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东南亚地区寨卡病毒的流行及结构蛋白分子进化特征分析
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作者 林垚 洪珊 +1 位作者 蓝青萍 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第9期958-964,共7页
目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在东南亚地区的感染传播情况,探讨其分子水平上的进化特征。方法用关键词和主题词检索ZIKV在东南亚地区暴发感染流行情况。在GenBank中获取ZIKV东南亚病毒株全基因序列,采用BIOEDIT软件进行比对;利用M... 目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在东南亚地区的感染传播情况,探讨其分子水平上的进化特征。方法用关键词和主题词检索ZIKV在东南亚地区暴发感染流行情况。在GenBank中获取ZIKV东南亚病毒株全基因序列,采用BIOEDIT软件进行比对;利用MEGA 7. 0软件绘制系统进化树;将结构蛋白核苷酸翻译获得其相应的氨基酸序列,分析突变情况;统计不同株型间结构蛋白核苷酸突变和氨基酸替代位点;预测包膜蛋白第三结构域(envelop domainⅢ,ED-Ⅲ)的二级结构。结果 ZIKV在东南亚国家均有血清学感染或回顾性检测阳性报道,其中越南、泰国和新加坡ZIKV感染病例较多,疾病负担较为严重。系统进化树表明,东南亚ZIKV株均属于亚洲型,2016年新加坡株(序列号:KY241788)与2015年巴西株亲缘关系最近,1966年分离的马来西亚株与其他东南亚株亲缘关系较远。东南亚ZIKV各株型间衣壳蛋白(capsid protein,C)的碱基突变点为22处,突变率为6. 36%,造成非同义氨基酸突变点为19处,突变率为16. 52%。前膜蛋白(pre-membrane protein,prM)的碱基突变点为51处,突变率为10. 12%,造成非同义氨基酸突变点为37处,突变率为22. 02%。包膜蛋白(envelope protein,E)的碱基突变点为141处,突变率为9. 33%,造成非同义氨基酸突变点为101处,突变率为20. 04%。ED-Ⅲ二级结构预测结果显示,在该区域2株代表株有相同数量的蛋白结合位点,代表株2(1966 Malaysia KX377336)存在1个蛋白结合位点富集区(ED-Ⅲ:55-63),而代表株1(2014 Thailand KU681081)蛋白结合位点分布较均匀,代表株2的ED-Ⅲ存在1个二硫键,而代表株1不存在,代表株1(ED-Ⅲ:79-80)存在1个解螺旋,而代表株2不存在。结论通过病例统计分析、系统发育分析、蛋白质核苷酸及氨基酸序列比较分析、ED-Ⅲ二级结构预测,为研究东南亚地区ZIKV不同株型间的生物学和流行致病性差异提供参考。 展开更多
关键词 寨卡病毒 东南亚 流行 结构蛋白 分子特征
Ⅲ型登革病毒在C6/36及Vero细胞中复制对其毒力的影响
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作者 林垚 洪珊 +3 位作者 王晓丹 陈俊英 潘玥 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第10期1070-1073,1079共5页
目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,... 目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,PCR扩增获得传代毒种全长基因序列,并与原代病毒基因序列进行比对。结果DV3-1在C6/36细胞上传代至第17代次(P17-C6/36)时毒力保持稳定,DV3-2在盲传过程中均未见明显的细胞病变;将DV3-1和DV3-2第17代次病毒在Vero细胞上继续传代,DV3-1传至第10代次(P10-Vero)CPE为40%,DV3-2传至第4代次CPE达30%。DV3-1在P17-C6/36时具有较高的病毒拷贝数,在P0(原代病毒)及P10-Vero时病毒拷贝数偏低。与P0比较,P17-C6/36及P10-Vero全长碱基共16处发生突变,导致12个氨基酸的非同义突变,其中P0和P10-Vero在第5826、6251、7907位点碱基相同,P17-C6/36相应的氨基酸位点(第1942、2084、2636位点)均发生非同义突变。结论传代细胞更换可对Ⅲ型DENV的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为后续DENV减毒策略的研究提供了实验依据。 展开更多
关键词 Ⅲ型登革病毒 C6/36细胞 VERO细胞 毒力
登革病毒1型Ⅰ~Ⅴ基因亚型的基因组差异分析
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作者 文送娇 陈曦 +8 位作者 洪珊 席珏敏 王晓丹 陈俊英 潘玥 叶超 管娇琼 林垚 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期152-156,共5页
