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流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定 预览
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作者 杨振兴 +6 位作者 肖雷 朱建波 廖德芳 高林 李占鸿 杨恒 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期602-610,共9页
流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与... 流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 病毒分离鉴定 血清型 序列分析
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阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验 预览
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作者 苗海生 李乐 +6 位作者 廖德芳 寇美玲 朱建波 肖雷 杨恒 李华春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期371-375,共5页
为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡... 为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 阿卡斑病毒 CELISA 抗体检测
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我国蓝舌病病毒血清24型毒株的分离与遗传特征分析
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作者 杨恒 王金萍 +8 位作者 李乐 肖雷 寇美玲 廖德芳 何于雯 高林 李占鸿 李华春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期31-37,共7页
掌握云南省蓝舌病病毒(BTV)的活动情况与流行毒株的遗传特征。2012—2015年,在云南省的师宗县、江城县与芒市分别设立3个监控点,进行BTV的分离。自监控动物采集的BTV核酸阳性血液通过'鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞'接种的方式进行病... 掌握云南省蓝舌病病毒(BTV)的活动情况与流行毒株的遗传特征。2012—2015年,在云南省的师宗县、江城县与芒市分别设立3个监控点,进行BTV的分离。自监控动物采集的BTV核酸阳性血液通过'鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞'接种的方式进行病毒分离;采用RT-PCR与中和试验进行分离病毒的血清型鉴定;设计特异性引物对分离病毒的Seg-2、Seg-3、Seg-7与Seg-6基因节段进行RT-PCR扩增与克隆测序。2012—2015年,从云南省的师宗县、江城县与芒市分别分离获得3株BTV-24型毒株。分离病毒的Seg-2、Seg-3、Seg-7与Seg-6序列系统发育分析显示:我国毒株的Seg-2与BTV-24型参考毒株聚为一簇,而Seg-6与BTV-10型毒株聚为一簇;我国毒株的Seg-3在系统发生树上划分为'东方型'地域型,Seg-7在系统发生树上形成一个独立于其他地域型的分支。本试验报道了我国BTV-24型毒株的分离与Seg-2、Seg-3、Seg-6与Seg-7序列特征,结果表明,我国BTV-24型毒株的Seg-6基因节段与BTV-10型毒株发生了基因重配;Seg-7具有独特的遗传特征,形成了一个新的Seg-7地域型,暂定为'Chinese topotype'。本试验为进一步开展BTV-24型的流行病学、感染特性与疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 蓝舌病病毒血清24型 病毒分离 基因重配 地域型
中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定 被引量:1
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作者 李占鸿 肖雷 +6 位作者 寇美玲 宋建领 廖德芳 高林 杨恒 李华春 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期36-43,共8页
为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过“鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞”接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示... 为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过“鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞”接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 血清5型 分离 鉴定 序列分析 生物特性
