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棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达
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作者 苏伟 赵洁 +2 位作者 刘宁 尼加提·迪里木拉提 刘小宁 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期522-529,共8页
为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导... 为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。 展开更多
关键词 棉铃虫 脂肪酸结合蛋白 原核表达 时空表达 2-十三烷酮
棉铃虫叉头框蛋白A类似蛋白基因HarmFoxAl的克隆及表达谱分析 预览
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作者 赵洁 魏倩 +1 位作者 苏伟 刘小宁 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期672-684,共13页
【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生... 【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生长发育的调控通路提供依据。【方法】从棉铃虫幼虫中肠中扩增得到HarmFoxAl的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HarmFoxAl的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌Escherichia coli Transetta菌株,IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并利用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白。通过qPCR检测棉铃虫不同发育阶段(1-6龄幼虫和预蛹),6龄幼虫不同组织(脂肪体、中肠、体壁和头部)以及10 mg/g 2-十三烷酮处理6龄幼虫不同时间后中肠中HarmFoxAl的表达谱。【结果】HarmFoxAl(GenBank登录号:XM021331806)的开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为25.03 kD和6.34。氨基酸序列分析表明,HarmFoxAl单体蛋白无信号肽、跨膜区和二硫键,核心区域是由4个α螺旋和3个β折叠组成的球状结构。将重组的Transetta (pET32a-HarmFoxAl)菌株用0.5 mmol/L IPTG在25℃条件下诱导5 h,约45 kD的融合蛋白His-HarmFoxAl能以可溶的形式存在于重组菌中,这与预测的分子量(42.8 kD)相一致。发育阶段特异性表达谱表明,HarmFoxAl在棉铃虫1-3龄幼虫期、6龄幼虫期和预蛹期均有表达,且预蛹期的表达量最高。组织表达谱结果表明,该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠和体壁中表达,且脂肪体内的表达量最高,而在头部中不表达。10 mg/g 2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠中HarmFoxAl的表达量显著降低,但随着时间延长其表达量逐渐升高,处理48 h后表达量显著高于对照。【结论】棉铃虫HarmFoxAl在预蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理幼虫后HarmFoxAl的表达量急速降低后逐渐升高,推测 展开更多
关键词 棉铃虫 叉头框蛋白 原核表达 时空表达 2-十三烷酮
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棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析 预览 被引量:1
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作者 赵洁 苏伟 +3 位作者 刘宁 艾新宇 马纪 刘小宁 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第8期1493-1503,共11页
【目的】克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的c DNA序列,分析Ha PEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内Ha PEBP的变化情况,为... 【目的】克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的c DNA序列,分析Ha PEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内Ha PEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到Ha PEBP的c DNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将Ha PEBP的ORF序列连接至p ET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中Ha PEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的变化规律。【结果】获得的Ha PEBP c DNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 k D和5.93。氨基酸序列分析表明Ha PEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-p ET32a-Ha PEBP重组菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 k D的融合蛋白His-Ha PEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L-1的咪唑洗涤两次后得到约40 k D的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μL-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。Ha PEBP在棉铃虫幼虫的1—6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内Ha PEBP的表达量均 展开更多
关键词 棉铃虫 磷脂酰乙醇胺结合蛋白 原核表达 时空表达 2-十三烷酮
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棉铃虫乙醇脱氢酶的表达规律 预览
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作者 赵洁 苏伟 +1 位作者 马纪 刘小宁 《新疆大学学报:自然科学版》 北大核心 2017年第3期267-272,352共7页
乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种在醇类代谢途径中起重要作用的脱氢还原酶.为了深入了解ADH对棉铃虫CYP6B6的调控,基于酵母单杂交的实验结果,采用RT-PCR的方法从六龄幼虫的中肠cDNA中扩增得到棉铃虫乙醇脱氢酶5(HaADH5... 乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种在醇类代谢途径中起重要作用的脱氢还原酶.为了深入了解ADH对棉铃虫CYP6B6的调控,基于酵母单杂交的实验结果,采用RT-PCR的方法从六龄幼虫的中肠cDNA中扩增得到棉铃虫乙醇脱氢酶5(HaADH5),构建重组菌株BL21-p ET32a-HaADH5,IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,实时定量PCR检测棉铃虫不同发育阶段和组织中HaADH5的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下六龄幼虫中肠组织内HaADH5的变化规律.结果表明,克隆得到的HaADH5大小为1 002 bp,编码334个氨基酸,预测的蛋白质分子量和等电点分别是36.5k D和6.55.氨基酸序列分析表明HaADH5蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HaADH5在大肠杆菌BL21中主要以可溶蛋白形式存在,Western blot结果显示融合蛋白His-HaADH5的大小与预期一致且纯度较高.HaADH5在棉铃虫的所有组织中都表达且中肠内表达量最高,在幼虫的所有龄期都表达且预蛹期的表达量最高.2-十三烷酮处理后HaADH5的表达量降低,且10 mg/g处理组中HaADH5和CYP6B6随着时间的延长表达规律相一致.本文将为后续利用HaADH5作为分子标记来研究棉铃虫蜕皮和变态发育过程奠定基础. 展开更多
关键词 乙醇脱氢酶 棉铃虫 表达纯化 2-十三烷酮
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