目的分析登革病毒1型(Dengue virus type 1,DENV-1)Ⅰ~Ⅴ基因亚型基因组全长核苷酸及氨基酸序列差异。方法通过GenBank搜索DENV-1 5个不同基因亚型的全长基因组序列,获得其相应的氨基酸序列。采用BIOEDIT软件,统计基因亚型间核苷酸突变... 目的分析登革病毒1型(Dengue virus type 1,DENV-1)Ⅰ~Ⅴ基因亚型基因组全长核苷酸及氨基酸序列差异。方法通过GenBank搜索DENV-1 5个不同基因亚型的全长基因组序列,获得其相应的氨基酸序列。采用BIOEDIT软件,统计基因亚型间核苷酸突变和氨基酸替代位点,分析其相似度,通过RNA二级结构在线预测网站预测DENV-1不同亚型间3′UTR的二级结构差异,蛋白结构在线预测网站预测主要流行于中国的Ⅰ及ⅤDENV-1基因亚型结构蛋白的二级结构,对其氨基酸组成及编码序列中可能存在的蛋白结合区域等进行差异分析。结果DENV-1 5个基因亚型核苷酸相似性为91. 40%~94. 50%,氨基酸序列相似性为97. 11%~98. 38%,5个基因亚型各自编码3 392个氨基酸,其中共有195个位点有氨基酸的变化。DENV-1不同亚型的3′UTR的二级结构各不相同。DENV-1基因型为Ⅰ、Ⅴ的775个氨基酸中占组成比例最多的均是苏氨酸(T),Ⅰ型可能的蛋白结合位点有26个,多聚核苷酸结合位点有9个。Ⅴ型可能的蛋白结合位点有24个,多聚核苷酸结合位点有7个。他们均有相同数量的螺旋和跨膜螺旋。结论通过对DENV-1 5个不同的基因亚型的全长核苷酸和氨基酸序列的比较分析,及Ⅰ、Ⅴ基因亚型结构蛋白二级结构的预测,为研究DENV-1不同基因型之间的生物学和致病性差异提供参考。 展开更多
关键词 登革病毒1型 基因亚型 基因组 结构蛋白 二级结构
登革病毒Ⅰ型拷贝数标准质粒和检测体系的建立及其应用
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作者 林垚 洪珊 +7 位作者 文送娇 席珏敏 王晓丹 陈俊英 潘玥 叶超 管娇琼 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期76-79,共4页
目的建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应... 目的建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及检测体系对3份2017年云南西双版纳DENV-Ⅰ患者的血清进行检测。结果经双酶切及测序鉴定,DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒构建正确。实时荧光定量PCR得到的标准曲线方程为y=-0.300 5 x+12.133,R~2=0.991 9。3份血清样品原液的病毒拷贝数分别为9 417 703.12、21 949 591.01及19 027 096.91 copies/μL。结论成功建立了DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒及其检测体系,且准确性较好,灵敏度较高,可用于血清样品中DENV-Ⅰ拷贝数的检测。 展开更多
关键词 登革病毒Ⅰ型 病毒拷贝数 标准质粒
二磷酸氯喹对THP-1细胞增殖及凋亡的影响
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作者 洪珊 杨佳佳 +3 位作者 文送娇 林垚 叶超 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第4期386-389,共4页
目的探讨不同浓度二磷酸氯喹对急性单核细胞性白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法分别用10、20、40、80、100μmol/L氯喹处理THP-1细胞,分别于处理12、24、48和72 h收集细胞,MTS法检测细胞增殖情况,同时采用Hoechst33342荧光染色法... 目的探讨不同浓度二磷酸氯喹对急性单核细胞性白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法分别用10、20、40、80、100μmol/L氯喹处理THP-1细胞,分别于处理12、24、48和72 h收集细胞,MTS法检测细胞增殖情况,同时采用Hoechst33342荧光染色法及流式细胞仪检测二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡的影响。结果处理细胞12、24 h时,10、20、40、80、100μmol/L二磷酸氯喹对细胞增殖无明显影响,各组间差异无统计学意义(P>0.05);处理细胞48、72 h时,各浓度二磷酸氯喹对细胞增殖均有抑制作用,细胞活力均明显下降,各组间差异有统计学意义(P<0.01),并具有剂量依赖性。不同浓度二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡均具有诱导作用,且随着浓度的增加,细胞凋亡愈加明显。结论二磷酸氯喹在体外可抑制THP-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其作用具有剂量依赖性。 展开更多
关键词 二磷酸氯喹 THP-1细胞 细胞增殖 细胞凋亡
缺氧诱导GLC-82、A549肺癌细胞的microRNAs差异表达谱分析