云南黄牛血液中阿卡斑病毒的分离鉴定及S基因序列分析
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作者 李楠 +5 位作者 肖雷 何于雯 寇美玲 宋建领 牛保生 李华春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1703-1709,共7页
为了解阿卡斑病毒在云南师宗的流行情况及病毒的遗传特征,本研究在云南师宗设立哨兵动物,2014年5~11月每周1次连续采集血清、血液样品,血清用做AKAV抗体检测,血液在C6/36、BHK-21、MDBK和Vero细胞上进行病毒分离工作,用S基因特异引物对... 为了解阿卡斑病毒在云南师宗的流行情况及病毒的遗传特征,本研究在云南师宗设立哨兵动物,2014年5~11月每周1次连续采集血清、血液样品,血清用做AKAV抗体检测,血液在C6/36、BHK-21、MDBK和Vero细胞上进行病毒分离工作,用S基因特异引物对阳性分离物进行鉴定及序列分析。结果显示,15头哨兵动物共采集到28批420份血清、420份血液样品,其中有3头牛和1只羊感染AKAV,从这些样品中分离获得2株AKAV(编号09312D和09312H),它们在BHK-21和MDBK细胞上48 h产生明显CPE。2株新分离AKAV的S片段序列核苷酸同源性为100%,氨基酸同源性为100%,与所引用的9株其他不同地区分离的AKAV的S片段序列核苷酸同源性在83.8%~97.7%之间,氨基酸同源性在90.6%~99.6%之间,且新分离毒株处于同一进化小分支,具有高度亲缘性,形成了一个独立的次级分支,同时与其他2株中国AKAV分离株处于同一进化簇。结果表明,云南省师宗县为AKAV流行地区,病毒在当地活动频繁,新分离得到的2株病毒与其他AKAV毒株具有较高的核苷酸同源性和氨基酸同源性,提示亚洲太平洋地区AKAV病毒长期流行且关系密切,同时其氨基酸同源性高于核苷酸同源性也提示了AKAV S片段良好的氨基酸遗传稳定性。 展开更多
关键词 阿卡斑病毒 病毒分离 S基因 序列分析
牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定 被引量:2
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作者 李占鸿 肖雷 +5 位作者 杨振兴 廖德芳 高林 李华春 杨恒 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期112-120,共9页
我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012~2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监... 我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012~2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析。2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70~80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现"3-3-3"的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5%/98.5%与98.1%/99.8%,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型。本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础。 展开更多
关键词 流行性出血热病毒(EHDV) 分离 鉴定 序列分析
蓝舌病I型灭活疫苗免疫绵羊后中和试验和cELISA检出抗体的特点与关系 预览
7
作者 苗海生 李乐 +4 位作者 廖德芳 寇美玲 杨振兴 李华春 《中国动物检疫》 CAS 2019年第3期63-68,共6页
为比较蓝舌病病毒(BTV)cELISA和血清中和试验(SNT)检测方法的特点与关系,通过灭活、浓缩,制备抗原含量为1、5、10、50、100μg/mL的BTV-1型灭活疫苗。每个含量为1组,并设对照组,每组6只绵羊,分别在0、3周免疫。每周采血1次,共采血6次。... 为比较蓝舌病病毒(BTV)cELISA和血清中和试验(SNT)检测方法的特点与关系,通过灭活、浓缩,制备抗原含量为1、5、10、50、100μg/mL的BTV-1型灭活疫苗。每个含量为1组,并设对照组,每组6只绵羊,分别在0、3周免疫。每周采血1次,共采血6次。对所采血样分别用cELISA和SNT方法进行抗体检测。cELISA检测结果显示,免疫后第1周,抗体阳性率达到80.00%,第4周全部免疫羊转为抗体阳性,抗体产生较为迅速;SNT检测结果显示,中和抗体阳性率从免疫后第1周的6.67%持续上升至第3周的36.67%,至第4周达到70.00%,中和抗体产生持续而缓慢。随着时间延长,2种检测方法的符合率由23.33%增加到76.67%。当绵羊同时产生中和抗体和cELISA抗体时,中和抗体效价与cELISA抑制率间有显著的线性相关关系(r=0.63),相关方程为y=0.38+0.05χ。分析认为,中和抗体出现的时间之所以晚于cELISA抗体,可能是因为与宿主细胞识别并吸附的主要部位VP7蛋白位于病毒衣壳的中间位置,其主要表面抗原位点暴露需要时间。 展开更多
