之间mRNA表达水平进行比较。结果显示,hefA在敏感组、克拉霉素耐药组、阿莫西林耐药组、多重耐药组中的mRNA表达量以2-ΔΔCt表示,分别为0.903 9±0.154 07、1.482 2±0.378 5、1.278 0±0.206 2、2.255 7±0.289 2,克拉霉素耐药组与敏感组比较:t=4.489,p<0.05;阿莫西林耐药组与敏感组比较:t=4.631,p<0.05;多重耐药组与敏感组比较:t=13.11,p<0.05。hefB在敏感组、克拉霉素耐药组、阿莫西林耐药组、多重耐药组中的m RNA表达量以2-ΔΔCt表示,分别为0.075 9±0.015 7、0.636 1±0.162 3、0.906 4±0.127 6、1.149 2±0.305 8,克拉霉素耐药组与敏感组比较:t=10.86,p<0.05;阿莫西林耐药组与敏感组比较:t=20.42,p<0.05;多重耐药组与敏感组比较:t=11.09,p<0.05。hefC在敏感组、克拉霉素耐药组、阿莫西林耐药组、多重耐药组中的m RNA表达量以2-ΔΔCt表示,分别为0.128 2±0.054 5、1.319 4±0.272 4、0.683 0±0.185 0、3.480 2±0.932 6;克拉霉素耐药组与敏感组比较:t=13.56,p<0.05;阿莫西林耐药组与敏感组比较:t=9.096,p<0.05;多重耐药组与敏感组比较:t=11.35,p<0.05。研究结果证实,H. pylori中外排系统hefA、hefB、hefC的高表达与菌株对克拉霉素耐药、阿莫西林耐药及多重耐药均有关。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 阿莫西林 克拉霉素 耐药性 外排泵
艰难梭菌黏附因子研究进展 预览
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作者 饶凤琴 吴昌学 +3 位作者 程玉梅 齐晓岚 洪伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第10期1117-1121,共5页
艰难梭菌是一种机会性致病菌,是导致抗生素相关性腹泻和伪膜性结肠炎的主要病原菌。在艰难梭菌致病周期中,艰难梭菌黏附于肠壁细胞、进一步产生毒素并入侵肠上皮细胞尤为重要,是其致病过程的关键环节。艰难梭菌黏附过程需要多种黏附因... 艰难梭菌是一种机会性致病菌,是导致抗生素相关性腹泻和伪膜性结肠炎的主要病原菌。在艰难梭菌致病周期中,艰难梭菌黏附于肠壁细胞、进一步产生毒素并入侵肠上皮细胞尤为重要,是其致病过程的关键环节。艰难梭菌黏附过程需要多种黏附因子的参与,目前已知的黏附因子有细胞壁结合蛋白(Cwp6、Cwp8、Cwp2)、S层蛋白(SlpA)、细胞表面蛋白(Cwp66)、热休克蛋白(GroEL)、纤维连接蛋白(Fbps)、鞭毛蛋白(FliC、FliD)及脂蛋白(CD0873)等。本文对艰难梭菌黏附因子的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 艰难梭菌 黏附因子 致病机制 艰难梭菌感染 伪膜性结肠炎 肠上皮细胞 炎症
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艰难梭菌中粪肠球菌污染的去除方法 预览
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作者 饶凤琴 程玉梅 +4 位作者 张婷 周青帅 齐晓岚 洪伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第10期1122-1127,1133共7页
目的:建立从粪肠球菌-艰难梭菌混合培养物中分离艰难梭菌的方法。方法:取不同厂家脑心浸出液(BHI)培养基、不同抗生素和是否添加羊血(或血清)3种组分进行组合,加入粪肠球菌-艰难梭菌混合物进行培养;显微镜观察不同组分培养基中细菌形态... 目的:建立从粪肠球菌-艰难梭菌混合培养物中分离艰难梭菌的方法。方法:取不同厂家脑心浸出液(BHI)培养基、不同抗生素和是否添加羊血(或血清)3种组分进行组合,加入粪肠球菌-艰难梭菌混合物进行培养;显微镜观察不同组分培养基中细菌形态,将不同组分培养基中获得的混合培养物划线固体平板培养基并培养、观察菌落形态及菌落气味,采用16SrDNA测序技术评价不同组合培养基对艰难梭菌的纯化效果。结果:艰难梭菌抗生素抗性实验结果显示,艰难梭菌对氯霉素、克拉霉素和氨苄青霉素敏感,对四环素、D-环丝氨酸和头孢西丁具有抗性;在相同艰难梭菌接种量条件下,不同生产厂家BHI-酵母粉培养基(BHIS)均有艰难梭菌典型的沉淀生成,并伴有浓烈臭鸡蛋气味;显微镜观察发现纯化前艰难梭菌与粪肠球菌共培养物有大量球菌和链球菌、少量杆菌;BHIS-BDC培养基所有视野中无球菌,仅见杆状细菌;BHIS培养基上艰难梭菌仅在平板边缘形成零星菌落,BHIS-BDC培养基表面形成典型艰难梭菌菌落;16SrDNA测序结果表明1~2mm菌落为粪肠球菌,3~5mm菌落为艰难梭菌。结论:不同生产厂家的BHIS培养基对艰难梭菌中粪肠球菌的去除没有明显差异,BHIS培养基中添加羊血、D-环丝氨酸与头孢西丁复合抗生素可去除艰难梭菌中粪肠球菌污染。 展开更多