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作者 王莹 唐春 +2 位作者 李静林 邱丽娟 孙强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期891-897,共7页
目的:对比缺氧环境下不同肺腺癌细胞株表达差异的microRNA,为进一步研究缺氧环境中肺癌细胞microRNA的作用机制提供参考。方法:建立缺氧模型,将培养于缺氧情况中及正常氧浓度下的GLC-82、A549细胞分别提取RNA,通过芯片检测及PCR验证,筛... 目的:对比缺氧环境下不同肺腺癌细胞株表达差异的microRNA,为进一步研究缺氧环境中肺癌细胞microRNA的作用机制提供参考。方法:建立缺氧模型,将培养于缺氧情况中及正常氧浓度下的GLC-82、A549细胞分别提取RNA,通过芯片检测及PCR验证,筛选差异表达的microRNA。利用TargetScanHuman 7.2数据库和cytoscape软件预测差异显著的microRNA分子调控的靶基因及可能参与的信号通路。结果:在缺氧条件下,A549细胞中3个microRNA表达上调,30个microRNA表达下调;而在GLC-82细胞中,2个microRNA表达上调,31个microRNA表达下调。两种细胞相比较,除miR-192-5p变化趋势相反外,其他microRNAs的表达变化趋势相同。通过KOBAS在线网站KEGG及GO预测分析,差异表达microRNA主要参与了肿瘤相关信号通路、胰岛素信号通路、Ras信号通路以及氧代谢等生物学过程。结论:肺癌细胞株在缺氧环境下和正常氧状态下mircoRNA出现表达差异,并且来源于不同遗传背景的细胞株之间也存在差异。差异表达的microRNA靶基因参与了多种细胞代谢相关通路,具有氧代谢,氧应答相关功能。 展开更多
关键词 肺癌 肿瘤微环境 缺氧 微小核糖核酸
甲醇诱导条件对登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区表达的影响
7
作者 席珏敏 陈俊英 +4 位作者 李多 邱丽娟 潘玥 王晓丹 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期144-146,151共4页
目的探讨甲醇诱导浓度和诱导时间对登革病毒(dengue virus,DENV)四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区(envelope domainⅢ,EDⅢ)表达的影响,以期实现该蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法采用不同浓度甲醇(0. 05%、0. 1%、0. 25%、0. 5%、0. 75%、1%... 目的探讨甲醇诱导浓度和诱导时间对登革病毒(dengue virus,DENV)四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区(envelope domainⅢ,EDⅢ)表达的影响,以期实现该蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法采用不同浓度甲醇(0. 05%、0. 1%、0. 25%、0. 5%、0. 75%、1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%、5%、7. 5%)诱导表达带His标签的DENV四型联合重组EDⅢ蛋白,分别诱导18、24、30、48、72 h,样品经Western blot检测。最佳条件下诱导表达的蛋白液经Ni-Agarose His亲和层析纯化后,进行10%SDS-PAGE检测。结果最佳甲醇诱导浓度为2. 5%,最佳甲醇诱导时间为72 h。纯化产物经10%SDS-PAGE检测,于相对分子质量约41 000处可见单一目的蛋白条带,纯度为99%。结论当甲醇浓度为2. 5%,诱导时间为72 h时,可实现DENV四型联合重组EDⅢ蛋白在毕赤酵母中的高效表达。 展开更多
关键词 甲醇 登革病毒 包膜蛋白Ⅲ区 毕赤酵母
一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 黄蓉 蒋鸿超 +4 位作者 李小曼 王美芬 孙强 张桢 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第5期575-578,共4页
目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,... 目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10-3的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP6基因 实时荧光定量PCR 基因拷贝数
寨卡病毒亚洲型与非洲型基因同源性及重组分析 被引量:1
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作者 林垚 文送娇 +6 位作者 洪珊 王晓丹 席珏敏 陈俊英 潘玥 叶超 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第12期1317-1321,共5页