关键词 蓝舌病灭活疫苗 cELISA抗体 中和抗体
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流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立
8
作者 杨振兴 朱建波 +6 位作者 肖雷 高林 苗海生 何于雯 杨恒 李华春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期1-7,共7页
为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(ant... 为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值<1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均<10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 抗原捕获ELISA 多克隆抗体
内蒙古呼和浩特市摇蚊鉴定与COI基因序列分析 预览
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作者 元正菊 刘威 +3 位作者 李楠 何于雯 王静林 《云南畜牧兽医》 2019年第2期5-8,共4页
为了解内蒙古呼和浩特市摇蚊的分类鉴定与COI基因序列特征。2016年7月在内蒙古自治区呼和浩特市采集摇蚊标本,在体视显微镜下观察摇蚊形态学特征,同时提取虫体基因组DNA,用COI基因特异引物PCR扩增和序列测定,然后采用生物信息学软件进... 为了解内蒙古呼和浩特市摇蚊的分类鉴定与COI基因序列特征。2016年7月在内蒙古自治区呼和浩特市采集摇蚊标本,在体视显微镜下观察摇蚊形态学特征,同时提取虫体基因组DNA,用COI基因特异引物PCR扩增和序列测定,然后采用生物信息学软件进行核苷酸同源性和遗传进化分析。共采集摇蚊标本41只,其中雌蚊38只(92.68%)、雄蚊3只(7.32%)。9只摇蚊具有与Ch.riparius相似形态学特征,32只摇蚊具有与Ch.muratensis相似的形态学特征。序列分析结果显示3只摇蚊COI基因核苷酸同源性在83.3%~99.8%,其中HS1-1-1、HS1-1-2两只蚊虫与Ch.riparius位于同一进化分枝内,核苷酸同源性均为99.8%;HS1-3-2与Ch.muratensis位于同一进化分枝内,核苷酸同源性为99.6%。 展开更多
关键词 摇蚊 COI基因 分子鉴定
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云南省江城县中老越三国交界地区叮人蚋种类鉴定
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作者 白方 李钊 +6 位作者 元正菊 王娟 何于雯 李楠 徐勇 王静林 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第5期323-327,共5页
目的对中老越三国交界边境地区白天叮咬人,并引起严重皮炎的吸血蚋进行系统分类鉴定,明确其准确种类,为该地区防控相关疾病提供科学依据。方法 2019年5月6日下午17∶00在云南省江城县中老越三国交界边境地区河边采用人诱法采集吸血昆虫... 目的对中老越三国交界边境地区白天叮咬人,并引起严重皮炎的吸血蚋进行系统分类鉴定,明确其准确种类,为该地区防控相关疾病提供科学依据。方法 2019年5月6日下午17∶00在云南省江城县中老越三国交界边境地区河边采用人诱法采集吸血昆虫样本,采用无损伤昆虫形态的方法消化昆虫体表细胞,提取基因组DNA,PCR扩增昆虫COI基因,测序;分别采用Clustal X2.1、DNAStar(MegAlign)和Mega-X等生物信息学软件进行序列分析;同时对昆虫进行透明、脱水等处理,在显微镜下观察昆虫形态学特征。结果在云南省江城县中老越三国交界边境地区小河边采集到9只吸血蚋,它们叮咬人后都能引起严重皮炎症状。9只吸血蚋形态学鉴定结果显示,它们都具有:体色较黑,头额部较宽,两复眼分离,触角11节,口器短厚;翅宽阔,翅膜透明,翅上无鳞,翅脉发达,径分脉不分叉,无基室,翅径脉基段光裸;中胸盾片黑色,无纵条,中胸侧膜、下侧片光裸;腹部有一个球形受精囊,表面无饰纹等相似的形态学特征。但在生殖叉突,有8只蚋生殖叉突两臂末端膨大,有外突和内突,形成三叉头状;而另1只蚋生殖叉突两臂末端不膨大,具有外突,并骨化。分子鉴定结果显示,9只蚋位于两个进化分支内,其中8只蚋与S. nodosum(节蚋)处于相同进化分支,核苷酸同源性最高(97.3%~100%);而另一只与S. siripoomense处于相同进化分支,核苷酸同源性最高(96.8%~98.5%)。结论江城县存在S. nodosum和S. siripoomense两种白天叮咬人并引起严重皮炎的吸血蚋,其中S. nodosum为优势种群,S. siripoomense为国内首次报道。 展开更多
关键词 叮咬 皮炎 细胞色素氧化酶Ⅰ基因
内蒙古土默特左旗和阿拉善左旗伊蚊形态学与分子生物学鉴定
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作者 元正菊 刘威 +3 位作者 何于雯 李楠 王静林 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第2期93-96,共4页