关键词 肠球菌 梭菌感染 培养基 重症监护病房 结肠炎 细菌 厌氧
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敲除PaLoc毒力岛的无毒性艰难梭菌菌株的构建 预览
5
作者 饶凤琴 程玉梅 +4 位作者 吴昌学 王义 齐晓岚 洪伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第10期1128-1133,共6页
目的:使用CRISPR-Cfp1系统敲除艰难梭菌毒性(PaLoc)毒力基因岛,构建无毒性艰难梭菌菌株。方法:使用分子克隆方法,构建针对PaLoc毒力岛的基因打靶质粒pWH53;将pWH53质粒转化艰难梭菌630菌株后,诱导Cpf1蛋白表达,PCR筛选发生双交换的PaLo... 目的:使用CRISPR-Cfp1系统敲除艰难梭菌毒性(PaLoc)毒力基因岛,构建无毒性艰难梭菌菌株。方法:使用分子克隆方法,构建针对PaLoc毒力岛的基因打靶质粒pWH53;将pWH53质粒转化艰难梭菌630菌株后,诱导Cpf1蛋白表达,PCR筛选发生双交换的PaLoc敲除突变株,测序验证设计位点是否发生等位双交换。结果:PCR结果显示,获得的16株转化子中有8株为敲除PaLoc突变株,阳性率为50%;测序结果显示,获得的8株敲除PaLoc突变株均在设计位点发生了等位双交换。结论:成功构建艰难梭菌毒性毒力岛敲除PaLoc突变株。 展开更多
关键词 艰难梭菌 CRISPR-Cpf1系统 PaLoc毒力岛 基因敲除 活菌疫苗 毒性基因 梭菌感染 载体 质粒
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幽门螺杆菌四环素耐药与16SrDNA突变的关系
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作者 文学琴 吴芳草 +10 位作者 刘芳 朱键 胡越 雷静静 王彩霞 陈相好 王琼 印琳 陈峥宏 谷俊莹 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第4期433-438,共6页
目的了解贵州地区近年来人感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对四环素的耐药性及其16SrRNA基因突变情况,分析两者的相关性。方法采用琼脂稀释法对194株临床Hp菌株进行四环素药物敏感性试验;分析儿童感染株及成人感染株四环素耐药... 目的了解贵州地区近年来人感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对四环素的耐药性及其16SrRNA基因突变情况,分析两者的相关性。方法采用琼脂稀释法对194株临床Hp菌株进行四环素药物敏感性试验;分析儿童感染株及成人感染株四环素耐药性差异;选取14株Hp四环素耐药株和14株四环素敏感株及质控株Hp26695进行16SrRNA基因片段PCR扩增与测序,与GenBank中Hp相关序列进行比对分析;选取四环素耐药株H64 PCR扩增16SrRNA基因后自然转化入受体菌Hp 26695,并用四环素药物平板(2μg/ml)筛选耐药克隆,对耐药的单克隆菌株进行16SrRNA基因片段PCR扩增与测序,并与供体菌、受体菌、GenBank中Hp ATCC26695的16SrRNA基因进行比对分析。结果194株Hp中四环素耐药菌株32株,耐药率为16.49%。其中儿童分离菌株四环素耐药率为18.75%(6/32),成人分离株四环素耐药为16.05%(26/162),两组耐药率比较差异无统计学意义(χ2=0.141,P>0.05)。对随机选择的14株耐药菌、14株敏感菌及质控株Hp26695进行16SrRNA基因片段测序分析,耐药株和敏感株共有突变位点有6个,分别为T809C、811+C、872+C、C989T、T1082C、T1103C;有3株耐药株存在与四环素耐药相关的A926C或A926G单碱基突变。经过自然转化,共培养出9个四环素耐药单克隆。将各单克隆转化菌和供体菌H64及受体菌26695的16SrRNA基因序列与GenBank中Hp ATCC26695比对,9株单克隆转化菌和供体菌H64一致,均存在A926G、T1082C、T1103C突变。此外,受体菌26695、供体菌H64及转化菌株均存在T809C、811+C、872+C碱基突变,有4株转化菌分别存在与供体菌H64不一致T1103C和C724T自发突变。结论本实验分离的贵州地区人感染Hp对四环素的耐药率较全国Hp四环素平均耐药率(8.8%)偏高;贵州地区四环素耐药菌株和敏感菌株16SrDNA均存在突变;T809C、811+C、872+C、T1082C、T1103C为贵州地区Hp常见的自发突变,与四环素耐药无关,而A926G突变 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 四环素 耐药性 基因突变 自然转化