目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)亚洲型与非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、前膜蛋白(pre-membrane,pr M)核苷酸和氨基酸序列差异,并探讨了ZIKV亚洲型和非洲型位点突变可能产生的后果。方法在GenBank中登录的ZIKV亚洲型和... 目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)亚洲型与非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、前膜蛋白(pre-membrane,pr M)核苷酸和氨基酸序列差异,并探讨了ZIKV亚洲型和非洲型位点突变可能产生的后果。方法在GenBank中登录的ZIKV亚洲型和非洲型序列中,分别选择5个不同的全长基因组序列,并获得其相应的氨基酸序列,采用BIOEDIT软件进行比对,分析相似度,统计不同型别间结构蛋白C、prM的核苷酸突变和氨基酸替代位点,并采用SimPlot软件分析两个型别间的同源重组。结果 ZIKV亚洲型与非洲型的核苷酸相似性在88. 00%~89. 00%之间;不同型别的结构蛋白C和prM碱基的突变比较显示,C基因共有19个碱基突变,prM基因共有48个碱基突变;氨基酸翻译比对显示,这67个碱基突变均为有效突变。两个型别结构蛋白C和prM编码的289个氨基酸中,占组成比例最多的均为亮氨酸(L),同源重组分析亚洲型与非洲型一致性较高,无重组信号。结论通过对ZIKV亚洲型与非洲型的结构蛋白C、pr M核苷酸序列、氨基酸的比较分析及同源重组分析,为研究ZIKV不同基因型间的生物学和致病性差异提供参考。 展开更多
关键词 寨卡病毒 亚洲型 非洲型 C蛋白 前膜蛋白 氨基酸序列
Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响
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作者 姜黎 杨佳佳 +3 位作者 罗佳 叶超 文送娇 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第2期125-128,共4页
目的探讨Ⅱ型登革病毒(denguevirusⅡ,DENVlI)前膜(presynapticmembrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4-1/16384)的DENVⅡanti-prM单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(M01分别为3、0... 目的探讨Ⅱ型登革病毒(denguevirusⅡ,DENVlI)前膜(presynapticmembrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4-1/16384)的DENVⅡanti-prM单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(M01分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度prM抗体可抑制DENV11在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。 展开更多
关键词 Ⅱ型登革病毒 前膜 抗体 THP-1细胞 复制能力
甲型肝炎疫苗免疫效果影响因素的分析 被引量:2
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作者 罗佳 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第11期1283-1285,1289共4页
甲型肝炎疫苗以其卓越的免疫原性、安全性及免疫持久性,被公认为预防甲型肝炎流行的重要措施。绝大多数人接种甲型肝炎疫苗后均能产生很好的保护效果,但不同人群的反应并不均一,呈多样性。出现上述情况的原因复杂,影响因素众多。掌握有... 甲型肝炎疫苗以其卓越的免疫原性、安全性及免疫持久性,被公认为预防甲型肝炎流行的重要措施。绝大多数人接种甲型肝炎疫苗后均能产生很好的保护效果,但不同人群的反应并不均一,呈多样性。出现上述情况的原因复杂,影响因素众多。掌握有关影响因素对实现接种的群体化或个体化,使不同群体获得成功免疫具有重大意义。基于此,本文从甲型肝炎疫苗类型、佐剂、免疫接种对象个体差异、疾病因素、免疫策略等方面,对甲型肝炎疫苗免疫效果的影响因素作一综述。 展开更多
关键词 甲型肝炎疫苗 免疫效果 佐剂 影响因素
2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析
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作者 文送娇 林垚 +7 位作者 席珏敏 王晓丹 陈俊英 潘玥 叶超 管娇琼 洪姗 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第5期456-461,共6页