目的了解内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗和阿拉善盟阿拉善左旗地区伊蚊的分子分类及COI基因序列特征。方法 2016年7月在内蒙古呼和浩特市土默特左旗与芳牛场、阿拉善盟阿拉善左旗哈图陶勒盖羊场采集蚊虫样本,提取蚊虫基因组DNA,用CO... 目的了解内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗和阿拉善盟阿拉善左旗地区伊蚊的分子分类及COI基因序列特征。方法 2016年7月在内蒙古呼和浩特市土默特左旗与芳牛场、阿拉善盟阿拉善左旗哈图陶勒盖羊场采集蚊虫样本,提取蚊虫基因组DNA,用COI基因特异性引物扩增并测序,采用生物信息学软件进行核苷酸同源性和遗传进化分析。结果共采集蚊虫样本119只,其中雄蚊58只(48.74%),雌蚊61只(51.26%)。背点骚扰蚊4只(3.36%)、刺扰伊蚊12只(10.08%)、里海伊蚊6只(5.04%)、淡色库蚊57只(47.90%)、其他蚊种40只(33.61%)。6只伊蚊序列分析结果显示,2只蚊虫(YF1和YF4)位于背点伊蚊Oc.dorsalis进化分支内,核苷酸同源性分别是98.15%、98.34%;2只(HT9和HT10)位于里海伊蚊Oc.caspius进化分支内,核苷酸同源性分别是99.09%、98.90%;2只(YF3和YF7)与伊状蚊亚属Aedimorphus刺扰伊蚊Ae.vexans位于同一进化分支内,核苷酸同源性分别是97.92%、97.66%。结论采用形态学和分子生物学方法系统鉴定了内蒙古土默特左旗和阿拉善左旗采集的背点骚扰蚊、刺扰伊蚊、里海伊蚊,提示内蒙古这两个地区至少存在背点骚扰蚊、刺扰伊蚊、里海伊蚊等3种伊蚊,为这些地区伊蚊及伊蚊传播疾病的研究和防控提供科学依据。 展开更多
关键词 背点骚扰蚊 刺扰伊蚊 里海伊蚊 COI基因 分子鉴定
云南边境地区埃蠓属一新种形态学和分子生物学鉴定
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作者 元正菊 白方 +5 位作者 李钊 何于雯 李楠 张娜西 王静林 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第1期29-32,共4页
目的采用形态学和分子生物学方法对在中国-老挝-越南三国交界地区采集蠓虫样本中的1种埃蠓进行系统分类鉴定。方法 2018年5月在云南省江城县中老越三国交界地区采集蠓虫样本,提取蠓虫基因组DNA,分别采用ITS-1基因和COⅠ基因特异引物进行... 目的采用形态学和分子生物学方法对在中国-老挝-越南三国交界地区采集蠓虫样本中的1种埃蠓进行系统分类鉴定。方法 2018年5月在云南省江城县中老越三国交界地区采集蠓虫样本,提取蠓虫基因组DNA,分别采用ITS-1基因和COⅠ基因特异引物进行PCR扩增、序列测定。采用Clustal X2.1软件、DNAStar软件和Mega 7.0进行序列分析;同时对蠓虫进行压片,在体视显微镜下观察形态学特征,并计算AR、HR、PR、CR和TR1、TR2、TR3等数值。结果江城采集到的1只雌性蠓虫具有两复眼相连、无毛、复眼间有一额鬃;触角15节,触须5节,第3节中部膨大有1小圆形感觉器窝;唇片鬃左右各2根,大颚端部有齿7枚,第5齿钝小。翅有2个发达径室,径2室和径1室长度之比值2.069,除翅基淡斑外,有9个淡斑,中2脉(M2)中部两侧淡斑相连,翅沿中脉有5个暗斑,除端部小暗斑外,其余4块均覆及径脉,径中横脉处暗斑扩延至翅后缘。中脉基部泡状膨大,被暗斑覆盖,第2径室(2R2)端部1/2和基部1/6被浅色暗斑覆盖。后足跗节1~3节各有1个端刺。腹部有2个球形受精囊,略不等大,有颈,另有1退化小囊等形态学特征。遗传进化分析结果显示:在ITS-1基因构建系统进化树上,江城县采集的蠓虫与环纹埃蠓形成一个进化分支,核苷酸同源性在92%~93%之间,而与其他蠓虫核苷酸同源性均低于81%;在COⅠ基因构建的系统进化树上,江城采集的蠓虫位于独立进化分支内,与其他蠓虫核苷酸同源性均低于84%。结论形态学和分子生物学鉴定结果均提示江城采集的这只蠓虫为埃蠓属1新种,丰富了我国蠓虫种类资源。 展开更多
关键词 埃蠓 边境 细胞色素氧化酶I基因 间隔区-1基因 分子鉴定 形态学鉴定
2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析 预览 被引量:3
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作者 杨恒 肖雷 +7 位作者 李占鸿 杨振兴 吕敏娜 林栩慧 廖德芳 牛保生 李华春 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期761-770,共10页