胃内尿素酶阳性细菌对幽门螺杆菌感染诊断的影响 被引量:1
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作者 郭长城 熊妍 +8 位作者 吴芳草 潘科 张永宏 刘芳 朱莉 王琼 印琳 陈峥宏 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第2期127-130,共4页
目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌(Helicobacter.pylori,Hp)感染的影响。方法胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜,行快速尿素酶检测(Rapid urease test,RUT)及细菌培养,根据培养物的菌落形态、革兰染色、RU... 目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌(Helicobacter.pylori,Hp)感染的影响。方法胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜,行快速尿素酶检测(Rapid urease test,RUT)及细菌培养,根据培养物的菌落形态、革兰染色、RUT及Hp特异性16SrRNA基因片段PCR进行Hp的鉴定;提取胃黏膜组织DNA,通过Hp特异性PCR进行Hp感染快速诊断。对Hp阴性(Hp培养或特异性PCR阴性)而RUT阳性胃黏膜培养的非Hp(nonHp)进行常规尿素酶生化试验,选取20株尿素酶阳性non-Hp利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增并测序,利用NCBI系统进行序列比对,鉴定细菌种类。结果 606例患者胃黏膜RUT阳性率为58.4%(354/606),Hp培养阳性率29.7%(180/606)。Hp培养阴性胃黏膜特异性PCR阳性113例,Hp感染率为48.35%(293/606)。胃黏膜RUT阳性率高于胃黏膜Hp感染(χ^2=1,2.337,P〈0.05)。61例RUT阳性Hp培养或特异性PCR阴性的胃黏膜培养出80株non-Hp,其常规尿素酶生化检查均阳性。对其中20株尿素酶阳性non-Hp进行测序鉴定,均为产尿素酶菌。结论胃内存在除Hp外其他细菌,包括尿素酶阳性non-Hp,可造成RUT阳性,干扰Hp感染的实验诊断。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 非幽门螺杆菌 快速尿素酶试验 胃内菌群
典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展 预览 被引量:1
8
作者 刘亚君 +2 位作者 洪伟 张杰 《生物加工过程》 CAS CSCD 2014年第1期55-62,共8页
以解纤维梭菌( Clostridium cellulolyticum)和热纤梭菌( Clostridium thermocellum)为代表的产纤维小体梭菌可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化,是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌株。然而,这些... 以解纤维梭菌( Clostridium cellulolyticum)和热纤梭菌( Clostridium thermocellum)为代表的产纤维小体梭菌可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化,是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌株。然而,这些产纤维小体梭菌的纤维素降解效率及乙醇产量尚不能满足工业化生产的要求,其遗传改造技术的不成熟严重制约了通过定向代谢工程改造提高生产性能的进程。针对这些典型的产纤维小体菌株,各国科学家近年来在基于二类内含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台建立方面取得了较大突破,并通过靶向代谢工程改造,显著提高纤维素乙醇的产量。笔者对这些前期研究工作以及国内外相关研究成果进行系统的总结,并对构建的遗传改造工具的应用前景进行展望。 展开更多
关键词 纤维小体 纤维素降解 乙醇 代谢工程 二类内含子
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肺炎链球菌HMGS和HMGR有利于寻找抑制先导化合物 预览
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作者 贲亚玮 刘德立 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2010年第11期1134-1137,共4页