目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比... 目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1及DENVⅠ标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析。应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共分离获得16株DENVⅠ的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M。16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变。16株分离株与2011-China Donggua(JQ048541.1)、2008-Singapore(GU370049.2)、2014-Taiwan(KU365900.1)、2005-China Fujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia(KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-South Korea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系。结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENVⅠ,可能属于东南亚国家的输入性毒株。 展开更多
关键词 登革病毒 NS1基因 基因突变 系统进化分析
CpG ODN佐剂序列IMB-AC5的体外免疫刺激活性分析 被引量:1
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作者 赵玉娇 蔡路奎 +6 位作者 王晓丹 席珏敏 陈俊英 潘玥 邱丽娟 姜黎 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期34-37,共4页
目的对CpG ODN候选佐剂IMB-AC5进行体外免疫刺激活性分析。方法以目前国外进入临床研究的两种CpG ODN佐剂序列(Coley 7909和Dynavax ISS1018)为对照,采用~3H-TDR法检测IMB-AC5刺激人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL... 目的对CpG ODN候选佐剂IMB-AC5进行体外免疫刺激活性分析。方法以目前国外进入临床研究的两种CpG ODN佐剂序列(Coley 7909和Dynavax ISS1018)为对照,采用~3H-TDR法检测IMB-AC5刺激人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)的增殖活性;流式细胞术分析CD19+B活化细胞表面CD69表达水平;ELISA法检测刺激后GEN细胞产生的IL-6和IFNα水平。结果 3种CpG ODN佐剂均能明显刺激人PBLs的增生,IMB-AC5刺激增生能力优于Dynavax ISS1018,略低于Coley 7909;IMB-AC5活化CD19+B细胞表面CD69表达水平与Coley7909相似,Dynavax ISS1018活化效果略低于前二者;3种CpG ODN佐剂体外活化树突状细胞水平差异较大,且呈明显的剂量依赖,IMB-AC5的最佳活化浓度范围为0.15~1.5μmol/L,Coley 7909的最佳活化浓度范围为〈0.25μmol/L,活化效果均优于Dynavax ISS1018。结论 IMB-AC5可作为有效的疫苗候选佐剂,且不低于国外同类佐剂的体外免疫刺激活性。 展开更多
关键词 CPG ODN 佐剂 免疫刺激活性
Ⅰ-Ⅳ登革病毒基因同源性分析及Ⅱ型C蛋白二级结构预测 预览 被引量:1
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作者 姜黎 杨佳佳 +3 位作者 罗佳 叶超 文送娇 孙强 《医学研究杂志》 2017年第6期38-40,67共4页
目的对登革病毒(denguevirus,DENV)Ⅰ-Ⅳ基因同源性进行分析,同时对DENVⅡC蛋白的二级结构进行预测,为更深入了解DENV4个血清型间差异及衣壳蛋白c构想。方法通过DNAMAN分子生物学分析软件和蛋白结构在线预测网站分别对登革病毒基... 目的对登革病毒(denguevirus,DENV)Ⅰ-Ⅳ基因同源性进行分析,同时对DENVⅡC蛋白的二级结构进行预测,为更深入了解DENV4个血清型间差异及衣壳蛋白c构想。方法通过DNAMAN分子生物学分析软件和蛋白结构在线预测网站分别对登革病毒基因同源性及c蛋白的二级结构进行预测。结果在登革病毒基因组同源性中,DENVI与Ⅲ同源性最高为72%,发现DENVI与Ⅳ同源性最低为67%;在登革病毒基因中,前膜基因prM的的同源性最高为82.5%,非结构基因NS2a的同源性最低为55.28%。在编码capsid的氨基酸中,占组成比例最多的为是精氨酸,可能存在的蛋白结合位点较多。结论通过基因组同源分析图谱看出Ⅰ-ⅣDENV在结构基因(C、prM、E)之间和非结构基因NSl,NS2b和NS3中的同源性较高,同时蛋白二级结构预测发现DENVⅡC蛋白可能具有分子识别和蛋白骨架等功能。 展开更多
关键词 登革病毒 同源性 CAPSID