旨在从牛、羊监控动物群中,对流行于我国的帕利亚姆血清群病毒(PALV)进行分离、鉴定与序列特征分析,明确我国流行毒株与国外毒株之间的关系。自监控动物采集的PALV阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;对所分离PALV毒株的Seg-7与Seg-... 旨在从牛、羊监控动物群中,对流行于我国的帕利亚姆血清群病毒(PALV)进行分离、鉴定与序列特征分析,明确我国流行毒株与国外毒株之间的关系。自监控动物采集的PALV阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;对所分离PALV毒株的Seg-7与Seg-2基因节段进行扩增、测序与序列分析;通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析不同血清型PALV代表毒株基因组的"电泳带型"特征;通过免疫荧光与中和试验分析不同血清型PALV的阳性血清之间的交叉反应特性与中和活性。试验结果如下:2012—2016年,在云南、广西、广东共计分离出19株PALV;Seg-2与Seg-7测序与系统发育分析显示,分离毒株分属Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)与Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型,不同血清型毒株均与日本毒株具有最近的亲缘关系,而与澳洲、非洲毒株亲缘关系较远。病毒基因组电泳结果显示PALV基因组呈现"3-3-4"的电泳带型特征。免疫荧光结果显示针对CHUV的多克隆抗体可使感染CHUV、DAV与BCV的BHK-21细胞呈现特异性荧光。血清学中和试验显示,CHUV、DAV与BCV三种病毒的阳性血清之间无交叉中和保护作用。本研究报道了2012—2016年中国PALV的分离与Seg-2、Seg-7序列特征,并首次报道了PALV的DAV与BCV两种血清型病毒在我国的分离,研究结果将有助于掌握我国PALV的分布与遗传特征,为诊断试剂的开发、流行病学调查与致病性研究提供科学依据。 展开更多
关键词 帕利亚姆血清群病毒 病毒分离 病毒鉴定 血清型 序列分析 交叉中和保护
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云南省师宗县牛羊蓝舌病病毒感染情况及活动规律监测 预览
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作者 何于雯 +4 位作者 肖雷 李楠 宋建领 王静林 李华春 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期537-541,共5页
目的研究蓝舌病病毒近几年在云南省师宗县的感染情况及活动规律。方法 2014-2016年连续3年在师宗县设置监控点,每年选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5-10月每周采血1次,11月、12月,每月采血1次,每次每头动物采集常规全... 目的研究蓝舌病病毒近几年在云南省师宗县的感染情况及活动规律。方法 2014-2016年连续3年在师宗县设置监控点,每年选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5-10月每周采血1次,11月、12月,每月采血1次,每次每头动物采集常规全血、肝素抗凝血各1份,用于蓝舌病抗体检测和病毒分离。结果 2014-2016年均有动物感染蓝舌病病毒,平均感染率为35.56%,感染时间均在6-10月之间,这一结果表明蓝舌病病毒感染动物主要集中在每年的6-10月,这一时期应加强蓝舌病的防控。在蓝舌病监测中,45只监控动物中的16只感染了蓝舌病病毒,并从7只感染动物中分离出9株蓝舌病病毒,分别为BTV-2、-4、-9、-12、-16型,其中BTV-16型4株,为优势血清型。结论病毒分离和鉴定结果表明,师宗县长期存在多种血清型蓝舌病病毒。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 监控动物 感染率 血清型
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蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性研究 预览
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作者 何于雯 高林 +2 位作者 李楠 李华春 《上海畜牧兽医通讯》 2018年第1期6-8,11共4页
[摘要]为研究蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性,本实验将BT弘16型毒株接种在BHK-21、Vero、C6/36传代细胞系及山羊肾原代细胞,通过细胞敏感性试验、病毒感染生长曲线以及qRT—PCR方法检测BT弘16型毒株在上述不同细胞中的复... [摘要]为研究蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性,本实验将BT弘16型毒株接种在BHK-21、Vero、C6/36传代细胞系及山羊肾原代细胞,通过细胞敏感性试验、病毒感染生长曲线以及qRT—PCR方法检测BT弘16型毒株在上述不同细胞中的复制效率和增殖情况。试验结果表明,BTV-16型毒株在BHK-21、Vero、c6/36及山羊肾原代细胞中均能增殖,但产生CPE的时间及病毒滴度有所差异。病毒在BHK-21、Vero细胞上病变较快,山羊肾原代细胞次之,C6/36细胞病变不明显。从病毒滴度和核酸检测结果来看,病毒在BHK-21细胞中的增殖效率与Vero细胞基本一致,并且病毒在这两种细胞中的增殖效率明显高于在山羊肾原代细胞和C6/36细胞。本试验为蓝舌病病毒分离、抗原制备、致病性以及反向遗传学研究提供了细胞学研究基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒16型 细胞 增殖 特性研究