目的对肺炎链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶和还原酶(HMGS和HMGR)进行动力学和功能研究。方法克隆表达肺炎链球菌HMGS和HMGR,检测洛伐他汀对它们的抑制作用,分别以HMGS酶促反应的产物和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)作... 目的对肺炎链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶和还原酶(HMGS和HMGR)进行动力学和功能研究。方法克隆表达肺炎链球菌HMGS和HMGR,检测洛伐他汀对它们的抑制作用,分别以HMGS酶促反应的产物和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)作为底物检测几种苗头化合物对HMGR的抑制性。结果洛伐他汀对HMGR有抑制作用,对HMGS无抑制作用,HMGS酶促反应的产物和HMG-CoA在HMGR检测苗头化合物抑制性的筛药反应中效果相似。结论 HMGS酶促反应的产物可以代替HMG-CoA进行苗头化合物初筛,可降低筛药成本,利于寻找新型高效抑制先导化合物。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 抑制先导化合物
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肺炎链球菌HMG-CoA合成酶基因克隆和表达 预览
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作者 贲亚琍 刘德立 《哈尔滨医科大学学报》 CAS 北大核心 2010年第5期 450-454,共5页
目的克隆、表达肺炎链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme Asynthase,HMGS)。方法采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMGS基因,对T226进行反突变,构建重组表达载体pET-HMGSm并表达HMGS。结果序列... 目的克隆、表达肺炎链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme Asynthase,HMGS)。方法采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMGS基因,对T226进行反突变,构建重组表达载体pET-HMGSm并表达HMGS。结果序列分析表明该基因与文献中报道的肺炎链球菌HMGS基因(No.AF290098)相比较有98.5%的同源性,存在18个核苷酸的差异,其中有2个核苷酸的不同导致编码的氨基酸改变,分别是Asn259→Ser,Ala349→Val,该基因编码蛋白由398个氨基酸组成。结论优化重组HMGS表达条件,在18℃0.4 mmol/L IPTG诱导表达4 h,用Ni-NTA层析柱分离纯化得到46 kDa特异性蛋白。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶 克隆 表达
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肺炎链球菌HMGS基因克隆及同源模建 预览 被引量:2
11
作者 贲亚琍 +1 位作者 张青叶 刘德立 《山东医药》 CAS 北大核心 2010年第1期 82-83,共2页
目的构建肺炎链球菌HMGS同源模建。方法采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMG.CoA合成酶(HMGS)基因,测序获得HMGS基因序列,以粪肠球菌HMGS(IX9E)为模板,通过SYBYL7.0软件构建同源模建。结果成功地构建了肺炎链球菌HMGS同源模建... 目的构建肺炎链球菌HMGS同源模建。方法采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMG.CoA合成酶(HMGS)基因,测序获得HMGS基因序列,以粪肠球菌HMGS(IX9E)为模板,通过SYBYL7.0软件构建同源模建。结果成功地构建了肺炎链球菌HMGS同源模建。结论获得的肺炎链球菌HMGS基因序列与IX9E的基因有53%同源序列;可以为根据肺炎链球菌HMGS同源模建寻找结构类似物来开发新药奠定基础。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 HMGS 克隆 同源模建
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肺炎链球菌HMG-CoA合成酶动力学研究 预览
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作者 贲亚琍 刘德立 《广西医科大学学报》 CAS 2010年第4期 493-496,共4页