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Ⅲ型登革病毒在THP-1细胞上的ADE模型建立 预览
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作者 姜黎 杨佳佳 +3 位作者 罗佳 叶超 文送娇 孙强 《生命科学研究》 CAS CSCD 2017年第5期429-432,共4页
登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF... 登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合症(dengue shock syndrome,DSS)等重症的主要原因。采用不同稀释度的Ⅱ型登革病毒prM前膜抗体与分离自云南西双版纳重症病人的Ⅲ型登革病毒复合感染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR发现亚中和浓度prM前膜抗体诱发THP-1细胞液中更高浓度的病毒载量。在THP-1细胞系上的研究可为后续研究登革病毒ADE打下坚实的基础。 展开更多
关键词 登革病毒(DENV) 登革热(DF) 抗体依赖增强感染(ADE) THP-1细胞 体外感染模型
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登革病毒感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞CPE的比较及病毒检测 被引量:1
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作者 杨佳佳 姜黎 +3 位作者 罗佳 叶超 文送娇 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期362-365,371共5页
目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-2... 目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒。结果C6/36细胞对DV最敏感并有明显的病变,细胞几乎100%聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE。PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV。结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存在较大差异。 展开更多
关键词 登革病毒 细胞病变 C6/36细胞 Vero细胞 BHK-21细胞 THP-1细胞
CpG ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性分析
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作者 赵玉娇 蔡路奎 +6 位作者 王晓丹 席珏敏 陈俊英 潘玥 邱丽娟 姜黎 孙强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第7期681-685,共5页
目的评价Cp G ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性,以评估IMB-AC5佐剂的应用前景。方法利用市售的单铝佐剂乙型肝炎疫苗,根据相同配比加入3种Cp G ODN(IMB-AC5及Coley 7909和Dynavax 1018),作为实验组(V-AC5、V-7909和V-1... 目的评价Cp G ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性,以评估IMB-AC5佐剂的应用前景。方法利用市售的单铝佐剂乙型肝炎疫苗,根据相同配比加入3种Cp G ODN(IMB-AC5及Coley 7909和Dynavax 1018),作为实验组(V-AC5、V-7909和V-1018),并以乙型肝炎疫苗为对照组,分别免疫BALB/c小鼠,于免疫后2、4、6、8周,经尾静脉采血,第10周处死小鼠采集全血,分离血清,采用乙肝表面抗体试剂盒检测anti-HBs抗体水平,ELISA法检测Ig G1/2a亚型抗体比例;ELISPOT法检测小鼠脾细胞IFNγ表达水平。结果免疫后0~4周内,各组小鼠血清抗体水平均无明显变化,第6周开始呈明显上升趋势,至第8周后趋于平缓;各实验组抗体水平均明显高于对照组(P〈0.05),V-AC5显示出与V-7909同样良好的体液免疫效果,略优于V-1018。免疫后各实验组小鼠血清中Ig G2a/Ig G1比例明显高于对照组。各实验组小鼠脾细胞斑点数明显高于对照组(P〈0.05);V-AC5斑点数介于其他两个实验组之间。结论 IMB-AC5佐剂能显著活化B细胞产生抗体并具有刺激细胞免疫的效果,可增强疫苗的免疫原性。 展开更多
关键词 CPG ODN 佐剂 乙型肝炎疫苗 免疫原性
登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定
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作者 邱丽娟 赵玉娇 +6 位作者 李多 黄新伟 王晓丹 席珏敏 潘玥 陈俊英 孙强 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-6,共6页