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流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立 预览 被引量:6
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作者 朱建波 杨振兴 +6 位作者 肖雷 高林 苗海生 何于雯 杨恒 李华春 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1440-1450,共11页
为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。... 为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为5.12μg·mL^-1(1∶10 000),竞争抗体最佳稀释倍数为1∶10 000;通过对各270份阴性和阳性的牛、羊血清检测,确定该检测方法临界值为50%;特异性试验表明该ELISA方法仅能检测出不同血清型EHDV抗体,具有较好的群特异性;对已知抗体效价的阳性血清检测表明,建立的C-ELISA方法敏感性好于血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGID);分别用C-ELISA、SNT、RTPCR和病毒分离试验对监控动物采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其他3种方法检测结果对应一致。结果表明本研究建立的C-ELISA为EHDV抗体的检测提供了一种快速、敏感、稳定的方法。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 多克隆抗体 竞争ELISA
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2013—2016年云南省江城县牛羊蓝舌病血清流行病学调查 预览 被引量:1
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作者 寇美玲 苗海生 +5 位作者 杨恒 李乐 李楠 廖德芳 李华春 《中国动物检疫》 CAS 2018年第12期5-9,共5页
为了解近年来云南省江城县蓝舌病病毒(BTV)的感染和流行情况,从2013年5月至2016年4月连续3年在江城县设立监控动物群,每年选择BTV病原及抗体检测阴性牛10头、羊5只作为哨兵动物,用于BTV抗体监测和病毒分离。应用BTVC-ELISA抗体检测试剂... 为了解近年来云南省江城县蓝舌病病毒(BTV)的感染和流行情况,从2013年5月至2016年4月连续3年在江城县设立监控动物群,每年选择BTV病原及抗体检测阴性牛10头、羊5只作为哨兵动物,用于BTV抗体监测和病毒分离。应用BTVC-ELISA抗体检测试剂盒,对哨兵动物进行血清抗体检测,应用鸡胚、C6/36细胞和BHK-21细胞进行病毒分离。结果显示:连续3年的哨兵动物BTV抗体阳性率分别为40.35%、44.08%、50.65%;3年内共分离到45株BTV,包括1~5型、15~16型、21型和24型共9种血清型。结果表明,江城县蓝舌病流行有逐年加重趋势,且呈现多种血清型毒株交叉感染状况,亟需加大BTV监测力度,及时发现毒株变化。 展开更多
关键词 蓝舌病 血清学调查 抗体阳性率 血清型 哨兵动物
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蓝舌病自然感染病毒核酸、抗体转阳和病毒分离相关性研究
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作者 李楠 +4 位作者 肖雷 苗海生 高林 宋建领 李华春 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2017年第9期41-44,288共5页
为了提高蓝舌病病毒(BaW)的分离效率,2015年在师宗县设置监控点,选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5—10月份每周采血1次,每次每头动物分别采集常规全血、EDTA抗凝血和肝素抗凝血各1份,检测蓝舌病抗体、蓝舌病病... 为了提高蓝舌病病毒(BaW)的分离效率,2015年在师宗县设置监控点,选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5—10月份每周采血1次,每次每头动物分别采集常规全血、EDTA抗凝血和肝素抗凝血各1份,检测蓝舌病抗体、蓝舌病病毒核酸并进行病毒分离。结果表明:蓝舌病痛毒核酸阳性可以持续4~5周,蓝舌病抗体阳性可以持续5~6周。BTV核酸开始转为阳性到核酸转阳后的第1周和第2周采集的肝素抗凝血,或者蓝舌病抗体转阳前1周到蓝舌病抗体转阳和蓝舌病抗体转阳后1周采集的肝素抗凝血BTV分离效果最佳。说明通过蓝舌病抗体检测或蓝舌病病毒核酸检测确定分离蓝舌病病毒最佳分离时间是可行的。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 自然感染 核酸检测 抗体检测 病毒分离
云南蓝舌病病毒1型毒株M6基因序列分析 预览 被引量:5
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作者 李楠 朱建波 +5 位作者 肖雷 李乐 杨恒 何于雯 李华春 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期340-347,共8页