目的:在克隆表达肺炎链球菌HMG-CoA合成酶(HMGS)的基础上,对HMGS进行动力学研究。方法:采用紫外分光光度法,以乙酰-CoA作为底物,检测乙酰乙酰-CoA在300 nm处吸收值的变化。结果:肺炎链球菌HMGS的最适pH 9.75、最适温度37℃、最适Mg... 目的:在克隆表达肺炎链球菌HMG-CoA合成酶(HMGS)的基础上,对HMGS进行动力学研究。方法:采用紫外分光光度法,以乙酰-CoA作为底物,检测乙酰乙酰-CoA在300 nm处吸收值的变化。结果:肺炎链球菌HMGS的最适pH 9.75、最适温度37℃、最适MgCl2浓度为10 mol/L,粗酶提取物的比活为0.76μmol/min·mg^-1,分离纯化后的比活为3.24μmol/min·mg^-1,比活提高4.26倍。结论:在37℃、pH 9.755、mol/L MgCl2的最适反应条件下,肺炎链球菌HMGS的Vmax和Km值分别为4.69μmol/min·mg^-1和213μmol。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 HMGS 酶特性鉴定
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HMG-CoA还原酶催化机理与特性分析 被引量:3
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作者 贲亚琍 +1 位作者 李娜 刘德立 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2008年第6期542-545,共4页
HMG—CoA还原酶是甲羟戊酸生物合成的限速酶。系统进化分析表明生物界存在两类HMG—CoA还原酶,Ⅰ类主要存在于真核生物和部分古细菌中,Ⅱ类主要存在于原核生物和少数古细菌中。它汀类药物抑制HMG—CoA还原酶活性,是HMG—CoA还原酶的... HMG—CoA还原酶是甲羟戊酸生物合成的限速酶。系统进化分析表明生物界存在两类HMG—CoA还原酶,Ⅰ类主要存在于真核生物和部分古细菌中,Ⅱ类主要存在于原核生物和少数古细菌中。它汀类药物抑制HMG—CoA还原酶活性,是HMG—CoA还原酶的良好竞争性抑制剂。文章阐述了HMG—CoA还原酶的催化机理及系统进化特征与分类,并比较了两类HMG—CoA还原酶催化特性的差异。 展开更多
关键词 HMG—CoA还原酶 甲羟戊酸 它汀类药物
克林顿时期教育改革评述 预览
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作者 刘婵婵 《安徽文学:下半月》 2008年第7期238-238,共1页
美国作为当今世界上唯一的超级大国,进入20世纪90年代以后,对教育问题的关注,全国上下从联邦政府到地方,由社会到学校,推动教育改革的积极性一浪高过一浪。从某种意义上来说,美国总统克林顿在这一时期的教育改革,也是世界教育改革大潮... 美国作为当今世界上唯一的超级大国,进入20世纪90年代以后,对教育问题的关注,全国上下从联邦政府到地方,由社会到学校,推动教育改革的积极性一浪高过一浪。从某种意义上来说,美国总统克林顿在这一时期的教育改革,也是世界教育改革大潮翻起的浪花。它具有明显的国际背景,也在一定程度上代表了国际教育改革发展的趋势和特点。他采取了一系列的教育改革措施,虽然没有完全实现,但也取得了明显的成效,对美国经济的持续高速增长发挥了重要作用。 展开更多
关键词 克林顿 教育改革
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L1.LtrB内含子编码蛋白反转录结构域关键催化位点分析及功能验证
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作者 陈相好 张峥嵘 +5 位作者 刘芳 陈峥宏 洪伟 綦廷娜 谷俊莹 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期2357-2366,共10页
【目的】筛选影响Ll.LtrB内含子编码蛋白(Intron encoded protein,IEP)反转录功能的关键催化位点,并获得无反转录活性的IEP突变体。【方法】首先,利用NCBI数据库,通过序列比对及同源建模方法筛选影响IEP反转录功能的关键氨基酸催化位点... 【目的】筛选影响Ll.LtrB内含子编码蛋白(Intron encoded protein,IEP)反转录功能的关键催化位点,并获得无反转录活性的IEP突变体。【方法】首先,利用NCBI数据库,通过序列比对及同源建模方法筛选影响IEP反转录功能的关键氨基酸催化位点;然后,对筛选获得的关键催化位点进行定点突变,同时以Targetron载体为模板,构建无反转录功能的突变型Targetron打靶系统;最后,以大肠杆菌lacZ基因为例,体内验证IEP突变体的功能及其对Ⅱ型内含子"归巢"效率的影响。【结果】筛选到C164和G214两个位点是影响内含子编码蛋白反转录功能的关键氨基酸残基,并获得C164K和G214W两个突变体。体内功能分析表明,此两个位点突变完全失活了Ⅱ型内含子的"归巢"功能。【结论】筛选并获得了失活反转录功能的Ll.LtrB内含子编码蛋白突变体,为深入研究Ⅱ型内含子的结构和"归巢"机理奠定了基础。 展开更多