登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或... 登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。 展开更多
关键词 登革病毒 包膜EDⅢ蛋白 疫苗 重组蛋白
CpG ODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究 预览 被引量:1
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作者 赵玉娇 蔡路奎 +6 位作者 王晓丹 席珏敏 陈俊英 潘玥 邱丽娟 姜黎 孙强 《医学研究杂志》 2016年第5期37-42,共6页
目的设计和筛选对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂。方法根据具有免疫刺激活性的CpGODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰。分选健康人P... 目的设计和筛选对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂。方法根据具有免疫刺激活性的CpGODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰。分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpGODN进行体外刺激,MTT法检测CpGODN诱导细胞增殖水平。随后将筛选出的有效CpGODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性。结果在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB—AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近。综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂。同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50%~65%,此外其部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性,最高同源性达62%。证明筛选出的新型CpGODN佐剂IMB—AC5安全性较高。结论设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列IMB—AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础。 展开更多
关键词 CPG ODN 佐剂 免疫刺激活性 同源性
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埃博拉病毒包膜糖蛋白的密码子偏爱性分析 预览 被引量:2
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作者 赵玉娇 黄新伟 +2 位作者 李多 邱丽娟 孙强 《医学研究杂志》 2015年第3期31-37,共7页
目的 对从2014年西非埃博拉暴发地区感染者分离的4个埃博拉病毒株基因组包膜糖蛋白编码基因进行密码子偏爱性分析,为埃博拉病毒包膜蛋白基因表达中宿主系统选择和密码子优化提供参考.方法 通过GeneBank搜索近期公布的分离自西非地区的4... 目的 对从2014年西非埃博拉暴发地区感染者分离的4个埃博拉病毒株基因组包膜糖蛋白编码基因进行密码子偏爱性分析,为埃博拉病毒包膜蛋白基因表达中宿主系统选择和密码子优化提供参考.方法 通过GeneBank搜索近期公布的分离自西非地区的4个埃博拉病毒株全基因组序列,获得编码包膜糖蛋白GP1和GP2的基因序列及蛋白编码序列.采用EM-BOSS在线预测埃博拉病毒包膜糖蛋白的密码子偏爱性,并通过与Codon Usage Database中大肠杆菌、酵母及人的密码子使用频率进行比较,筛选最适埃博拉病毒GP蛋白体外表达的宿主物种,并提供相应密码子优化方案.结果 埃博拉病毒基因组、GP1和GP2的Nc值均在57左右,CAI值均在0.7左右,表明其密码子偏爱性较均一,且基因的表达水平相对较高;编码GP1蛋白F、H、M、N、W等氨基酸和GP2蛋白D、K、N、Q、Y等氨基酸中不同密码子使用频率有较大差异;GP1和GP2蛋白密码子偏爱性有共同之处也存在明显差异.计算σGP/E.coli、σGP/Yeast、σGP/Human的比值,结果显示GP1中>2.0或<0.5的数量分别为24、20和19个;GP2中的数量分别为26、30和19,表明埃博拉病毒GP1和GP2蛋白与人的密码子使用频率较为接近.结论 以密码子偏爱性分析作为辅助手段,分析出此次流行于西非的埃博拉病毒包膜糖蛋白的密码子偏爱性及最适表达物种及密码子优化方案,为体外表达GP1和GP2蛋白,从而研发埃博拉病毒检测试剂、亚单位疫苗及基因工程抗体提供参考. 展开更多
关键词 埃博拉病毒 包膜糖蛋白 密码子偏爱性
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