为了解云南蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1(Y863、SZ120169、6-12和7-12)RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测... 为了解云南蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1(Y863、SZ120169、6-12和7-12)RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测序,采用生物信息学软件对获得的M6基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析。结果表明,分别获得4株云南分离株BTV-1 M6基因1 763bp序列;4株云南分离株BTV-1核苷酸同源性在95.2%-99.9%之间,氨基酸同源性在97.6%-99.8%之间,1979年师宗分离的Y863病毒毒株与2012年师宗(SZ120169)、2013年江城(6-12、7-12)分离的3株病毒毒株核苷酸同源性分别为95.5%、95.2%和95.2%,氨基酸同源性分别为97.6%、98.4%和98.2%,而近两年(2012、2013)分离病毒核苷酸和氨基酸同源性较高,分别在96.9%-99.9%和99.1%-99.8%之间;遗传进化分析发现,4株云南分离株BTV-1为Eastern基因群病毒,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%-99.9%和97.6%-99.8%;进一步分析发现4株云南分离株BTV-1与希腊及澳大利亚BTV-1型毒株亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.4%-95.6%和95.1%-99.1%,而与地中海国家(意大利、法国、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯)和南非毒株关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别在83.8%和95.7%以下。4株云南分离株BTV-1属于Eastern基因群病毒,云南分离株BTV-1 M6基因在自然进化中发生遗传变异缓慢,该基因可以用来进行BTV-1基因群分布及毒株的地理区域来源相关的研究。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 M6基因 序列分析
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云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定 预览 被引量:10
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作者 肖雷 +6 位作者 李楠 高林 何于雯 杨恒 胡骑 李华春 朱建波 《中国动物传染病学报》 CAS 2014年第4期1-6,共6页
为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5-10月,每周采血1次,11-12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳... 为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5-10月,每周采血1次,11-12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性,至11月,监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2-13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚,收获鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后,出现细胞病变(cytopathic effect, CPE)。采用RT-PCR方法,针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物,扩增其相应片段。结果显示,共分离到86份疑似分离物,其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增,均扩增出1156 bp片段,初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验,67份毒株为蓝舌病病毒,与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现,BTV-1株序列与同型Y863(登录号:KC879616)参考毒株的同源性为92%,BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株,分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 分离 鉴定
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