关键词 Ll.LtrB Ⅱ型内含子 内含子编码蛋白 反转录 Targetron
高效严谨型大肠杆菌Targetron 基因打靶系统的构建 预览
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作者 陈相好 谷俊莹 +8 位作者 刘芳 王彩霞 陈峥宏 洪伟 蔡梦迪 张峥嵘 綦廷娜 廖永慧 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期213-220,共8页
构建高效严谨型大肠杆菌Targetron 基因打靶系统。将来源于pET28a 的T7-lac 操纵子与来源于pSY6 的II 型内含子组装构建大肠杆菌IPTG 诱导型Targetron 质粒系统。以lacZ 基因为例,选择lacZ-635s 和lacZ-1063a 两个位点为靶位点,利用构建... 构建高效严谨型大肠杆菌Targetron 基因打靶系统。将来源于pET28a 的T7-lac 操纵子与来源于pSY6 的II 型内含子组装构建大肠杆菌IPTG 诱导型Targetron 质粒系统。以lacZ 基因为例,选择lacZ-635s 和lacZ-1063a 两个位点为靶位点,利用构建的IPTG 诱导型Targetron 系统进行基因打靶,通过分析诱导前和诱导后II 型内含子在靶位点的插入效率,验证大肠杆菌IPTG 诱导型Targetron 系统严谨性和打靶效率。最后,通过优化诱导剂浓度及诱导时间,建立高效严谨的诱导型大肠杆菌Targetron 基因打靶系统。在没有IPTG 诱导时,II 型内含子在两个位点均不能插入,打靶效率均为0;当加入0.5 mmol/L IPTG 诱导45 min 时,其在lacZ-635s 位点的打靶效率提高到90.8±5.5%,在lacZ-1063a 位点的打靶效率提高到92.6±2.4%。成功建立高效严谨型大肠杆菌Targetron 基因打靶系统,旨为II 型内含子的机理研究及应用奠定基础。 展开更多
关键词 Targetron II 型内含子 诱导系统 大肠杆菌 LACZ
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大肠杆菌Targetron基因打靶载体构建及应用 预览
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作者 黄瑾 陈相好 +4 位作者 吴晓娟 张峥嵘 谷俊莹 陈峥宏 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期745-750,共6页
目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的pSY7载体为基础、以大肠杆菌lacZ基因为例,选择lacZ-1683a和lacZ-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重叠延伸PCR方法... 目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的pSY7载体为基础、以大肠杆菌lacZ基因为例,选择lacZ-1683a和lacZ-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重叠延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到pSY7载体,获得pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率。结果:成功构建了pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lacZ-1683a、lacZ-1874s位点,蓝白斑计数显示lacZ-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)%,lacZ-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)%。结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点。 展开更多
关键词 Ⅱ型内含子 打靶载体 大肠杆菌 重叠延伸PCR Targetron基因
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艰难梭菌sigB基因簇CRISPR-Cas9敲除载体的构建及验证 预览
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作者 陈相好 蔡梦迪 +4 位作者 陈峥宏 谷俊莹 文学琴 洪伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期751-756,共6页
目的:构建艰难梭菌rsbV(编码anti-anti-sigma因子)、rsbW(编码anti-sigma因子)及sigB基因(编码sigma-B因子)的CRISPR-Cas9敲除载体。方法:利用重叠延伸PCR技术分别扩增针对艰难梭菌rsbV、rsbW及sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,并分别... 目的:构建艰难梭菌rsbV(编码anti-anti-sigma因子)、rsbW(编码anti-sigma因子)及sigB基因(编码sigma-B因子)的CRISPR-Cas9敲除载体。方法:利用重叠延伸PCR技术分别扩增针对艰难梭菌rsbV、rsbW及sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,并分别将其克隆到pJZ23载体上,采用菌落PCR结合DNA测序验证所构建的基因敲除载体。结果:扩增获得艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,菌落PCR及测序均表明成功构建了艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因的敲除载体。结论:成功构建了艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因CRISPR-Cas9敲除载体。 展开更多
关键词 艰难梭菌 CRISPR-Cas9 sigma-B因子 rsbW rsbV
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Cas9蛋白的克隆表达、分离纯化及多克隆抗体制备 预览
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作者 刘芳 卢婷 +5 位作者 蔡梦迪 吴芳草 陈相好 王彩霞 陈峥宏 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期757-761,766共6页
目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Ta... 目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Tag技术分离纯化Cas9蛋白;将纯化获得的Cas9蛋白免疫新西兰大白兔,制备Cas9蛋白多克隆抗体。结果:pET28a-Cas9重组表达载体转化的E.coliBL21(DE3)可表达Cas9蛋白,纯化的Cas9蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体效价>1∶256 K。结论:本研究获得了高质量Cas9蛋白及多克隆抗体,为后续CRISPR-Cas9基因编辑的应用奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 Cas9蛋白 蛋白表达与纯化 多克隆抗体
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幽门螺杆菌菌落PCR的优化 预览
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作者 刘芳 王彩霞 +4 位作者 綦廷娜 吴芳草 文学琴 陈峥宏 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期762-766,共5页
目的:通过对常规菌落PCR方法进行优化,探索提高幽门螺杆菌(H.pylori)菌落PCR扩增效率的方法。方法:提取H.pylori 26695基因组DNA作为阳性对照组,以未经任何处理的H.pylori 26695菌落作为阴性对照组,经煮沸裂解速冻法获得的H.pylori 2669... 目的:通过对常规菌落PCR方法进行优化,探索提高幽门螺杆菌(H.pylori)菌落PCR扩增效率的方法。方法:提取H.pylori 26695基因组DNA作为阳性对照组,以未经任何处理的H.pylori 26695菌落作为阴性对照组,经煮沸裂解速冻法获得的H.pylori 26695菌落作为试验组,随机选择8个不同的基因(16S rDNA、cagA-U、cagA-D、iceA、ureA、hetA、ropN、Hp0792)作为菌落PCR的候选基因进行菌落PCR验证,最后以1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果:在选择的目标基因中,阴性对照组未扩增出目的条带,试验组与阳性对照组均扩增出目的相应大小的条带;与常规菌落PCR比较,煮沸速冻裂解法能显著提高H.pylori菌落PCR的扩增效率。结论:煮沸速冻裂解法可用于H.pylori的高通量筛选鉴定和分子诊断。 展开更多
关键词 螺杆菌 幽门 高通量筛选 分子诊断技术 煮沸速冻裂解法 菌落PCR
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